DB 37T 4030 苹果品种鉴定方法　微卫星方法.doc

ICS07.080B 30/39DB37山东省地方标准DB37/T 40302020苹果品种鉴定方法微卫星方法Molecule identification method for apple strain2020 - 07 - 09发布2020 - 08 - 09实施山东省市场监督管理局发布DB37/T 40302020前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由青岛海关提出、归口并组织实施。本标准起草单位：青岛海关技术中心、临沂大学、中国农业科学院果树研究所、中国科学院海洋研究所。本标准主要起草人：高宏伟、刘云国、陈新疆、王强、王鸿霞、陈盛盛、孙雯娴、孙敏、魏晓棠。本标准系首次发布。7苹果品种鉴定方法微卫星方法1 范围本标准规定了苹果品种的分子鉴定方法。本标准适用于由苹果的种苗、砧木、枝叶、果实等组织鉴定苹果品种。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则NY/T 24242013植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南苹果3 术语和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 品种cultivar在一定的生态和经济条件下，经自然或人工选择形成的动、植物群体。在植物学里，品种是在植物界的22个分类等级之下，具有相对的遗传稳定性和生物学及经济学上的一致性，并可以用普通的繁殖方法保持其恒久性。 3.1.2PCR多聚酶链式反应polymerase chain reaction以拟扩增的DNA分子为模板，以末端互补的寡核苷酸片段为引物（primer），在耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA分子合成。重复这一过程，即可使目的DNA片段得以大量扩增。是常规分子生物学技术之一，用于扩增特定的DNA片段。3.1.3基因座位（或位点）genetic locus基因在染色体上占有的特定位置叫基因位点。3.1.4微卫星序列microsatellite又称为短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)或简单重复序列（simple sequence repeats），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由26个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星位点通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。3.1.5等位基因allele指位于一对同源染色体相同位置上控制同一性状不同形态的基因。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（base pair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene Dia mine Tetraacetic Acid）Tris：三羟甲基氨基甲烷（2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol）4 原理不同苹果品种间SSR基因座位的等位基因存在序列长度多态性，即苹果品种间微卫星序列（SSR）依苹果品种不同，等位变异的数量可能不同。针对特定SSR两侧序列高度保守的核酸序列，设计序列特异性引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，并对PCR扩增引物进行硝酸银染色或者荧光染料标记定量区分片段大小（bp），根据该等位变异的扩增片段大小鉴定苹果品种，在苹果品种鉴定的数据库中进行比对，从而鉴定苹果品种。5 设备和材料5.1 设备5.1.1 天平：感量0.01 g。5.1.2 均质器。5.1.3 水浴锅（0 100 ，感量0.1 ）。5.1.4 振荡器。5.1.5 研钵或其他粉碎装置。5.1.6 高速台式冷冻离心机。5.1.7 梯度PCR仪。5.1.8 微量可调移液器及配套吸头（50 L、100 L、200 L）。5.1.9 微量离心管（1.5 mL和2 mL）。5.1.10 毛细管电泳仪或者DNA分析仪。5.2 试剂5.2.1 CTAB提取缓冲液：55 mmol/L CTAB，1 400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用10 % 盐酸调pH至8.0，121 ，高压灭菌20 min，备用。5.2.2 CTAB沉淀液：称取1.00 g CTAB，0.50 g NaCl，用适量水溶解后，调节pH=8.0，定容至200 mL，高压灭菌。5.2.3 RANase RNA酶。5.2.4 TE缓冲液（pH 8.0）。5.2.5 NaCl溶液，1.2 mol/L。5.2.6 三氯甲烷。5.2.7 异丙醇。5.2.8 70 %乙醇。5.2.9 引物：根据附录A中表A.1的序列合成荧光引物，加超纯水配制成100 pmol/L储存液，用于PCR检测的工作液浓度为10 pmol/L。荧光基团可以为FAM、HEX中的一种。5.2.10 毛细管电泳专用分子量内标。5.2.11 去离子甲酰胺。5.2.12 除特别说明外，所用试剂均为分析纯。水为无离子水。5.2.13 蛋白酶K。5.2.14 苯酚。6 制样对于种苗、枝叶、果实样品，每个样品取两个平行样，各300 mg。对于砧木样品取韧皮部部分，每个样品取两个平行样，各300 mg。7 检测方法7.1 样品DNA的提取7.1.1 称取300 mg经的样品，液氮研磨后置于2 mL离心管中，加入600 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K，振荡混匀，65 温浴30 min90 min，期间每隔10 min 轻柔颠倒混匀。7.1.2 2 000 g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀。7.1.3 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀。7.1.4 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65 的TE缓冲液溶解DNA。7.1.5 加入5 L RNA酶溶液，37 30 min。7.1.6 加入200 L三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡。7.1.7 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀。7.1.8 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4 预冷的70 %乙醇500 L，涡旋清洗沉淀。7.1.9 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 L TE缓冲液溶解沉淀，20 保存备用。也可以根据实际情况使用其他经过验证的试剂盒。7.2 DNA浓度与纯度测定采用紫外分光光度计法测定DNA浓度和纯度。