第三章放射性示踪的标记技术.ppt
现在学习的是第1页，共50页 天然放射性核素，半衰期比较长，比活度较低，分布分散而且品种有限。人工放射性核素，可用核反应堆、加速器和核素发生器生产，其原始状态通常都是无机盐类。例如Ba14CO3，NaH232PO4，45CaCl2，59FeCl314C、3H、32P、35S和125I等作示踪原子，并且要把它们做成与体内物质相应的有机化合物而开展示踪研究。现在学习的是第2页，共50页 凡是分子中某一原子或某些原子（或基团）被放射性核素或稳定核素所取代，而成为一类易被识别的化合物，则称之为标记化合物。现在学习的是第3页，共50页1同位素标记化合物（isotopic labeled compound）化合物中某元素的稳定同位素原子被同一元素的放射性同位素或稳定同位素原子取代，取代前后的化合物在理化性质上完全相同（同位素效应除外），这类标记称为同位素标记（isotopic labeling）。2非同位素标记化合物（nonisotopic labeled compound）该类标记化合物是用化学性质相似或根本不同的放射性核素取代原化合物中所含的某元素的稳定核素原子。这种标记称非同位素标记（nonisotopic labeling）。现在学习的是第4页，共50页 有机标记化合物的命名，通常先指出标记位置，再列出标记核素，最后是化合物的名称，如 l-14C-醋酸。无机标记化合物命名，通常在化合物的前面注明放射性核素，也可把标记核素直接写在分子式内，如125I-碘化钠（125I-NaI）或Na125I。现在学习的是第5页，共50页 l.定位标记S（specific labeling）它是指放射性核素只局限于标记化合物分子中某一特定的位置上，而在其他位置上的同种原子就不具有放射性。常用“S”表示，如1-14C（S）-乙酸或1-14C-乙酸，表示第1位碳原子被放射性14C标记。2.准定位标记n（nominal labeling）在3H标记中，理论上应获得预期的定位标记分子，实际上，3H在预期位置上的分布，有时低于化合物中3H总量的95，或百分比值不详。此类标记称准定位标记，用“n”表示。这是一种名义上的定位标记，因此，也称名义定位标记。现在学习的是第6页，共50页3.均匀标记U（uniform labeling）是一种非定位标记（non-specific labeling），常用于14C标记的化合物中。它是指整个分子中某元素所有的原子均可能被放射性同位素取代，取代的几率是相等的，而且放射性原子在分子中的分布是均匀的，达到统计学上的均一性。4.全标记G（general labeling）它是指化合物中某种原子不管在什么位置上都可能是带放射性的。全标记主要用于3H标记的化合物，在化合物分子中，任何有氢元素的位置上，都可能被氚所取代。但是由于各个氢原子在分子中的位置不同，在标记制备过程中被氚取代的几率不同，不具有统计学上的均一性，因而全标记的化合物往往是全而不均的。现在学习的是第7页，共50页 5.双标记或多标记（double labeling or multiple labeling）在生物学示踪实验中，有时需要在化合物分子中引入两种或两种以上元素的同位素，或引入一种元素的两种或两种以上的同位素原子，这种标记化合物称为双标记或多标记化合物。例如15NH214CHCOOH（氨基乙酸）现在学习的是第8页，共50页 1标记核素的选择（1）合适的核性质：射线；半衰期；比活度；（2）得到的产物与被示踪化合物性质应尽量接近；（3）标记方便，标记的化合物稳定 现在学习的是第9页，共50页 2核素标记的要求：（1）放射性核素标记率应尽量高，未标记的核素应注意回收利用。（2）放射性核素标记需用微量或超微量方法进行标记、纯化和鉴定。（3）尽量减少放射性核素的稀释，避免加入不必要的载体；（4）最好用同位素标记。如使用非同位素标记，则标记位置应以不影响标记分子的特定功能为佳；（5）标记过程应简单、快速。最好在标记的最后阶段加入核素，以减少损失和污染；有条件时，在标记前作冷实验，以取得经验。现在学习的是第10页，共50页1化学合成标记法（chemical synthesis）此方法是通过化学反应将放射性核素引入化合物中。