第二章 微生物的培养与应用-2021年高考备考生物一轮复习知识点挖空练.docx

第二章 微生物的培养与应用2.1一、培养基1概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质叫培养基。 可分为 培养基和 培养基。 2营养构成：各种培养基一般都含有 、 、 和 ，此外还要满足微生物生长对 、 以及 的要求。 3培养乳酸杆菌时需在培养基中添加 、培养霉菌时需将培养基pH调至 、培养细菌时需将pH调至 、培养厌氧微生物则需提供 条件。划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类、鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴定用途选择培养基培养基中加入_，以_不需要的微生物的生长，_所需要的微生物的生长_ (如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐)鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入_不同种类的微生物，如可用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)二、无菌技术：(一)、获得纯净培养物的关键是 ，具体操作如下：来源:Z。xx。k.Com 1对实验操作的 、操作者的 和 进行 。 2.将用于微生物培养的 、 和 等器具进行 。 3为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。 4实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 相接触。 (二)、消毒和灭菌 定义 常用方法 应用消毒使用 的物理或化学方法杀死物体 微生物（不包括芽孢和孢子）日常用法 实验室、操作台、衣物等 手、外植体等 牛奶 灭菌使用 杀死 的微生物，包括芽孢和孢子 培养基、玻璃仪器等 接种环、涂布器 玻璃仪器、金属用具 【注意】用酒精消毒时，杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。实验操作-大肠杆菌的纯化培养本实验所用的培养基是 ，本实验可分成 和 两个阶段进行。一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基来源:学科网ZXXK1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作步骤是： 、 、 、 、 。思考1在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的称量操作中，动作要迅速，原因是什么？溶化操作中需要不断用玻璃棒搅拌的目的是什么？思考2牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供什么等营养物质？2、倒平板：待培养基冷却至 左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：在火焰旁右手拿 ，左手 ；使锥形瓶的瓶口 ；左手将培养皿 ，右手 ，立刻盖上皿盖。待平板冷却凝固后，将平板 。思考3锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是什么？思考4倒平板的目的是什么？ 思考5若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？思考6配制斜面培养基作用是什么？试管为什么要加塞棉塞？二、接种纯化大肠杆菌微生物接种：最常用的是 法和 法。另外还有穿刺接种和斜面接种等。纯化大肠杆菌的原理：在培养基上将聚集的菌种稀释分散成_，形成_，此菌落是由一个细胞繁殖而来的子细胞群体。1平板划线法： 是 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。其操作步骤是：将 在酒精灯火焰上 直至烧红。在酒精灯火焰旁 接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。将菌种试管口通过火焰达到 的目的。将冷却的接种环伸入到 。将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。将皿盖打开一条缝隙，把接种环迅速 ，盖上皿盖，注意 。灼烧接种环，冷却后从 划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将 相连。将平板 培养。思考7a、取菌种前灼烧接种环的目的是什么？ b、为什么除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环？c、取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是什么？最后灼烧接种环的目的是什么？ d、在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是什么？2稀释涂布平板法：将菌液进 稀释，然后将 进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。a、系列稀释操作：取盛有 mL水的试管6支 ，编号101、102、103、104、105、106。用灼烧冷却的移液管吸取 mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次使之混匀。从101倍液中吸取 mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。b、涂布平板操作：将涂布器浸在盛有_的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽_。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基上，涂布时可转动培养皿，使_。三、结果分析与评价1、 培养未接种培养基的作用是什么？若有菌落形成，说明什么？