第四章目的基因的获得酵母双杂交课件.ppt

第1页，此课件共58页哦 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母酵母中进行的，研中进行的，研究究活细胞内活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过间的作用也能通过报告基因报告基因的表达产物敏感地检测得到的表达产物敏感地检测得到。一、酵母双杂交系统简介一、酵母双杂交系统简介 它是一种具有它是一种具有很高灵敏度很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技的研究蛋白质之间关系的技术。术。该技术既可用来研究该技术既可用来研究哺乳动物哺乳动物基因组编码的蛋白质之基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究间的相互作用，也可用来研究高等植物高等植物基因组编码的蛋白质基因组编码的蛋白质之间的相互作用。之间的相互作用。第2页，此课件共58页哦二、酵母双杂交系统的建立二、酵母双杂交系统的建立第3页，此课件共58页哦 该系统的建立是基于对真核生物该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始调控转录起始过程的认过程的认识。真核生物基因转录需要识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子反式转录激活因子的参与，真核的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：生长转录因子含有两个不同的结构域：转录激活因子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)(DNA binding domain)转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activation domain)1989年美国纽约州立大学的年美国纽约州立大学的Fields和和Song首先描述了酵母首先描述了酵母双杂交系统双杂交系统(yeast two-hybrid system)。第4页，此课件共58页哦 这两个结构域各具功能，互不影响，单独存在这两个结构域各具功能，互不影响，单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共共价或非共价键连接建立起来的空间结构价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。的激活特定基因表达的激活因子的功能。第5页，此课件共58页哦第6页，此课件共58页哦 两个结构域中的两个结构域中的BD由位于由位于N-末端的末端的1147位多肽构成位多肽构成，能识别位于能识别位于Gal4基因的上游激活序列基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其此外，在其N-端还具有一段端还具有一段核定位序列核定位序列。AD由位于由位于C-末端的末端的768881位多肽构成。位多肽构成。Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。作为转录因子的活性。Gal4为酵母为酵母半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因gal1的的转录激活因子转录激活因子，天然的，天然的Gal4分子是由一条由分子是由一条由881个氨基酸残基个氨基酸残基组成的多肽链。组成的多肽链。第7页，此课件共58页哦 Fields和和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将粒上，一个是将Gal4的的DNA-BD与酵母蛋白与酵母蛋白SNF1融融合；另一个是将合；另一个是将Gal4的的AD和酵母蛋白和酵母蛋白SNF4融合。融合。其中，其中，SNF1是一种丝氨酸是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以这两种蛋白是已知可以相互作用的。相互作用的。第8页，此课件共58页哦 当两种穿梭质粒共转化含有当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株的酵母菌株后，通过后，通过SNFl与与SNF4的相互作用，的相互作用，Gal4的的DNA-BD与与Gal4的的AD靠近靠近,形成一个大的复合物形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的的DNA-BD可识别位于可识别位于Gal4效应基因的效应基因的UAS，并可，并可与之结合；与之结合；Gal4的的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因下游报告基因LacZ的转录。的转录。第9页，此课件共58页哦三、酵母双杂交系统的原理三、酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneXDNA-BD第10页，此课件共58页哦许多真核生物的许多真核生物的转录激活因子转录激活因子都是由两个在都是由两个在结构结构上可以分开上可以分开的、的、功能上也相互独立的结构域功能上也相互独立的结构域组成。组成。1.结构域（结构域（Domain）合作）合作第11页，此课件共58页哦例如：例如：啤酒酵母的啤酒酵母的半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因激活因子基因激活因子GAL4:DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因结合结合结合结合激活转录激活转录实验发现：实验发现：转录表达转录表达只要只要DNA binding domain（DNA-BD）与与Active domain（AD）靠近就能激活转录。）靠近就能激活转录。第12页，此课件共58页哦DNA binding domainActive domain上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因结合结合用重组用重组DNA技术把技术把GAL4的两个的两个Domain分开，就分开，就丧丧失失了激活效应基因的能力。了激活效应基因的能力。不能转录不能转录第13页，此课件共58页哦用重组用重组DNA技术把这两个技术把这两个Domain分别与两个不同的分别与两个不同的多肽连接。多肽连接。Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在体内，蛋白在体内，蛋白A与蛋白与蛋白B是否能结合。是否能结合。第14页，此课件共58页哦GAL4的的BD domain与与AD Domain也不能靠近，也不能靠近，所以所以仍然不能启动效应基因的转录。仍然不能启动效应基因的转录。（1）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B不能相互结合不能相互结合（2）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B能相互结合能相互结合上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白B激活转录激活转录转录表达转录表达第15页，此课件共58页哦Reporter gene表达就说表达就说明明X基因产物与基因产物与Y基因产基因产物能结合。物能结合。