昆虫病原细菌的利用精选PPT.ppt

关于昆虫病原细菌的利用第1页，讲稿共65张，创作于星期二 自然界中，细菌种类繁多，数量大，分布广泛，自然界中，细菌种类繁多，数量大，分布广泛，其中能使昆虫感染致病的虫生细菌相当多，昆虫因细其中能使昆虫感染致病的虫生细菌相当多，昆虫因细菌而引起的疾病称为菌而引起的疾病称为细菌病细菌病。细菌病有多种，但细菌病有多种，但细菌病有其共同的特征细菌病有其共同的特征，即，即当昆虫感病后，不大活动，食欲减退，口腔及肛门常当昆虫感病后，不大活动，食欲减退，口腔及肛门常有排泄物，病原菌侵入体腔后引起败血症。死后虫体有排泄物，病原菌侵入体腔后引起败血症。死后虫体色加深，一般都有一股臭味色加深，一般都有一股臭味。由于体都软化腐烂，所。由于体都软化腐烂，所以通称为以通称为软化病软化病。第2页，讲稿共65张，创作于星期二一、昆虫病原细菌的主要类群 BucherBucher（19601960）分为专性病原细菌、产生晶体的）分为专性病原细菌、产生晶体的芽孢杆菌、兼性病原细菌和潜势病原细菌。芽孢杆菌、兼性病原细菌和潜势病原细菌。通常分为通常分为3 3类：类：专性专性 兼性兼性 潜势病原细菌潜势病原细菌 第3页，讲稿共65张，创作于星期二o（一）专性昆虫病原细菌（Obligate entomopathogenic bacteria）只能在寄主细胞中生长繁殖，不能在人工培只能在寄主细胞中生长繁殖，不能在人工培养基上正常生长养基上正常生长，一般经口服传染。自然界中寄，一般经口服传染。自然界中寄主范围较窄。主范围较窄。日本金龟子芽孢杆菌（日本金龟子芽孢杆菌（Bacillus popilliae）天幕毛虫芽孢杆菌（天幕毛虫芽孢杆菌（Clostridium malacosomae）第4页，讲稿共65张，创作于星期二Bacillus popilliae第5页，讲稿共65张，创作于星期二o（二）兼性病原细菌（Facultative entomopathogenic bacteria）可在昆虫体以外的生境中增殖，也能在人工培养基上正常生长发育的细菌。包括产孢和不产孢的杆菌。寄主范围较广。苏云金杆菌苏云金杆菌BtBt 粘质沙雷氏菌等粘质沙雷氏菌等 第6页，讲稿共65张，创作于星期二o（三）潜势病原菌（Potential entomopathogenic bacteria）普遍存在于昆虫的消化道中，主要是一些不普遍存在于昆虫的消化道中，主要是一些不产生芽孢的杆菌。由于毒素和酶的产生数量少，产生芽孢的杆菌。由于毒素和酶的产生数量少，难以侵入体腔内给宿主造成危害。难以侵入体腔内给宿主造成危害。第7页，讲稿共65张，创作于星期二o（四）细菌杀虫剂的特点（1）毒力高毒力高。菌剂毒力足以压倒害虫的抗病力，能够。菌剂毒力足以压倒害虫的抗病力，能够稳定可靠地使害虫发病致死；稳定可靠地使害虫发病致死；（2）稳定性稳定性。菌剂不致因受自然环境影响（如日光、。菌剂不致因受自然环境影响（如日光、干燥等）、人工处理、悬浮剂、载体、贮藏、不同施干燥等）、人工处理、悬浮剂、载体、贮藏、不同施药方式等而减低杀虫效力；药方式等而减低杀虫效力；第8页，讲稿共65张，创作于星期二（3 3）残效期长）残效期长，并有在害虫种群中自然传播的能力；，并有在害虫种群中自然传播的能力；（4 4）作用迅速）作用迅速；（5 5）有选择性）有选择性。即对防治对象剧毒，而对植物、。即对防治对象剧毒，而对植物、益虫以及哺乳动物等无毒；益虫以及哺乳动物等无毒；（6 6）可以大规模生产，经济安全）可以大规模生产，经济安全。