紫外分光光度计检测的最佳范围是2 pg/mL50 pg/mL，OD值应该在0.051的区间内。将DNA液做适当的稀释，放入紫外分光光度计的龀色皿中，于260 m处测定其吸收峰，1OD260 nm=50 g/mL双链DNA或38，g/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260 nm/OD280 nm比值为1.72.0。7.3 PCR定性检测7.3.1 PCR反应引物序列表针对种常见苹果品种鉴定用的PCR扩增引物，见附录A中表A.1。15对引物分别进行PCR的扩增。7.3.2 PCR反应参数PCR扩增用引物序列信息见附录A中表A.1。7.3.3 PCR反应体系PCR反应体系见附录A中表A.2。7.3.4 质控措施检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知品种的苹果做阳性对照，用已知不含苹果成分的模板作阴性对照，用等体积的水代替模板DNA作空白对照。7.4 毛细管电泳荧光检测7.4.1 样品上机按照毛细管电泳仪器使用要求更换缓冲液、灌胶和在程序中输入样品信息。将FAM荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，将HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释15倍，将TAMRA荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍，将ROX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释5倍，混合均匀。从稀释液中取1 L上样到毛细管电泳仪专用分析板的孔中。同时加入0.1 L分子量内标和8.9 L去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95 变性5 min，迅速取出置于冰上，冷却10 min。离心把管内液体甩至管底后上毛细管电泳的仪器。 启动运行程序，毛细管电泳仪自动收集点用数据。7.4.2 等位数据采集由毛细管电泳的分析软件，通过与标准分子量比对，读出每个扩增位点的样品等位基因扩增条带数目和条带大小的数据。若采集的等位基因扩增的数据为2个扩增条带，则该样品为二倍体苹果。若采集的等位基因扩增的数据为3个扩增条带，则该样品为三倍体苹果。若有4个扩增条带，则该样品为四倍体苹果。二倍体纯合位点的等位基因条带的大小数据记录为X/X，杂合位点等位变异大小数据记录为X/Y。其中X、Y分别为该位点上两个不同的等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后，无效等位变异的大小记录为0/0。三倍体和四倍条带大小记录方式类推。7.5 结果判定及表述7.5.1 将获得样品的等位基因变异数据与附录A.3数据库中品种比较：a) 若为二倍体，品种相似度（S）按照下面的公式计算：S=2NijNi+Nj100(1)式中：S 相似度，单位为百分率（%）；Nij 品种i和j之间共有的等位基因数目；Ni 品种i中出现的等位基因数目；Nj 品种i中出现的的等位基因数目。b) 若为三倍体，品种相似度（S）按照下面的公式计算：S=3NijNi+Nj100(2)式中：S 相似度，单位为百分率（%）；Nij 品种i和j之间共有的等位基因数目；Ni 品种i中出现的等位基因数目；Nj 品种i中出现的的等位基因数目。推荐使用本标准附录B配用的苹果品种鉴定系统软件，该软件预装了附录A.3的标准样品数据库，并且按照以上公示设计计算程序，输入待测样品的微卫星数据，运行程序可以直接得到品种相似度最高的相似品种信息。该软件需要在Java运行条件下安装使用。7.5.2 结果判定及表述判定方法如下：a) 品种间相似度90 %，判定为不同品种；b) 品种间相似度90 %S100 %时，判定为近似品种；c) 品种间相似度=100 %，判定为疑似品种。对于b）和c）的情况，按照GB/T 19557.1和NY/T 24242013的规定进行田间鉴定。AA附录A （规范性附录）PCR扩增用引物序列信息及参考数据库PCR扩增用引物序列信息见表A.1。表A.1 PCR扩增用引物序列信息序号名称引物方向序列（5-3）5端标记荧光基团扩增条件扩增大小bp文献来源1CH01d08Fctccgccgctataacacttc94 2 min 30 sec； 94 30 sec，52 30 sec，72 30 sec，40 cycle；72，10 min。238-2901、Gerald S. Dangl Judy Yang Deborah A. Golino Thomas Gradziel. A practical method for almond cultivar identificationand parental analysis using simple sequence repeat markersEuphytica (2009) 168:4148.2、L. Gianfranceschi, N. Seglias,R. archini, M. Komjanc, C. Gessler. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple. Theor Appl Genet (1998) 96:1069-1076.Ractctggagggtatgtcaaag2CH01e01Fggttggagggaccaatcatt106-120Rcccactctctgtgccagatc3CH02b03bFataaggatacaaaaaccctacacag77-109Rgacatgtttggttgaaaacttg4CH02b07Fccagacaagtcatcacaacactc180-202Ratgtcgatgtcgctctgttg5CH02b10Fcaaggaaatcatcaaagattcaag121-159RCaagtggcttcggatagttg6CH02b12Fggcaggctttacgattatgc101-143Rcccactaaaagttcacaggc7CH02d11Fagcgtccagagcaacagc118-148Raacaaaagcagatccgttgc8CH02f06Fccctcttcagacctgcatatg135-158Ractgtttccaagcgatcagg9CH02g09Ftcagacagaagaggaactgtatttg98-138RCaaacaaaccagtaccgcaa10CH02h11aFcgtggcatgcctatcatttg104-132Rctgtttgaaccgcttcctc11CH03d07Fcaaatcaatgcaaaactgtca186-226Rggcttctggccatgatttta12CH04d02Fcgtacgctgcttcttttgct118-146Rctatccaccacccgtcaact13CH04d10Fgagggatctgtagctccgac138-204Rtggtgagtatctgctcgctg14CH05c07Ftgatgcattagggcttgtactt111-149Rgggatgcattgctaaataggat15CH05g03Fgctttgaatggatacaggaacc135-192RcctgtctcatggcattgttgPCR反应体系见表A.2。