双杂交原理双杂交原理第16页，此课件共58页哦第17页，此课件共58页哦酵母细胞酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:v 易于转化、便于回收扩增质粒易于转化、便于回收扩增质粒v 具有可直接进行选择的具有可直接进行选择的标记基因标记基因和特征性和特征性报告基因报告基因v 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相 互结合互结合报道株报道株经经改造改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞第18页，此课件共58页哦v 基因组中基因组中GAL4基因基因是缺失型的是缺失型的v 基因组中引入额外的报告基因基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母细胞的特点：改造后的酵母细胞的特点：通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落第19页，此课件共58页哦 表达表达“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”蛋白；蛋白；检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。做法：首先构建能表达做法：首先构建能表达“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”蛋白的表达蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。四、酵母双杂交系统的基本策略四、酵母双杂交系统的基本策略第20页，此课件共58页哦五、酵母双杂交系统的优点五、酵母双杂交系统的优点 高敏感性。高敏感性。原因：原因：采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；过量表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；白各组分间结合更趋于稳定；通过通过mRNA使信号放大；使信号放大；检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。第21页，此课件共58页哦五、酵母双杂交系统的优点五、酵母双杂交系统的优点2.真实性。真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。3.简洁性。简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。化蛋白质的繁琐步骤。4.广泛性。广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。第22页，此课件共58页哦 分析分析已知蛋白已知蛋白之间的相互作用之间的相互作用 对蛋白质对蛋白质功能域的分析功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质用已知功能蛋白质筛选双杂交筛选双杂交cDNA文库文库，研究蛋白质之，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。间相互作用的传递途径，发现新基因。分析分析新基因的生物学功能新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制绘制蛋白质相互作用系统图谱蛋白质相互作用系统图谱 在在药物设计药物设计中的应用中的应用六、酵母双杂交系统的应用现状六、酵母双杂交系统的应用现状第23页，此课件共58页哦1.利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质的新功能的新功能 将已知基因作为将已知基因作为诱饵诱饵，在选定的，在选定的cDNA文库中筛选与文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。上的联系。第24页，此课件共58页哦 利用酶联免疫（利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（）、免疫共沉淀（CO-IP）技术）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于间的相互作用，但它们都是基于体外非细胞体外非细胞的环境中研究蛋的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内细胞体内的抗原和抗体的聚积的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。反应则可以通过酵母双杂交进行检测。2.利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和 抗抗体的相互作用体的相互作用第25页，此课件共58页哦3.利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响对蛋白质之间相互作用的影响 对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。疾病的目的。第26页，此课件共58页哦4.利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。序列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。第27页，此课件共58页哦七、酵母双杂交系统中常见问题的解决七、酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施和改进措施（一）（一）假阳性较多假阳性较多第28页，此课件共58页哦假阳性定义：假阳性定义：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。的情况下，报告基因仍被激活。（一）（一）假阳性较多假阳性较多 BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。活作用被外来蛋白激活。如如AD融合靶蛋白有融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。告基因的表达。AD融合蛋白直接与转录因子作用激活报告基因；融合蛋白直接与转录因子作用激活报告基因；AD融合靶蛋白与融合靶蛋白与BD相互作用或者相互作用或者AD与与BD融合蛋白之间的融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。原因原因：第29页，此课件共58页哦排除假阳性的措施排除假阳性的措施 作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。报告基因的鉴定。采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。目前试剂公司已采用。报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。优化优化3-AT(3-aminotriazole，3-氨基三唑氨基三唑)浓度。适当增加浓度。适当增加浓度可减少假阳性。浓度可减少假阳性。第30页，此课件共58页哦排除假阳性的措施排除假阳性的措施第31页，此课件共58页哦第32页，此课件共58页哦 接合型酵母细胞接合型酵母细胞cDNA文库文库 诱铒蛋白基因诱铒蛋白基因多克隆位点多克隆位点DNA-BD 载体载体 AD 载体载体转化转化转化转化a接合型酵母细胞接合型酵母细胞筛选平板筛选平板生长菌苔生长菌苔筛选平板筛选平板生长菌苔生长菌苔同一个三重筛选平板同一个三重筛选平板克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）鉴定鉴定-半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分已商部分已商品化品化第33页，此课件共58页哦两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。度甚低以至于检测不出来。原因：原因：第34页，此课件共58页哦 酵母双杂交系统是分析蛋白酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用蛋白间相互作用的有效和快速的方法，的有效和快速的方法，有多方面的应用，有多方面的应用，但仍存但仍存在一些在一些局限性局限性。