2022年食品毒理学实验指导 .pdf

食品毒理学实验指导西南大学食品科学学院名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 10 页 -实验一 血细胞的计数【目的要求】学习红细胞、白细胞计数的方法。【基本原理】血液中血细胞数的计算是使用血细胞计数板。而且要用适当的溶液将血液稀释后，放入计数板的计数室内，在显微镜下计算一定容积血液稀释液中的血细胞个数，再将所得结果换算为1mm3血液中的血细胞个数。【动物与器材】血细胞计数板、玻璃毛细吸管、1ml和 5ml 吸管、表面皿、显微镜、刺血针、酒精棉球、红细胞稀释液、白细胞稀释液。【方法与步骤】1血细胞计数板的结构血细胞计数板为一块特制的长方形厚载玻片，在中部13 面积处有 4 条槽。内侧2 条槽之间还有1 条横槽相通，因此在中部构成2 块长方形平台。此平台比整个载玻片的平面低0.1 mm。平台中部各刻有1 个含 9 个大方格的方格网，为计数室。每 1 个大方格边长1 mm，面积为 1mm2，体积为0.1 mm3。四角的每1 个大方格又被分为16 个中方格，适用于白细胞、血小板和培养细胞的计数。中央的大方格则由双线划分为25 个中方格，每个中方格面积为 0.04mm2，体积为0.004mm3，每个中方格又分成16 个小方格，适用于红细胞、微生物细胞的计数。2采血管采血管为一细长、均匀的毛细玻璃管，其上有 2 个刻度，前端刻度指示的容量为10mm3，后端的为20mm3，尾端与 1个带孔的橡皮吸球相连。3采血及稀释（1）用 1 mL 吸管准确吸取0.38mL 白细胞稀释液，放入1 支干净的小试管内，加塞备用。用 5mL 吸管准确吸取3.98mL 红细胞稀释液，放入另 1 支干净的中试管内，加塞备用。（2）用消毒干棉球醮75乙醇消毒左手无名指或耳垂边缘（或兔的耳缘静脉采血部位），待酒精挥发后用采血针刺入皮肤约23mm深，让血液自然流出。采血时必须待皮肤上的消毒酒精挥发后才能穿刺，否则流出的血液不能成滴，无法吸取。用消毒干棉球拭去第1 滴血液，待流出第2 滴血成大滴时，用采血管吸血至20mm3刻度处。吸血时应注意，不可2名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 10 页 -过度挤压组织以图加速血液流出；吸血时应尽量利用毛细管现象使血液自动进入吸管内。操作要快，以防止血液凝固。若血柱超出规定刻度12mm，可用干棉球轻触管口（此时须执管于水平位置），吸去多余部分，使血液面恰至规定刻度处。拭去附着于吸管尖端外部的血液。若血液面超过规定刻度2mm以上或吸入气泡，则应重新吸取血液。将血液吹入盛有白细胞稀释液的中试管底部，轻轻摇振试管12min，以摇匀稀释的血液。（3）趁出血处尚有血液流出，及时用另一支采血管依同样方法吸血至20mm3刻度处，并将血液吹入盛有红细胞稀释液的中试管底部。轻轻摇振试管12min，以摇匀稀释的血液，但不可用力过猛，以免发生泡沫。4充液2 类血细胞计数分2 次充液，方法如下。（1）取干净的计数板平放于实验桌上，将盖玻片置入计数板正中央。计数板和盖玻片在使用前必须用软绸或擦镜纸擦净，并在低倍镜下检查计数室是否干净，其刻度是否清晰。用小滴管吸取稀释血液，并将管尖轻轻斜置于盖玻片边缘，让稀释血液缓慢流出，借毛细管现象而自动流入计数室内。一般应一次充液使计数室内充满稀释血液，若经几次充液，易形成气泡，应洗净计数板和盖玻片，干燥后重新充液。（2）稀释的血液充入计数室后，静置23min，待细胞不再浮动后，于低倍镜下计数。5计数为防止重复计数和漏数，计数时应遵循一定的顺序进行，即“从左到右，自上而下”；对正好压在格线上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数（图1-2）。如计数白细胞时发现各大方格的白细胞数相差8个以上，计数红细胞时发现各中方格的红细胞数最多与最少相差20 个以上时，则表示血细胞分布不均匀，必须将稀释的血液摇匀后再重新充入计数室计图 1-2 血细胞计数方式实心圈表示应计数的红细胞空心圈表示不应计数的红细胞数。数因为：0。6计算（1）白细胞数将四角的 4 个大方格内数得的白细胞总数乘以50，即得每立方毫米血液内的白细胞总数，也可将对角两个大方格内数得的白细胞总数乘以100。即得每立方毫米血内的白细胞总稀释液 0.38mL 加入血液 20mm3（1mL1000mm3，故 20mm30.02mL,），使血液稀释20 倍，换算成未稀释血时应乘以2在计数时仅统计四角的4 个大方格内的白细胞，其容积为lmm1mm0.1mm 40.4mm3，换算成每立方毫米时应乘以2.5。这样，把四角4 个大方格内数得的白细胞总数乘以 50（即 202.550），即得每立方毫米血内的白细胞总数。