换言之，就是将放射性核素的初始原料，通过选定的工艺步骤，合成所需要的标记化合物。此法不仅比活度高，而且能够定位标记，但合成步骤较多。14C、3H和放射性碘标记化合物常用此法进行合成标记。这类标记化合物已广泛用于药理、代谢和分子的化学结构等方面的研究。对于需要制备的标记化合物来说，当然是已知结构的物质。现在学习的是第11页，共50页 注意以下几个问题：（1）必须注意操作量与比活度的关系 对生物学示踪实验来说，使用的标记化合物的量愈少，愈接近于生物体的正常生理状态。但另一方面，示踪物质进入生物体以后，要受到大量正常物质的稀释，需要使用的标记化合物的比活度愈高愈好。现在学习的是第12页，共50页（2）必须有较高的反应产物。因为有机反应常常伴随许多副反应产物。较高的反应产物一方面使原料的利用率高，更主要的是减少了样品中的放射性杂质。（3）标记化合物必须在完全密封的系统内有机合成 因为所有的标记化合物的合成都要从简单的放射性无机盐类开始，大部分中间产物都是低分子量的放射性气体或者挥发性液体，为了安全防护和防止物料损失，一般反应要在“真空线中”进行。现在学习的是第13页，共50页 同位素交换标记法是利用同一元素的放射性核素与化合物中的非放射性核素之间的交换反应来制备所需要的标记化合物。该方法操作快速、简便。在放射性核素半衰期短、化学合成步骤多的情况下，该方法的实用意义更大。适用于大量有机化合物、天然产物或难以制得前体的标记化合物的制备，是制备3H标记化合物的重要方法。同位素交换法包括酶促合成法、催化交换法和气体曝射法。现在学习的是第14页，共50页（1）酶促合成法 在酶的催化下，可以合成某些特殊的标记化合物，例如-32P-ATP的合成常用此法。反应机理是利用非放射性的腺苷三磷酸在3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的催化下，使腺苷三磷酸位上的磷酸与磷-32标记的无机磷酸盐之间进行同位素交换反应。现在学习的是第15页，共50页（2）催化交换法 常用于氚标记化合物的制备。将欲标记的有机化合物和催化剂（常用PdO-BaSO4或者Pd-C）置于溶剂中，通入氚气，室温搅拌数小时后竟分离纯化后即可得氚标记的化合物。此法可制备氚标记的氨基酸、嘌呤类核苷和核苷酸、激素等。液相的催化交换法是将待标记物溶解在氚水（3H2O）中，用钯、铂作催化剂，在一定pH值和温度下，置特定的真空系统里进行氢和氚的交换反应。现在学习的是第16页，共50页（3）气体曝射法 将需要标记的有机化合物置于比活度很高的氚气中，密封放置几天至几星期，使氚气中的氚与有机化合物中的氢原子发生交换反应而制得氚标记化合物。可用高频放电、微波、紫外线、射线照射等促使氚气电离，或者在反应中加贵金属作催化剂，使交换标记过程加速。现在学习的是第17页，共50页 该方法是利用酶、微生物、动植物的生理代谢过程，引入放射性核素合成有机化合物。特别是对目前尚不能用人工方法合成的有机化合物，如某些激素、蛋白质、抗生素、核酸、维生素等，可用生物合成法制备。生物合成法比化学合成法容易，能够从自然界直接获得有生物活性的异构体。生物合成的缺点是产额低，标记位置不易控制，易造成类似标记物，增加了标记的分离和提纯的难度。生物合成法可分为两类：全生物合成法和酶促合成法（enzymatic synthesis method）。现在学习的是第18页，共50页（1）全生物合成法 它是利用完整的生物或其某一个器官的生理代谢过程来进行标记。如生物合成氨基酸、糖和核酸均为全生物合成。常用的生物有细菌、藻类、酵母等低等生物，它们容易在实验室中培育，代谢旺盛，繁殖迅速，因而制备效率高。现在学习的是第19页，共50页（2）酶促合成法 它是利用生物组织中某种特定的酶，促进标记前体物质的合成反应，生成所需的标记产物。在酶的催化下，可将放射性核素结合到生物分子上。该方法合成的标记化合物很多是具有旋光性的异构体，产物不必经过分离。因此，酶促合成法也可看作是应用特殊催化剂的化学合成法。例如，应用3H、32P、35S等核素标记的核苷酸类就属于酶促合成法。现在学习的是第20页，共50页1放射性碳的标记化合物生物医学中用得最多的是14C和11C。