八、酵母双杂交系统使用注意事项八、酵母双杂交系统使用注意事项第35页，此课件共58页哦酵母双杂交系统酵母双杂交系统局限性局限性某些诱饵蛋白具有某些诱饵蛋白具有自身激活自身激活性质。性质。-双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域结构域某些蛋白在酵母中某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位不稳定表达或不能准确定位到胞核到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系噬菌体显示系统。统。双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。这些反应在核内无法进行。第36页，此课件共58页哦酵母双杂交系统局限性酵母双杂交系统局限性有时有时DNA-BD或或AD融合部分不包括相互作用位点，或破融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。坏了融合蛋白的正确折叠。4.哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究 阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。特异性的抗体进行共定位研究。双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。实验手段来验证。第37页，此课件共58页哦 在酵母双杂交的基础上，又发展：在酵母双杂交的基础上，又发展：酵母单杂交酵母单杂交-用于核酸和文库蛋白之间的研究用于核酸和文库蛋白之间的研究酵母三杂交酵母三杂交-三种不同蛋白之间的互作研究三种不同蛋白之间的互作研究酵母的反向杂交酵母的反向杂交-两种蛋白相互作用的结构和位点。两种蛋白相互作用的结构和位点。反向双杂交系统和三杂交技术反向双杂交系统和三杂交技术第38页，此课件共58页哦 1993年，由年，由Wang和和Reed等相继创立发展出一种研究蛋等相继创立发展出一种研究蛋白质和白质和DNA相互作用的实验体系。相互作用的实验体系。Wang MM,Reed RR.Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文献出处文献出处第39页，此课件共58页哦 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的的BD-X蛋白质杂交体，而用蛋白质杂交体，而用特异的特异的DNA序列取代序列取代DNA Gal4结合位点。结合位点。该该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶靶DNA序列特异的结合蛋白序列特异的结合蛋白(BDPX)与与Gal4 P的激活结构的激活结构域可融合形成融合体，域可融合形成融合体，BDPX与其特异与其特异DNA结合位点之间结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。达。第40页，此课件共58页哦 理论上，酵母单杂交系统可利用靶理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，捕获序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和录抑制和DNA复制过程的蛋白质。复制过程的蛋白质。第41页，此课件共58页哦确定已知确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。蛋白质之间是否存在相互作用。分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合结合位点蛋白的新基因。位点蛋白的新基因。定位已经证实的具有相互作用的定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的结合蛋白的DNA结结合结构域以及准确定位与合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。结合的核苷酸序列。-研究研究DNA-蛋白质相互作用蛋白质相互作用第42页，此课件共58页哦1996年，年，Vidal等人建立了反向酵母双杂交系统等人建立了反向酵母双杂交系统Vidal M,Brachmann RK,Fattaey A,Harlow E,Boeke JD.Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320.第43页，此课件共58页哦 该系统是一项鉴定该系统是一项鉴定阻断阻断蛋白间相互作用的技术，核心在蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。于构建一种反向筛选的报告基因。在这系统中，野生型在这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种间的相互作用激活一种毒毒性标志性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的的阴性阴性筛选。筛选。在此情况下在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离作用的解离赋予酵母一种选择生赋予酵母一种选择生长优势。长优势。利用这种方法能方便地鉴定利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因作用缺陷等位基因、解离肽解离肽或相关的小分子物质或相关的小分子物质。第44页，此课件共58页哦 反向双杂交系统基本原理示意图反向双杂交系统基本原理示意图 第45页，此课件共58页哦 反向双杂交系统基本原理示意图反向双杂交系统基本原理示意图 双杂交产生的相互作用激活双杂交产生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，从而抑制阳阻遏蛋白，从而抑制阳性筛选标志性筛选标志His3的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现为组氨酸营养缺陷型。为组氨酸营养缺陷型。第46页，此课件共58页哦 用于筛选缺陷等位基因的研究用于筛选缺陷等位基因的研究：在稳定、全长及能够形成：在稳定、全长及能够形成正确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用正确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用缺陷性等位基因。缺陷性等位基因。在反式作用解离分子方面的应用在反式作用解离分子方面的应用 在蛋白质组研究方面的应用在蛋白质组研究方面的应用：利用反向双杂交系统对文库进：利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想。连锁图谱的设想。第47页，此课件共58页哦酵母双杂交酵母双杂交GAL4 系统筛选系统筛选cDNA 文库实验流程文库实验流程第48页，此课件共58页哦GAL 系统所用酵母菌株系统所用酵母菌株注：注：菌株菌株AH109 可利用所带的可利用所带的HIS3、ADE2、MEL1 三个报道基进行筛库。三个报道基进行筛库。菌株菌株Y187 可利用所带的可利用所带的IacZ 报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。菌株菌株CG-1945 可被用于用环己酰亚胺来分离可被用于用环己酰亚胺来分离BD-bait 和和AD-library 质粒。质粒。第49页，此课件共58页哦酵母菌株的表型酵母菌株的表型第50页，此课件共58页哦GAL 系统所用各种质粒系统所用各种质粒第51页，此课件共58页哦诱饵载体诱饵载体第52页，此课件共58页哦诱饵载体序列诱饵载体序列第53页，此课件共58页哦猎物载体猎物载体第54页，此课件共58页哦猎物载体序列猎物载体序列第55页，此课件共58页哦第56页，此课件共58页哦第57页，此课件共58页哦1、利用、利用EST数据库发现新基因数据库发现新基因第58页，此课件共58页哦