（2）红细胞数将中央大方格中的四角和中央的中方格共5 个中方格内数得的红细胞总数乘以10000，即得每立方毫米血内红细胞的总数。因为：稀释液 3.98mL，加入血 20mm3（即 0.02mL），使血液稀释200 倍，换算成未稀释血时应乘以 200。在计数时仅统计0.02 mm3内的红细胞（1 个中方格的容积为0.2mm0.2mm0.1mm 0.004mm3，5 个中方格的容积为0.004mm3 50.02mm3），换算成每立方毫米时应乘以50。这样把 5 个中方格内数得的红细胞总数乘以10 000（即 2005010000），即得每立方毫米血内的红细胞总数。（3）按目前临床上血细胞计数采用的通用单位，将以上所获每毫升血液中所含各血细胞数量换算为各血细胞在每升血液中的数量。3名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 10 页 -7清洗血细胞计数板盖玻片及计数板用过之后，必须立即用水冲洗，但不可用硬物刷洗。计数板晾干或吹风机吹干后，应镜检计数室是否干净，如不干净必须重复洗至干净为止。注：人体红细胞的正常参考值：男性：4.5 5.5 1012/L 女性：3.8 4.6 1012/L 新生儿：6.0 1012/L 以上白细胞计数成人 410109/L 新生儿 1520109/L 血细胞稀释液配制法1白细胞稀释液冰醋酸（破坏红细胞）1.5ml 1%龙胆紫（染白细胞核，便于计数）1ml 蒸馏水加至 100ml 2红细胞稀释液NaCl（维持渗透压）0.5g Na2SO4（使溶液比重增加，红细胞均匀分布不易下沉）2.5g HgCl2（固定红细胞并防腐）0.25g 蒸馏水加至 100ml 草酸盐抗凝剂：其配制方法如下：草酸铵1.2g、草酸钾 0.8g、40%甲醛溶液（防止霉菌生长）1ml、加蒸馏水至100ml。将抗凝剂溶液0.1ml 吸入毛细管中，待溶液水分自然蒸发或稍加温烘干后使用。4名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 10 页 -实验二 急性毒性试验常用染毒方法及半数致死浓度的测定【目的要求】1 掌握动物保定和灌胃染毒的方法 2 掌握半数致死浓度（LD50）霍恩氏法测定方法和结果评定。【基本原理】霍恩氏法利用剂量对数与死亡率的转换数呈直线关系设计的方法，又称平均移动法或剂量递增法。【动物与器材】实验动物：雌雄相同数量的健康成年小鼠 材料：灌胃器材1 套，注射器，苦味酸酒精饱和液，亚硝酸钠，动物称【方法与步骤】1 常用实验动物的保定方法（1）小白鼠的保定小白鼠性情较温顺，挣扎力小，比较容易抓取和保定。抓取时，用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部放在格板或铁笼上。趁着小鼠试图挣脱的瞬间，迅速用另外三个手指压住小鼠的尾巴根部握入手掌；放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠，然后用食指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠，完成抓取保定。注意，抓小鼠尾巴应抓住尾巴中部或根部，不能仅捏住小鼠尾巴的尾端，因为这时小鼠的重量全部集中到尾端，如果小鼠挣扎，有可能弄破尾端。在进行解剖、手术、心脏采血、尾静脉注射时，可将小鼠用线绳捆绑在木板上，或固定在尾静脉注射架及粗试管中。（2）大白鼠的抓取保定抓取大鼠前最好戴上防护手套，右手轻轻抓住大鼠尾巴的中部并提起，迅速放在笼盖上或其它粗糙面上，左手顺势按、卡在大鼠躯干背部，稍加压力向头颈部滑行，以左手拇指和食指捏住大鼠两耳后部的头颈皮肤，其余三指和手掌握住大鼠背部皮肤，完成抓取保定。（3）豚鼠的抓取豚鼠性情温顺，胆小易惊，一般不易伤人。捉拿时，实验人员可先用手轻轻扣、按住豚鼠背部，顺势抓紧其肩胛上方皮肤，拇指和食指环其颈部，用另一只手轻轻托住其臀部，即可将豚鼠抓取保定。抓取豚鼠需讲究稳、准、柔、快，不可过分用力抓捏豚鼠的腰腹部，否则容易造成肝破裂、脾淤血而引起死亡。如果在动物实验操作过程中，豚鼠挣扎剧烈，实验人员遇到这种情况，可以用纱布将豚鼠头部蒙住，把豚鼠置于实验台上，实验人员稍为用力扣、按住豚鼠，然后进行操作。5名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 10 页 -（4）兔的抓取保定家兔驯服不咬人，但四肢的爪尖锐，挣扎时容易抓伤人。抓取保定方法是用右手把两耳拿在手心并抓住颈后部皮肤，提起家兔，然后用左手托住臀部。另一种方法是使用家兔保定栏，打开保定栏的前盖，抓取家兔放进栏内，右手抓住家兔耳朵将头部拉过栏的开孔，迅速关上栏门。