14C半衰期为5730年,半衰期长，能保证连续实验，又不需要进行放射性衰变校正。只发射-粒子（0.159MeV），用液闪测量很方便；外照射较弱，易防护；用于自显影时，影像清晰；14C标记化合物的放射性比活度可高达2308.8MBq毫克原子，丰度可达100（商品达80以上）；14C可定位标记，纯化方便。与3H相比，14C标记化合物辐射自分解速度低；由于构成物质的CC键比较牢固，标记化合物中的14C原子也比较稳定。现在学习的是第21页，共50页 由反应堆生产的14C为Ba14CO3，放射性碳的标记常从最简单的化合物（如11CO2或Ba 14CO3）为原料，先制备出一批基本的“钥匙”化合物，然后逐步合成得到更复杂的所需的产品。14C标记化合物制备工艺复杂，要求设备条件高和防护措施全。一般放射性实验室从事14C标记有一定的困难。14C标记化合物的制备方法，基本上分为化学合成法、生物合成法和辐射合成法三类。现在学习的是第22页，共50页 以Ba 14CO3为起始物制备14C的标记化合物可通过以下三条途径：通过14CO2合成 通过14C氰化钠（Na14CN）合成 通过14CH14CH合成 现在学习的是第23页，共50页 将某一植物放在充满14CO2的密闭室里，用强光照射时，叶子进行光合作用。几个小时以后，叶子中已合成了标记的葡萄糖、淀粉和其他化学成分。如果植物的量足够多，根据需要可进行分离提取，有些标记的药物就是这样制备出来的。用这种生物合成的方法，可以准确地制备某种具有生理活性的旋光异构体。现在学习的是第24页，共50页在生物学示踪实验中，氚的重要性仅次于14C。氚标记化合物有许多突出的特点：（1）氚的半衰期为12.35a，故有充裕的时间制备标记化合物和从事示踪研究。（2）氚的比活度高，可达1077.44GBq毫克分子，比较容易获得高比活度的标记化合物。并可借助核磁共振仪鉴定3H在标记物中的标记结构。（3）氚为弱-辐射体（Emax=18.4keV），射线能量低，射程短，操作时易于防护，在放射自显影中具有很好的分辨率。（4）氚的丰度高，标记化合物的制备方法较14C容易。一些难以用14C标记的化合物，如肽类、蛋白质等，常可用3H标记。此外，还能作为碳骨架结构的示踪剂，这点是14C所不及的。现在学习的是第25页，共50页 氚标记化合物的缺点是碳-氚键的结合不够牢固，有时会发生丢失；分子中氚标记的位置不易准确估计；氚标记的化合物比相同比活度的14C标记的化合物因受辐射而分解的程度严重的多。氚标记的化合物的用途较广，用化学合成法、同位素交换法和生物合成法均可制备。现在学习的是第26页，共50页氚标记的原始原料是氚气和氚水。以氚气（T2）为原料，通常对氚的丰度和比活度要求很高，一般有催化法、氚卤置换和还原法三种。氚特别适于标记比较复杂的化合物，例如酶、蛋白质和药物等。将待标记化合物研成粉末，放在管子里，通入高活性的氚气。当氚气与有机化合物密切接触时，大量的射线足以使C-H键断裂，形成不稳定的中间产物，可以与氚结合形成新的C-T键，于是经过取代反应氚就进入待标记化合物的分子中。以氚水（T2 O）为原料。现在学习的是第27页，共50页利用细胞离体培养法可以制备比活度较高的标记核酸。分子生物学的核酸标记方法，是利用酶促反应将3H标记的NTP或dNTP通过DNA合成反应参入到核酸分子的内部，或通过酶促将其连接到核酸分子两端。现在学习的是第28页，共50页化学合成法:一般先将放射性碘离子氧化成分子碘（2Na*I+H2O22NaOH+*I2）或者一氯化碘，然后利用有机化合物很易发生碘代反应的特点，制备碘标记的化合物。氧化反应通常使用的氧化剂有H2O2，ICl和氯胺-T等。现在学习的是第29页，共50页 原理:大多数有机化合物分子中并没有碘原子，但由于碘原子具有高度的化学活性，所以放射性碘很容易通过置换法取代肽链上酪氨酸苯环的氢原子而得到碘标记的化合物。碘标记率与被标记的蛋白质、多肽类激素分子中酪氨酸的含量及暴露程度有关。放射性碘有131I、125I、123I、124I等，其中125I和131I是生物医学中最常用的放射性核素。