第9页，讲稿共65张，创作于星期二二、金龟子乳状病芽孢杆菌 DutkyDutky（19401940）报道日本金龟子芽孢杆菌（）报道日本金龟子芽孢杆菌（B.B.popilliaepopilliae）能引起日本金龟子等幼虫的）能引起日本金龟子等幼虫的乳状病乳状病（Milky diseaseMilky disease）。其后世界各国从不同金龟子幼。其后世界各国从不同金龟子幼虫分离出乳状病原细菌多种。虫分离出乳状病原细菌多种。用金龟子芽孢杆菌防治日本金龟子是生物防治用金龟子芽孢杆菌防治日本金龟子是生物防治最典型的例子之一最典型的例子之一。第一个日本金龟子芽孢杆菌制剂。第一个日本金龟子芽孢杆菌制剂于于19501950年在美国登记，成为美国政府批准的第一个生年在美国登记，成为美国政府批准的第一个生物防治制剂。物防治制剂。第10页，讲稿共65张，创作于星期二Grub infected with milky disease(left)caused by a bacterium call Bacillus popilliae第11页，讲稿共65张，创作于星期二第12页，讲稿共65张，创作于星期二o1 1、侵染过程、侵染过程 金龟子芽孢杆菌主要金龟子芽孢杆菌主要通过芽孢感染和传播，通过芽孢感染和传播，芽孢经口摄入芽孢经口摄入。当幼虫吞食芽孢后，芽孢在肠道中。当幼虫吞食芽孢后，芽孢在肠道中萌发成杆状的营养细胞，营养细胞侵染中肠细胞，萌发成杆状的营养细胞，营养细胞侵染中肠细胞，随后穿过肠壁进入体腔，大量繁殖，形成芽孢，使随后穿过肠壁进入体腔，大量繁殖，形成芽孢，使幼虫的血淋巴呈乳状，死亡幼虫呈乳白色，故称为幼虫的血淋巴呈乳状，死亡幼虫呈乳白色，故称为乳状病乳状病（Milky disease）。第13页，讲稿共65张，创作于星期二o2 2、致病机制、致病机制 尚不清楚，主要有两种观点尚不清楚，主要有两种观点 由于细菌在生长过程中利用了昆虫的大量营由于细菌在生长过程中利用了昆虫的大量营养物质和多种生长素，致使昆虫不能正常发养物质和多种生长素，致使昆虫不能正常发育。育。破坏了昆虫的某种酶系统，从而抑制了寄主破坏了昆虫的某种酶系统，从而抑制了寄主昆虫的生活机能。昆虫的生活机能。第14页，讲稿共65张，创作于星期二o3、培养繁殖 金龟子芽孢杆菌的芽孢能在寄主体外存活，营养体也能在金龟子芽孢杆菌的芽孢能在寄主体外存活，营养体也能在人工培养基上生长繁殖，但却不能在人工培养基上正常地形成人工培养基上生长繁殖，但却不能在人工培养基上正常地形成芽孢芽孢。因此，商品制剂。因此，商品制剂DoomDoom、JapidemicJapidemic和和Milky SporeMilky Spore都是都是采用幼虫活体培养的方法制备采用幼虫活体培养的方法制备的。的。3龄幼虫龄幼虫 饲育缸 微量注射，微量注射，3ml/头头100万芽孢万芽孢/ml 研碎，稀释，研碎，稀释，晾干、包装晾干、包装 1-3周周1亿芽孢亿芽孢/g菌剂菌剂第15页，讲稿共65张，创作于星期二4 4、应用研究、应用研究o由于芽孢在土壤中能长期存活，感病死亡后的蛴螬又由于芽孢在土壤中能长期存活，感病死亡后的蛴螬又会不断增加土壤中的芽孢数量，因此疾病一旦形成，会不断增加土壤中的芽孢数量，因此疾病一旦形成，芽孢便能在土壤中逐渐累积和传播，从而达到长期控芽孢便能在土壤中逐渐累积和传播，从而达到长期控制的效果。制的效果。利用金龟子芽孢杆菌防治蛴螬是一种利用金龟子芽孢杆菌防治蛴螬是一种有效的生物防治法。有效的生物防治法。o美国在美国在1313个州和哥伦比亚地区利用金龟子芽孢杆菌防治蛴个州和哥伦比亚地区利用金龟子芽孢杆菌防治蛴螬面积达螬面积达1010余万英亩，防治效果为余万英亩，防治效果为60608080。