假如家兔挣扎，可用手在它的背上轻轻扶摸，使它安静下来，因为家兔挣扎很容易损伤脊柱。需要进行手术时，可将家兔固定在兔实验台上，四肢固定，门齿用细绳栓住，固定在实验台的铁柱上。2 实验动物的选择和性别鉴定（1）外观：健康动物的外观为体形丰满，发育正常，被毛浓密有光泽且紧贴身体。眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲良好。（2）性别鉴定：小鼠的性别主要依据肛门与生殖器之间距离区分，间距大者为雄性，小者为雌性。3 小鼠灌胃染毒法测定亚硝酸钠半数致死浓度（LD50）（1）实验剂量选择本实验在亚硝酸钠的标准LD50 175mg/kg 上下取值，实验取了464，215，100，46.4mg/kg四个剂量。（2）实验动物的性别鉴定、编号和称重每组对本实验组的4 只小鼠分别进行性别鉴定、编号和称重。称重感应量需在0.1g 以下；编号采用染色法，常用苦味酸饱和液为染料。一般从头部开始编号，头部为1 号，按顺时针方向向右前肢为2 号，右肋为3 号，右后肢为4 号，尾部为5 号，左后肢为6 号，左肋为 7 号，左前肢为8 号，背部为9 号，不染色为10 号。（3）亚硝酸钠溶液的配制根据每只小鼠的重量和每组的实验剂量计算出每只小鼠的染毒量，根据灌胃的适量范围用蒸馏水配成0.21.0ml 的溶液，进行灌胃。（4）灌胃染毒将灌胃针与注射器连接后，吸取一定量受试物亚硝酸钠溶液。左手抓住小鼠头和背部皮肤，使鼠呈直力状，右手持注射器，沿小鼠咽喉壁左边经食道将灌胃针插入胃内（深度为34cm），注入受试物亚硝酸钠溶液。（5）观察灌胃后24h的小鼠死亡情况，记录后，根据霍氏 LD50表查得亚硝酸盐的LD50值。4 结果与讨论小鼠灌胃后24h，观察每组的死亡情况如下表。实验组采用小鼠数量灌胃量（mg/kg）存活量死亡量1 4 只46.4 只只2 4 只100 只只3 4 只215 只只4 4 只464 只只6名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 10 页 -实验三 实验动物生物材料的采集及解剖【目的要求】1掌握几种给药方式 2掌握实验动物的采血方法 3掌握小鼠内脏解剖操作【动物与器材】实验动物：成年小鼠 实验器材：解剖剪刀、镊子、解剖板、2ml注射器、玻璃毛细管、酒精棉球等【方法与步骤】1几种给药方法：鼠尾静脉注射给药，皮下注射给药，腹腔注射给药2采血方法（1）鼠尾采血：将动物固定，把鼠尾浸入4550温水中数分钟，使尾静脉充血。用蘸有 75%酒精或碘伏的棉球将尾擦干消毒，剪去尾尖0.20.3cm，拭去第一滴血，让血液自由滴入盛器，或用血红蛋白吸管吸取。然后用干棉球止血。（2）摘眼球取血：一只手抓住小鼠头和背部皮肤，使鼠呈直力位，另一只手用镊子将鼠眼夹出，将眼角流出的血装入盛器。3小鼠内脏解剖用颈椎脱位法将小鼠处死并置仰卧位，用水浸湿腹部、胸部皮毛。从下颌骨中央至趾骨联合上缘作一正中切口，剪断左右肋骨，将胸骨向前上方翻开，即可暴露胸、腹腔。依次观察各脏器的形态、位置及彼此间的关系，然后分别取下各脏器。【结果与讨论】1 几种给药方式中，在小鼠的不同部位给药，给药速率不同，静脉注射最大，其次是腹腔注射，接着是皮下注射。注射时应小心谨慎，不能刺破动物的内脏，并且应控制注射液种类及注射量。2 实验动物均有最大安全采血量和最小致死采血量，一次采血过多或过于频繁，都可影响动物健康，甚至死亡。本实验分别介绍了从小鼠的鼠尾采血和摘眼球的方法取血的方法。鼠尾采血在所需血量很少时采用，而摘眼球取血在需血量大时采用。采血时可在盛器中放入凝血剂防止凝血。摘眼球取血可以作为处死动物的方法。（摘眼球取血方法比较残忍，不在必须使用时不建议使用。）常用实验动物的安全采血量动物品种最大安全采血量（ml）最小采血致死量（ml）7名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 7 页，共 10 页 -小鼠0.1 0.3 大鼠1.0 2.0 3 实验对小鼠的分别进行了胸腔和腹腔的解剖，分别取得了胸腔中的心脏、胸腺、肺泡，腹腔中胃、肝、胆、胰腺、左右肾、脾、肠等器官。并且观察到小鼠内脏和外皮之间有一层薄膜间隔，胸腔和腹腔之间也有一层薄膜间隔。取脏器时动作要轻，以免损伤组织。4 实验时应小心抓动物，动作要轻柔，以免被动物咬伤，一旦被动物咬伤应立即消毒，并做进一步处理。5 实验结束后，应按规定处理动物尸体。8名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 8 页，共 10 页 -实验四 小鼠骨髓细胞微核标本制备【目的要求】学习小鼠骨髓细胞微核标本制备和计数的方法。