现在学习的是第30页，共50页 放射性比活度高，可提高分析的灵敏度；它们的半衰期不短也不长，很适于生物样品的测量；特别是125I能放出均匀的射线，便于体外进行计数测量，易于推广。放射免疫测定法多半使用碘标记的化合物，可用碘-125放免仪进行测量。123I和124I标记化合物主要用于核医学临床功能检查，131I用于甲状腺疾病和各种肿瘤的治疗，125I标记化合物则主要用于生物医学研究与体外示踪分析。现在学习的是第31页，共50页 1.氯胺氯胺-T（Ch-T）法）法 氯胺-T是一种较温和的氧化剂，在水溶液中形成次氯酸，能连续不断地将溶液中的碘离子I-氧化为分子态的碘*I2或*I+，在pH为7.5的环境里能与蛋白质的酪氨酸残基上羟基邻位的氢原子发生置换反应，制得碘标记物。现在学习的是第32页，共50页 2.乳过氧化物酶法乳过氧化物酶法 用乳过氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）催化过氧化氢（H2O2）释放出活泼的新生态氧，使125I离子活化并标记在蛋白质酪氨酸残基上的一种标记方法。以标记蛋白质为例，LPO与H2O2首先形成络合物，将放射性碘负离子氧化成碘分子，在LPO的催化下，将蛋白质碘化。此类酶催化反应速度很快，标记物比活度高，又保持其生物活性和免疫活性。特别适用于一些容易失活的多肽类的标记，如血纤维蛋白原、胰岛素、嘧啶、核苷和组氨酸等小分子化合物。现在学习的是第33页，共50页 3.固相氧化剂法固相氧化剂法 包括Iodogen标记法和Iodo Beads标记法两种。Iodogen（1，3，4，6-tetrachloro-3-6-diphenlglycoluril,氯甘脲）不溶于水，能溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂。Iodogen在碘标记过程中起催化作用，使用时毋须新鲜配制，催化反应终止时不需加还原剂。Iodogen和Ch-T同属于氯酰胺碘化反应类型，是一种不溶于水的固相氧化剂，能将放射性碘负离子氧化成碘分子，从而与蛋白质或多肽分子中酪氨酸残基上羟基邻位的氢原子发生置换反应。该法已用于单克隆抗体、多肽、生物膜和活细胞的碘标记。现在学习的是第34页，共50页 3.固相氧化剂法固相氧化剂法 Iodogen标记法不与蛋白质密切接触，反应过程中的氧化损伤小，反应时间易控制，碘利用率高于Ch-T法，利用Iodogen不溶于水的特点，可直接对培养细胞进行碘标记，方法简便。现在学习的是第35页，共50页 4.联接标记法（联接标记法（conjugational labeling）这是一种间接标记方法。先使放射性碘与联接剂相结合，然后碘标记的联接剂再结合到蛋白质或多肽分子上，成为标记化合物。最常用的联接剂是3-（对-羟基苯）丙酸-N琥珀亚胺酯酰化剂（HPNS，即BoltonHunter试剂）。基本原理是：在Ch-T作用下，先用Na125I使酰化剂HPNS碘化。然后在弱碱性条件下，125I-HPNS通过一个酰氨键与蛋白质N末端的氨基联结，制得蛋白质标记物。此法适用于缺乏酪氨酸的蛋白质如卵清蛋白、肌红蛋白的标记。现在学习的是第36页，共50页 一、32P-核苷酸标记技术 磷和硫是核酸和蛋白质本身所含有的元素。32P标记的核苷酸类是基因工程研究中不可缺少的标记化合物，如用于DNA序列测定；35S-胱氨酸和35S-蛋氨酸用于研究蛋白质代谢过程，它们均为生物医学中不可缺少的试剂。32P及35S 均发射-射线，32P（T1/2=14.3d，Emax=1.71MeV）和35S(T1/2=87d，Emax=0.167MeV)标记物的制备主要有化学合成、生物合成、酶促法和同位素交换法等。两种核素比较，35S能量低，不需特殊防护，电泳自显影条带清晰，分辨率高。而32P则因射线能量较高，实验中应加必要的防护 现在学习的是第37页，共50页-32P-ATP（32P-三磷酸腺苷）和-32P-dATP的标记通常用酶促法。方法见书.现在学习的是第38页，共50页 胸腺嘧啶核苷的氚标记通常用生物合成法得到,即以甲基-3H-胸腺嘧啶作为前体，在脱氧核糖转移酶的催化作用下，生成甲基-3H-胸腺嘧啶核苷。