表A.2 PCR反应体系试剂名称工作液浓度25 L反应体系加样体积/ LdNTP2.5 mmol/L2 LPCR缓冲液102.5 LTaq DNA聚合酶5 U/L0.3 L上游引物10 pmol/L0.3下游引物10 pmol/L0.3DNA模板10050 ng2超纯水17.6部分苹果品种SSR基因型数据见表A.3。表A.3 部分苹果品种SSR基因型数据品种果实或者茎枝SSR位点CH02b12SSR位点CH01e01SSR位点CH02b03bSSR位点CH02b10SSR位点CH02d11SSR位点CH02f06SSR位点CH01d08SSR位点CH02b07SSR位点CH02g09SSR位点CH02h11aSSR位点CH03d07SSR位点CH04d02SSR位点CH05c07SSR位点CH05g03SSR位点CH04d10AkagiFruiting128/144114/11679/95129/137119/121148/162275/275110/132111/120124/134185/199138/152153/153166/170168/191AkaneFruiting130/130114/12295/95129/141121/133148/162244/297130/132111/138107/124183/203126/152117/153166/174168/209AkibaeFruiting130/140112/11679/95125/129119/133148/162244/244110/112107/120132/134185/199126/152117/153166/170154/191Akita GoldFruiting144/144112/11679/79125/135119/133142/148244/254112/132107/120132/134203/223126/126117/143166/170164/191Aodai3Rootstock146/148110/12291/101118/149127/133144/162244/260110/112138/152107/132160/223126/144117/127140/166166/176BaskatongOthers134/134126/13891/101121/139123/125152/152242/299104/110103/138140/146181/181126/134143/151162/166150/152BraeburnFruiting144/146112/11499/99123/161123/133154/154258/258110/110111/136132/136203/223126/126129/153166/166164/209ChinatsuFruiting130/134114/11495/99127/141133/133144/148254/297110/132111/120124/132203/203126/138117/117140/166166/168Coxs Orange PippinFruiting132/144110/11475/97123/135121/133154/158244/258110/12497/111107/132215/215126/126129/129168/199154/209Cripps PinkFruiting144/146112/11679/97125/129119/149148/148254/258118/124120/120132/132185/223126/126145/153170/174164/191DiscoveryFruiting130/142114/11495/97133/133121/133148/162244/297118/130107/111128/132183/203126/152117/143140/166164/164FiestaFruiting130/132110/11475/95123/129121/133154/162258/275112/12497/111107/132203/215124/126129/145168/189154/166FujiFruiting144/144112/11679/108135/137133/133142/162244/258112/112107/111132/132223/223124/126117/139140/166164/209G.65Rootstock113/142112/14875/91125/149123/149150/154258/258104/112111/138112/124/132183/223138/138133/153140/176164/164GalaFruiting132/144114/11675/79129/135119/121142/162244/275110/118111/120134/136185/215126/138117/143170/199154/191GenevaFruiting134/140120/12495/101133/139121/125150/162242/244108/118101/138107/140181/185126/134143/153140/166150/168表A.3部分苹果品种SSR基因型数据（续）品种果实或者茎枝SSR位点CH02b12SSR位点CH01e01SSR位点CH02b03bSSR位点CH02b10SSR位点CH02d11SSR位点CH02f06SSR位点CH01d08SSR位点CH02b07SSR位点CH02g09SSR位点CH02h11aSSR位点CH03d07SSR位点CH04d02SSR位点CH05c07SSR位点CH05g03SSR位点CH04d10Golden DeliciousFruiting144/144112/11679/99125/129119/133148/162254/275110/118120/138132/134185/203126/138143/153140/170191/191Granny SmithFruiting144/150114/11681/103125/129133/149150/162258/258110/114120/138132/132189/223124/126143/145174/189166/209GunmameigetsuFruiting128/144112/11679/79135/137119/133142/148258/275112/132111/120132/134185/223124/152117/153140/170164/191HacnineFruiting144/144/144112/11679/108129/135/137133/133/133142/162244/258/275112/132107/111126/132185/223124/126/138117/139/153140/166/197164/191/209HarukaFruiting144/144112/11679/99129/135119/133142/148254/258110/112111/120134/136203/203126/138117/143166/170191/209HatsuakiFruiting128/144112/11679/97129/129133/133154/162275/275110/112120/136107/134185/199126/126143/153170/197191/209HimekamiFruiting130/144112/11479/95135/137121/133162/162244/275112/112107/111107/132203/223124/126139/153166/197164/168HokutoFruiting144/144/144112/114/11679/108135/137/161133/149142/162244/258110/112107/111/120132/132/132185/223124/126/152117/139/153140/166/170164/166/209Honey