血红蛋白提取和分离.ppt

血红蛋白提取和分离现在学习的是第1页，共39页占细胞干重的50以上，细胞中含量最多的有机物现在学习的是第2页，共39页现在学习的是第3页，共39页基础知识现在学习的是第4页，共39页阅读并回答（P64）1、凝胶色谱法另一个名称；2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；3、凝胶的实质；4、凝胶色谱法 5、凝胶色谱法的原理。基础知识（一）凝胶色谱法现在学习的是第5页，共39页1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法 是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。4、凝胶 性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；化学本质：多糖类化合物：实例：葡聚糖、琼脂糖：2、凝胶色谱法的概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。基础知识（一）凝胶色谱法3、依据的特性蛋白质分子量的大小。现在学习的是第6页，共39页基础知识（一）凝胶色谱法现在学习的是第7页，共39页 原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快基础知识（一）凝胶色谱法现在学习的是第8页，共39页1、缓冲物质有哪些？2、缓冲溶液的作用是什么？3、怎样配制缓冲溶液？基础知识（二）缓冲溶液现在学习的是第9页，共39页1、缓冲溶液概念 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。缓冲溶液基础知识（二）缓冲溶液3、缓冲溶液配制 通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。现在学习的是第10页，共39页思考：你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。基础知识（二）缓冲溶液现在学习的是第11页，共39页阅读第65页的相关内容，回答以下问题：1、电泳的概念；2、电泳的原理；3、电泳的种类；4、SDS的作用。基础知识（三）电泳现在学习的是第12页，共39页1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。基础知识（三）电泳现在学习的是第13页，共39页基础知识（三）电泳 2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度一定的PH现在学习的是第14页，共39页基础知识（三）电泳现在学习的是第15页，共39页为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量分子的大小现在学习的是第16页，共39页实验操作阅读课本相关内容，思考以下问题：1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？2、样品怎样处理？3、蛋白质怎样分离？现在学习的是第17页，共39页实验操作（一）样品处理问：蛋白质提取和分离步骤？（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。现在学习的是第18页，共39页实验操作 （一）样品处理现在学习的是第19页，共39页 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约90是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包括两个-肽链和两个-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。实验操作 （一）样品处理现在学习的是第20页，共39页 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色血红蛋白组成及作用选材 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。实验操作 （一）样品处理现在学习的是第21页，共39页1、红细胞的洗涤 阅读课本内容，回答以下问题：1、洗涤的目的？2、怎样洗涤？3、洗涤干净的标志是什么？除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。实验操作 （一）样品处理现在学习的是第22页，共39页 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。问：1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？1、红细胞的洗涤重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。实验操作 （一）样品处理现在学习的是第23页，共39页2.血红蛋白的释放 血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。说出：蒸馏水和甲苯的作用。实验操作 （一）样品处理现在学习的是第24页，共39页3.分离血红蛋白溶液问：1、采用什么方法分离血红蛋白？2、离心分层后，各层的成分各是什么？3、用滤纸过滤，去掉什么成分？实验操作 （一）样品处理现在学习的是第25页，共39页 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。4.透析问：透析过程及透析目的？透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。实验操作 （一）样品处理现在学习的是第26页，共39页4.透析实验操作 （一）样品处理现在学习的是第27页，共39页 阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。实验操作 （二）凝胶色谱操作现在学习的是第28页，共39页实验操作 （二）凝胶色谱操作 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂两端需用砂纸磨平。纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔-挖穴挖穴-安管安管-覆网覆网-纱包纱包-插管插管 ：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成一个将上述三者按相应位置组装成一个整体。整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。现在学习的是第29页，共39页2.凝胶色谱柱的装填问:1、凝胶的选择材料?G代表意义?2、简单步骤?3、注意点：实验操作 （二）凝胶色谱操作选择交联葡聚糖凝胶（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。现在学习的是第30页，共39页2.凝胶色谱柱的装填问:1、凝胶的选择材料?G代表意义?2、简单步骤?3、注意点：实验操作 （二）凝胶色谱操作步骤操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱现在学习的是第31页，共39页3.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；装填凝胶柱时不得气泡存在。（因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。）2.凝胶色谱柱的装填实验操作 （二）凝胶色谱操作问:1、凝胶的选择材料?G代表意义?2、简单步骤?3、注意点：现在学习的是第32页，共39页 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12h。问：洗涤平衡的溶液？注意什么？1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果；2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。实验操作 （二）凝胶色谱操作2.凝胶色谱柱的装填现在学习的是第33页，共39页3.样品的加入和洗脱 实验操作 （二）凝胶色谱操作现在学习的是第34页，共39页3.样品加入与洗脱调节缓冲液面滴加透析样品 吸管吸1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。实验操作 （二）凝胶色谱操作样品渗入凝胶床 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。现在学习的是第35页，共39页收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。洗脱 小心加入物质的量浓度为20 mmolL的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。3.样品加入与洗脱实验操作 （二）凝胶色谱操作问：正确的加样操作，注意什么？1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动现在学习的是第36页，共39页答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。讨论：1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？实验操作 （二）凝胶色谱操作讨论：现在学习的是第37页，共39页 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。讨论：实验操作 （二）凝胶色谱操作现在学习的是第38页，共39页知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原 理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组 成作 用蛋白质的提取分离样品处理粗 分 离纯 化纯度鉴定现在学习的是第39页，共39页