【基本原理】微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。这种情况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果。另外，也可能在受到纺缍体毒物的作用时，主核没有能够形成，代之以一组小核。此时小核往往比一般典型的微核稍大。【动物与器材】小鼠（712 周龄，体重 2530g），解剖器械，生物显微镜，载玻片，小牛血清，Giemsa 应用液，甲醇（分析纯）。【方法与步骤】1剂量及分组受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2 LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4 和 1/8 LD50作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量(最大使用浓度和最大灌胃容量)动物无死亡而求不出 LD50 时，高剂量组则以以下顺序（1）10g/kgBW；（2）人的可能摄入量的100 倍；或（3）一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kgBW 经口或腹腔注射（首选经口）给予。2.操作步骤（1）受试物配制一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浮液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。（2）实验动物的处理经口灌胃。根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。常用30 h 给受试物法。即两次给受试物间隔24 h，第二次给受试物后6 h，颈椎脱臼处死动物。（3）标本制备取胸骨或股骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片，或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定510 min。当日固定后保存。将固定好的涂片放入Giemsa 应用液中，染色10 15 min。立即用pH6.8 的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。写好标签，阴凉干燥处保存。（4）阅片选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，在油镜下观察。以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。本法系观察嗜多染红细胞的微核。用Giemsa 染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/201/5。用双盲法阅片。每只动物计数1000 个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。观察嗜多染红细胞与成熟红细胞（PCE/RBC），可作为细胞毒性指标之一。一般计数200 个嗜多染红细胞。受试物组未成熟红细胞占红细胞总数的比例不应少于对照组的20。3.数据处理9名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 9 页，共 10 页 -一般采用卡方检验、泊松分布、或双侧 t 检验等统计方法进行数据处理，并按动物性别分别统计。4.结果评价试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。一般阴性对照组的微核率5，供参考。但应有本试验室所用实验动物的自发微核率作参考。注：小牛血清：小牛血清滤菌后放入 56 恒温水浴保温1 h 进行灭活。通常储存于 4 冰箱里。亦可用大、小鼠血清代替。Giemsa 染液：称取 Giemsa 染液 3.8 g，加入 375 mL 甲醇（分析纯）研磨，待完全溶解后，再加入 125 mL 甘油。置 37 恒温箱保温 48 h 振摇数次。过滤两周后用。Giemsa 应用液：取 1 份 Giemsa 染液与 6 份磷酸盐缓冲液混合而成。临用时配制。1/15 moL/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50 g 磷酸二氢钠 Na2HPO4.12H2O 11.81 g 加蒸馏水至 1000 mL 微核图片：10名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 10 页，共 10 页 -