QueenFruiting130/146114/11691/108125/161121/133148/162258/275112/112107/120107/134203/203126/126153/153166/197191/209IdaredFruiting130/144114/11695/97129/161121/133154/162275/297112/112111/136107/126199/203124/152145/145166/189166/209IndoFruiting140/144114/11679/97137/147133/149142/148258/258110/118111/167132/132215/223124/152117/153166/166154/209IwakamiFruiting128/144114/11697/108129/135121/133142/154244/244112/112107/136107/132203/223124/126117/153140/166164/168JM1Rootstock132/146110/118101/106118/149133/143144/154244/250110/11099/152128/132213/223126/144117/127164/166152/166JM2Rootstock144/148110/11891/101118/149127/131144/154250/293110/110136/138128/130160/223126/126131/153140/166152/164JM5Rootstock146/148110/118101/106118/149131/143144/154250/293110/11099/152107/132160/223138/144127/131140/166166/176JM7Rootstock146/148110/11891/101137/149131/143152/154244/250110/11099/136128/132213/223138/144131/153140/174152/166JM8Rootstock144/148110/122101/106118/129127/131144/162260/293110/11099/152128/132160/223126/144117/127164/166152/166表A.3部分苹果品种SSR基因型数据（续）品种果实或者茎枝SSR位点CH02b12SSR位点CH01e01SSR位点CH02b03bSSR位点CH02b10SSR位点CH02d11SSR位点CH02f06SSR位点CH01d08SSR位点CH02b07SSR位点CH02g09SSR位点CH02h11aSSR位点CH03d07SSR位点CH04d02SSR位点CH05c07SSR位点CH05g03SSR位点CH04d10JonagoldFruiting128/144112/114/11679/95/99125/129/137119/133148/154/162244/254/275110/112/118111/120/138124/132/134185/199/203126/138143/145/153140/170/197191/209JonathanFruiting128/130112/11495/97129/137121/133154/162244/275112/132111/136107/124199/203126/152145/153166/197168/209KankiFruiting140/144112/11679/79125/129133/133142/162244/244110/112107/120134/134185/223152/152117/153166/170164/168KinseiFruiting144/146114/11679/108125/135119/133148/154254/258110/112111/120132/134185/203126/138153/153166/170191/209KiouFruiting144/144116/11679/97125/129133/149148/162244/254110/112120/120132/132185/223138/152153/153140/166154/154KitakamiFruiting144/144112/11693/108129/149133/133150/154275/297112/114107/120107/136185/223126/138143/153170/174168/191KitaroFruiting144/144112/11679/79129/135133/133142/162244/275112/112107/120107/132185/223126/126117/143140/170191/209KizashiFruiting132/132114/11675/79127/135119/133142/154244/244110/118120/120132/134203/215124/138117/131140/199166/191KotaroFruiting144/144112/11697/108129/137133/133154/162244/275112/112111/120132/134199/223124/126139/153166/170164/191M.26Rootstock130/144110/11499/101129/149133/149150/154244/258110/132136/152107/132189/223126/138127/143164/174164/168M.27Rootstock113/146112/11691/97135/149133/149154/154258/293112/124111/136128/132213/223126/138143/153140/140164/166M.9Rootstock144/146110/11691/101129/149131/133154/162244/293110/112136/152107/128223/223126/138127/153140/164164/166Malus niedzwetzkyanaOthers134/134120/126101/101139/139123/125152/162242/299110/118134/138132/140181/203126/134143/151160/166150/152McIntoshFruiting144/146112/11493/99133/149121/133150/162258/275114/132107/138126/132187/223126/126143/145164/166154/164MegumiFruiting130/144114/11491/97