第16页，讲稿共65张，创作于星期二5 5、注意事项、注意事项o土壤中含菌量与乳状病感病率成正相关土壤中含菌量与乳状病感病率成正相关。如每千克土。如每千克土壤含芽孢壤含芽孢4104109 9个，乳状病发病率为个，乳状病发病率为8282,每千克土每千克土壤含壤含0.25100.25109 9个芽孢时，则发病率仅为个芽孢时，则发病率仅为4444。o温度条件温度条件。乳状病发病适温为。乳状病发病适温为28-3028-30，如温度低于，如温度低于1616，几乎不发病。，几乎不发病。第17页，讲稿共65张，创作于星期二三、球性芽孢杆菌 球形芽孢杆菌球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)在自然界分布广泛，在自然界分布广泛，大多数菌株对昆虫没有毒性，但有一些对大多数菌株对昆虫没有毒性，但有一些对蚊幼虫有高毒力，蚊幼虫有高毒力，它的毒效成分在细胞内，不分泌到细胞外的培养液中它的毒效成分在细胞内，不分泌到细胞外的培养液中。因此，。因此，只有昆虫吞食细胞后才显示毒性。只有昆虫吞食细胞后才显示毒性。第18页，讲稿共65张，创作于星期二1 1、球形芽孢杆菌的毒素、球形芽孢杆菌的毒素（1 1）二元毒素（）二元毒素（Binary Toxin,BtxBinary Toxin,Btx）o分子量为分子量为42kDa42kDa和和51kDa51kDa的蛋白质，的蛋白质，只有当两种蛋白只有当两种蛋白质在一起时才产生毒性质在一起时才产生毒性，两种蛋白等量时达到最大两种蛋白等量时达到最大杀蚊毒效。杀蚊毒效。它的伴孢晶体被部分地包在芽孢外壁之它的伴孢晶体被部分地包在芽孢外壁之中，使得芽孢和伴孢晶体在离体的条件下仍是一个中，使得芽孢和伴孢晶体在离体的条件下仍是一个整体。整体。o目前已对多个菌株的二元毒蛋白基因进行了测序。目前已对多个菌株的二元毒蛋白基因进行了测序。第19页，讲稿共65张，创作于星期二（2 2）蛋白毒素（）蛋白毒素（Mtx）o在营养生长期产生的蛋白质，同芽孢的合成无关。在营养生长期产生的蛋白质，同芽孢的合成无关。MtxMtx毒素不稳定，热处理、反复冻熔都会严重影响其杀毒素不稳定，热处理、反复冻熔都会严重影响其杀蚊活性。蚊活性。o这种蛋白的基因已被克隆和作序列分析。这种蛋白的基因已被克隆和作序列分析。第20页，讲稿共65张，创作于星期二o2 2、球形芽孢杆菌的杀虫范围球形芽孢杆菌的杀虫范围 球形芽孢杆菌的杀虫范围仅限于蚊虫的幼虫，球形芽孢杆菌的杀虫范围仅限于蚊虫的幼虫，它通过取食过程进行感染，蚊子的幼虫在取食它通过取食过程进行感染，蚊子的幼虫在取食8-8-12h12h后，即可发生死亡，幼虫吞入球状芽孢杆菌后，后，即可发生死亡，幼虫吞入球状芽孢杆菌后，菌体在肠道中被消化，细胞壁破裂，菌体内的毒素释菌体在肠道中被消化，细胞壁破裂，菌体内的毒素释放出来，从而杀死蚊虫的幼虫。放出来，从而杀死蚊虫的幼虫。第21页，讲稿共65张，创作于星期二o3 3、球形芽孢杆菌的利用球形芽孢杆菌的利用 球形芽孢杆菌在昆虫死后，可以在虫尸中重新增殖，球形芽孢杆菌在昆虫死后，可以在虫尸中重新增殖，芽孢的数目增加芽孢的数目增加。球形芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体在环境球形芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体在环境中持效期较长，并有可能在环境中再循环。中持效期较长，并有可能在环境中再循环。因此，从因此，从2020世纪世纪8080年代中后期开始，球形芽孢杆菌高年代中后期开始，球形芽孢杆菌高毒菌株的筛选工作开始受到重视。