2、 在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落颜色？形态？四菌种的保藏（1）短期保存：固体斜面培养基上_保存，菌种易被污染或产生变异。（2）长期保存：_。2.2一、筛选菌株1.自然界中目的菌株的筛选（1）依据：根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。（2）实例：PCR技术过程中用到的耐高温的 ，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。2.实验室中目的菌株的筛选：（1）原理：人为提供有利于 生长的条件(包括 等)，同时 或 其他微生物生长。 （2）方法：利用选择培养基分离。a.选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。b.配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养 的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。c.实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以 作为 ，只有能合成 的微生物才能分解尿素。 二、统计菌落数目测定微生物数量的常用方法有 和 。1.稀释涂布平板法：统计样品中 （1）原理:当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。（2）注意事项：a.设置对照：主要目的是排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验结果的 。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养 的培养基作为空白对照。b.设置重复组：同一个稀释度下，至少涂布 作为重复组，才能增加实验的说服力与准确性。分析结果时，需要考虑重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。（3）计算公式：每克样品中的菌株数 ，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。（4）结果分析：统计的菌落往往比活菌的实际数目 。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是 。2. 显微镜直接计数法（1）原理：利用特定 ，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。（2）方法：用计数板计数。（3）缺点： 。3、 关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：（1） 取样：从富含有机质的土壤中取样。应先 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 中。（2）制备 ：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为 ，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。【注意】分离不同的微生物应采用 的稀释度：测量土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105稀释；测真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释。 （3）微生物的 与观察将10g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液 ，转移至盛有 的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102 依次等比稀释至107稀释度，并按照由107103稀释度的顺序分别吸取 进行平板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。 将涂布好的培养皿放在30温度下培养，及时观察和记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 培养基的斜面中，观察能否产生如教材中图2-lO的颜色反应。（4）细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。4.菌种鉴定：（1）原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为 ，使培养基的 增强，pH 。（2）方法：在 的培养基中加入 指示剂培养细菌，若指示剂变 ，可确定该细菌能够分解尿素。5实验设计（1） 实验设计的内容包括 、 、 和 等。（2）根据图示27填写以下实验流程：（3）土壤微生物主要分布在距地表38cm的近中性的潮湿土壤中，约7090为 。（4）分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是 。（5） 培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。细菌一般在 培养12d，放线菌一般在 培养57d，霉菌一般在 的温度下培养34d。（6）菌落的特征包括 等方面。（7）实验过程1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要 。2）应在 旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有90mL 的锥形瓶中，塞好棉塞。3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在 旁进行。4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度等。5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先 。