019-微生物限度检查操作规程.doc

文件编号：ZL-SOP-JF-01900 第 7 页 共 6页文件名：微生物限度检查法制定人：制定日期：分发份数：3审核人：审核日期：颁发部门：GMP办批准人：批准日期：生效日期：分发至：质量保证部、质监科、质量检验中心1.目的：规范微生物限度检查操作，以保证检验结果的准确性。2.范围：微生物限度检查。3.责任：质量保证部、质监科、质量检验中心、检验操作人员。4.内容：4.1洁净度级别检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。洁净度级别尘粒数/m3活微生物数(个)/m30.55100级3,5000510000级350,0002000100100000级3,500,00020,000500(GB/T16294-1996)洁净级别个/(90mm，0.5h)100级110000级3100000级104.2浮游菌数测试方法（参照中华人民共和国国家标准GB/T62931996）。4.3沉降菌数测定（法）4.3.1无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经3035预培养48h，证明无菌落生长）。以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各一个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在3035培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。4.3.2无菌操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到100级。净化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。4.4消毒处理 无菌室应在每次操作前、后均用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。4.5其他设备 净化工作台、恒温培养箱(3035)、生化培养箱(2525)，微波炉(或其他适宜加热装置)、康氏振荡器、匀浆仪(30008000r/min)、恒温水浴、电热干燥箱(250300)、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器(使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定)。4.6供试品抽样、保存及检验量4.6.1抽样4.6.1.1一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量（以备复试）。4.6.1.2抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。4.6.1.3凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。4.6.2保存4.6.2.1供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。4.6.2.2供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。4.6.3检验量4.6.3.1 所有剂型的检验时均需取2个以上包装单位。4.6.3.2固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。4.6.3.3液体制剂检验量为10ml。4.6.3.4特殊贵重或微量包装的药品，检查量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。4.7操作方法4.7.1试验前准备4.7.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。4.7.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。4.7.1.3操作人员用肥皂冼手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。 4.7.1.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌手术镊或剪将供试品启封。4.7.2供试液的制备4.7.2.1液体供试品 取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀，作为1：10供试液。4.7.2.2固体、半固体或粘稠供试品 称取供品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入100ml0.9无菌氯化钠溶液，用匀浆仪（30005000r/，24min）,振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。4.7.3供试液的稀释（10倍递增稀释法）4.7.3.1取23支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰将供试管中菌细胞杀灭）。加完稀释剂后，试管塞应立即塞上。4.7.3.2另取1支1ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即为1：100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：10、1：100、1：1000等适宜稀释级（至少共3级），每递增1稀释级，必须另换一支吸管。4.7.3.3在作10倍递增稀释时，吸管插入1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2级稀释管的内壁靠近液面（勿接触液面）缓慢地吹出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒缸内。4.7.4注平皿 在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管），每一稀释级注23个平皿（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时作阴性对照(待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取稀释剂各1ml，分别流氓行为个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照)。4.7.5倾注培养基 将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂）熔化，冷至约45时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀时勿将培养基溅到皿边及皿盖上，置操作台待凝。4.7.6培养 细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养48小时。霉菌、酵母菌计数平板于2528培养箱中培养72小时。4.7.7菌落计数4.7.7.1一般将平板置菌落计数器上或从平地板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。4.7.7.2供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。4.7.7.3试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（12个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。4.7.7.4有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计。4.7.7.5若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界线，一条链作作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。4.7.7.6记录各稀释级平板的菌落数，求出各稀释级2个或3个平板菌落的平均数。当菌落数在15以上的同稀释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为04，17，29，310，412，514，615。超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。4.7.7.7下列情况下、点计菌落时间需提前或延长培养时间：4.7.7.7.1 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在24小时，霉菌点计需在48小时作初步点计（点计霉菌菌落数时，动作宜轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。4.7.7.7.2在48小时点计细菌，72小时点计霉菌时，菌落极小不易辨认，需延长培养时间47 天，再点计菌落数。4.7.7.7.3对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。4.7.7.7.4 供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，一般液体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌及酵母菌总数。4.7.8菌数报告规则4.7.8.1细菌数选取平均菌落数在30300之间的稀释级，霉菌、酵母菌数选取平均菌落数在30100之间的稀释级作为报告菌数的依据。4.7.8.2如只有1个稀释级平均菌落数在30300（30100）之间，则将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。4.7.8.3 如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300（30100）时，则按比值计算。当比值2时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。当比值2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。比值=4.7.8.4如有3个稀释级平均菌落数均在30300（30100）之间，则以后2个稀释级计算级间比值报告。4.7.8.5如各稀级平均菌落数均在300（100）以上，则按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。4.7.8.6 如各稀释级平均菌落数均不在30300（30100）之间，则以最接近30或300（100）的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。4.7.8.7如各稀释级平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小于1时，应报告菌数10个/g或ml。如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，报告未检出霉菌及酵母菌/ml。4.7.8.8当各稀释级平均菌落数均小于30时，如高稀释级平均菌落数大于或等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结果报告菌数。4.7.9培养基稀释法：4.7.9.1取低稀释级供试品（原液或1：10供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。4.7.9.2 5个或5个以上平板点计的菌落之和，即为每1ml菌落数，共得3组数据。以3份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。4.7.10结果报告4.7.10.1菌落数在100以内时，按实有数据报告。4.7.10.2菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。4.7.11. 复试 供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。4.8注意事项4.81. 供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吸。4.8.2. 从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在1小时内完成，避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。4.8.3. 供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液，以免造成实验误差。4.8.4. 为避免细菌菌落蔓延生长，宜采取下列方法处理：4.8.4.1开盖干燥 将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机12小时后合盖，放入培养箱培养；4.8.4.2 换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。4.8.4.3加TTC 于倾注培养基前，在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml（最终浓度为0.001%），混匀后倾注平皿。4.8.4.4一般情况下，以营养琼脂平板计数，玫瑰红钠琼脂平板计数霉菌、酵母菌数。在特殊情况下，如营养琼脂平板生长了霉菌、酵母菌，且多于玫瑰红钠琼脂平板的霉菌和酵母菌菌落数，则以营养琼脂平板的霉菌、酵母菌数报告；反之，如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂平板的细菌菌落数，则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告。如营养琼脂平板生长的霉菌、酵母菌数或玫瑰红钠琼脂平板生长的细菌菌落超过该品种微生物限度规定时，经复试2次，如3次结果的平均值仍超过规定，应判供试品不合格。4.9检验报告书写本品按中国药典2000年微生物限度检查法标准检验，结果符合或不符合规定。 7