氚标记的胸腺嘧啶核苷（tritiated thymidine，3H-TdR）可有效结合到DNA中，因此在体外细胞培养中可使细胞被标记，主要用于淋巴细胞的免疫功能测定、细胞转化、分裂、和增殖以及分子遗传等研究。现在学习的是第39页，共50页 方法见书。四、核酸的体外碘标记四、核酸的体外碘标记 标记原理：加热把DNA解析成单链，在三氯化铊（TlCl3）氧化作用下，使125I原子与胞嘧啶环上5位碳原子以稳定的共价键相结合，而形成5-碘胞嘧啶。现在学习的是第40页，共50页 1.检验合成的标记化合物是否与原来设计的化合物相符，特别是标记原子是否在预定的位置上；2.检验标记化合物中是否有杂质以及杂质含量有多少。现在学习的是第41页，共50页 各种方法得到的标记化合物都含有一定量的杂质，放存一段时间的标记化合物也会出现分解产物，所以在使用前必须分离纯化。常用的纯化方法：沉淀法、萃取法、离子交换分离法和层析分离法等。现在学习的是第42页，共50页 1放射性核素纯度（radionuclide purity）指标记化合物所需要放射性核素的活度占样品中各种核素总放射性活度的百分比，计算公式如下：一般要求标记化合物的放射性核素纯度应在98以上。常用检查方法有两种：（1）半衰期测定法，适用半衰期短的核素，一般跟踪时间为35个半衰期；（2）射线能量测定法，利用各种放射性核素固有的能谱，测定放射性核素的纯度。现在学习的是第43页，共50页 2标记率（标记率（labeling efficiency）指所标记的物质（有可能包括一种以上的化学形态）放射性活度占样品中总放射性活度的百分比。3.放射化学纯度（放射化学纯度（radiochemical purity）指某一特定化学形态的标记物活度占总放射指某一特定化学形态的标记物活度占总放射性活度的百分比。放射化学纯度一般应达到性活度的百分比。放射化学纯度一般应达到95以上方可使用。以上方可使用。现在学习的是第44页，共50页 标记率和放射化学纯度的检查方法标记率和放射化学纯度的检查方法 有放射性层析法，包括电泳、薄层色谱、纸色谱以及高效液相色谱法等，有时也用放射性核素稀释法和放射自显影法。最简单的是纸色谱%100样品的总放射性活度标记物的放射性活度标记率%100样品的总放射性活度标记物的放射性活度标记率%100样品的总放射性活度活度特定化学形态的放射性放射化学纯度现在学习的是第45页，共50页 4放射性比活度（放射性比活度（specific activity）简称比活度，是指单位质量物质所含放射性活度。用 MBq/mmol或GBq/mmol（旧单位：mCi/mmol或Ci/mmol）表示。测定方法：直接测定计算法；层析扫描面积计算法等。现在学习的是第46页，共50页 5生物学鉴定生物学鉴定 包括生物活性和免疫活性等测定。如果放射性核素标记的是生物活性物质，如蛋白质、细胞等，经过标记后可能丧失部分活性，影响使用，因此它们的活性鉴定很重要。方法：受体的生物活性可通过受体和配基结合率测定，免疫活性可通过抗体和抗原结合率测定。如果标记化合物进入体内，则还需根据进入体内的途径，如口服、静脉注射等，进行相关项目的检测。现在学习的是第47页，共50页 辐射自分解常分为三类：1.初级内部自分解初级内部自分解：即标记化合物由于放射性标记原子的核衰变而引起的原子组成变化或化学键断裂。这类分解作用是放射性核素固有的物理特性，无法人为地控制和防止。2.初级外辐射分解初级外辐射分解：即放射性标记原子发射的射线直接作用于化合物分子，引起分子化合链断裂，造成化合物分解。这类外辐射分解作用与标记化合物的浓度有关。现在学习的是第48页，共50页 3.次级辐射分解：放射性标记化合物或其周围介质的分子，由于射线与物质相互作用而产生一系列活性游离基团，如 H，OH，HO2等，这些活性基因又与标记化合物分子相互作用，使得化合物分解。次级辐射分解作用对3H和14C标记化合物更重要。现在学习的是第49页，共50页 辐射自分解主要与标记化合物吸收射线能量的效率、标记化合物的浓度和比活度有关。一般情况下，当化合物的比活度超过了20mCi/mmol时，辐射分解就变得显著起来。辐射分解还与放射性原子以及它周围的原子在标记物分子中的位置有关。现在学习的是第50页，共50页