6结果分析与评价（1）对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 的方法。（2）在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 将尿素分解成了 。氨会使培养基的碱性 ，PH 。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发生。（3）在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变 ，说明该细菌能够 。2.3探究点一：纤维素与纤维素酶1纤维素的化学组成： 三种元素，是一种 糖。2纤维素的分布： 是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。3纤维素酶的作用：纤维素酶是一种 ，一般认为它至少包括三种组分，即 酶、 酶 酶，前两种酶使纤维素分解成 ，第三种酶将纤维二糖分解成 。探究点二：纤维素分解菌的筛选1筛选方法： 染色法。2筛选原理：刚果红是一种 ，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成 ，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。思考：1.怎样利用刚果红的这一特点来筛选纤维素分解菌？2.利用刚果红染色的方法有几种？各自的优缺点是什么？探究点三：分离分解纤维素的微生物的实验（一）实验流程 土壤取样-选择培养-梯度稀释-涂布培养-刚果红染色-挑选产生透明圈的菌落（二）实验步骤1土壤取样：采集土样时，应选择富含 的土壤。 取土样20g，无菌条件下，加入装有30ml培养基的锥形瓶，将锥形瓶置于 上，一定温度下，振荡培养1d-2d，培养液变浑浊。2选择培养： 吸取一定量的培养液，转移至选择培养基中，摇床培养至变 。 3梯度稀释： 依次将培养液稀释101107倍。 4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上<1>制备培养基：参照课本旁栏中的比例。 <2>倒平板操作。 <3>涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取01 mL涂布在平板培养基上，30倒置培养。 5.刚果红染色法：挑选产生 的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。【答案】2.11.营养物质，生长繁殖，培养基，液体，固体2.水，无机盐，氮源，碳源 ，PH,特殊营养物质，氧气3.维生素，酸性，中性或微碱性，无氧一.防止外来杂菌的入侵1.空间 ，衣着，手，清洁和消毒2.器皿，接种用具，培养基，灭菌 3.酒精灯火焰4 周围的物品选择: 有利某种微生物生长繁殖所需的营养物质 ，抑制或阻止， 选择出 .用于培养、分离出特定的微生物 .鉴别: 某种指示剂或者化学药品 .鉴别一、牛肉膏 蛋白胨 培养基 制备培养基 纯化大肠杆菌1.计算 称量 溶化 灭菌 倒平板思考1.牛肉膏和蛋白胨 容易吸潮 放至琼脂糊底而导致烧杯破裂思考二 碳源和氮源2.50右手：拿装有培养基锥形瓶左手：拔出棉塞迅速通过火焰打开一条稍大于瓶口的缝倒过来放置 将锥形瓶中的培养基（1020ml）倒入培养皿思考三 对锥形瓶的口径处进行灼烧无菌防止空气中的杂菌污染思考四 防止皿盖上的水珠滴落到培养基上思考五 不能 因为空气中的微生物可能在皿盖上与皿底之间的培养基上滋生因此最好不用这个平板培养微生物思考六 斜面培养基主要是用来作为接种的载体斜面比非斜面的面积大可接种面积大 加棉塞是为了防止杂菌污染（二）较温和表面活内部的部分 煮沸消毒法 紫外线消毒法 化学药剂消毒法 巴氏消毒法 高压蒸汽灭菌法 灼烧灭菌法 干热灭菌法 注意：用体积分数为70%的酒精 强烈的理化因素 物体内外所有二、平板划线法 稀释涂布平板法肉眼可见的子细胞群体 菌落1稀释菌落接种环冷却菌液中伸入平板内 不要划破培养基倒置思考:a消灭接种环上的残留细菌b消灭上次划线的时候接种环上接触的细菌C以免接种环温度太高，杀死菌种d能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最后得到由单个细菌繁殖而来的菌落2.行一系列的梯度a9ml 试管灭菌11b酒精冷却8-10s菌液分布均匀三、1对照 说明培养基有细菌滋生2白色 光滑湿润透明的圆形四(1)放入4的冰箱中(2)可以采用甘油管藏的方法在3ml的甘油瓶中。装入1毫升甘油后灭菌将1毫升培养基的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在负20的冷冻箱中保存2.21 生存环境 2 TaqDNA聚合酶 目的菌株 营养 温度 ph 抑制 阻止 （2） 特定 阻止 抑制 b 自养 固氮 尿素 唯一氮源 脲酶 二 稀释倍数 活菌 30-300 （2） 非测试因素 可信度 无菌 3个 CMV 少 一个菌落 细菌计数板或血细胞计数板 不能判断死菌活菌统计出来的结果往往比实际数目多3（1）土壤 铲去表层土 信封（2）培养基 多于 对照（3）培养 10ml 90ml 0.1ml 酚红 （4）30300 平均值4（1）氨 碱性（2）以尿素为唯一氮源 酚红 变红5（1）实验方案 所需仪器 材料 用具 药品（3）细菌（4）不同微生物在土壤中的含量不同 （5）2528C 2528C（6）菌落的形状、大小、隆起程度、颜色（7）灭菌 酒精灯旁 无菌生理盐水 酒精灯旁 制定计划 6（1）生物化学（2）脲酶 氨 增强 增大（3）尿素 酚红 红分解尿素2.3一 1 C H O 多2 棉花3 复合酶 C1酶 Cx酶 葡萄糖苷酶 纤维二糖 葡萄糖二 1 刚果红 2 染料 红色复合物思考 1通过是否产生透明圈来筛选纤维素分裂菌2 2种后加入:优点 颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用缺点 操作繁琐刚果红会时菌落之间放生混杂 先加入:优点 操作简单不存在菌落混杂问题缺点 产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈有些微生物能降解色素形成明显的透明圈三 (二) 1 纤维素 摇床2 混浊5 透明圈 14 / 14