迄今为止，美国、法毒菌株的筛选工作开始受到重视。迄今为止，美国、法国及我国等国及我国等1010个国家研制了不同剂型的产品个国家研制了不同剂型的产品1010余种，主余种，主要用于杀蚊幼虫的效果评价。要用于杀蚊幼虫的效果评价。第22页，讲稿共65张，创作于星期二o目前使用最多的目前使用最多的球形芽孢杆菌制剂主要是乳剂和粉球形芽孢杆菌制剂主要是乳剂和粉剂。剂。第23页，讲稿共65张，创作于星期二四、苏云金杆菌 苏云金芽孢杆菌（苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）最早最早发现于发现于19021902年，年，19381938年世界上第一个年世界上第一个Bt制剂制剂SporeineSporeine在法在法国问世，从而掀开了苏云金芽孢杆菌杀虫剂生产的序幕。国问世，从而掀开了苏云金芽孢杆菌杀虫剂生产的序幕。近近1010年来，年来，Bt已成为加拿大控制枞色卷蛾（已成为加拿大控制枞色卷蛾（Spruce budworm）的主要手段。在其它国家，）的主要手段。在其它国家，Bt运用于控制毛虫、运用于控制毛虫、吉卜赛毒蛾（吉卜赛毒蛾（gypsy mothsgypsy moths）等。目前全世界约有）等。目前全世界约有Bt杀虫杀虫剂剂100100多个品种，年销售额近多个品种，年销售额近1 1亿美元。亿美元。第24页，讲稿共65张，创作于星期二This leafroller caterpillar died after ingesting Bacillus thuringiensis.Discolouration of the gut,as seen here,is typical of mortality from Bacillus thuringiensis第25页，讲稿共65张，创作于星期二（一）基本特征o1 1、形态特征、形态特征o（1 1）营养期）营养期 G G+的好气性芽孢杆菌的好气性芽孢杆菌，两端钝圆，周生鞭毛，能运两端钝圆，周生鞭毛，能运动，少数无鞭毛，营养体单动，少数无鞭毛，营养体单个存在或个存在或2-52-5个成链状。内个成链状。内生芽孢椭圆形或圆形。生芽孢椭圆形或圆形。第26页，讲稿共65张，创作于星期二o营养体为繁殖阶段，横裂生殖营养体为繁殖阶段，横裂生殖，对数生殖期往往，对数生殖期往往2 2、4 4、8 8个或更多的营养体连在一起成串状。个或更多的营养体连在一起成串状。此时繁殖快、此时繁殖快、代谢旺盛，适于用作接种材料。代谢旺盛，适于用作接种材料。营养体在芽孢出现营养体在芽孢出现前先停止繁殖，细胞质浓缩，出现液泡和微粒，前先停止繁殖，细胞质浓缩，出现液泡和微粒，并逐渐形成芽孢和伴孢晶体。并逐渐形成芽孢和伴孢晶体。第27页，讲稿共65张，创作于星期二o（2）孢子囊期 当菌体成长老熟时，其一端斜生一个椭圆形的芽当菌体成长老熟时，其一端斜生一个椭圆形的芽孢，另一端同时出现菱形孢，另一端同时出现菱形(或其他形状或其他形状)的晶体即的晶体即伴孢伴孢晶体晶体(Parasporal crystal)(Parasporal crystal)，是其主要的活性成分是其主要的活性成分，伴孢晶体由不同分子量的多肽伴孢晶体由不同分子量的多肽原毒素（原毒素（protoxinprotoxin）组成）组成，此时为孢子囊期。，此时为孢子囊期。孢子囊呈长卵圆形，比营养体粗壮。用石炭酸复孢子囊呈长卵圆形，比营养体粗壮。用石炭酸复红染色时，营养体为红色，晶体深红色，而红染色时，营养体为红色，晶体深红色，而芽孢不着芽孢不着色仅见具有轮廓的折光体色仅见具有轮廓的折光体。第28页，讲稿共65张，创作于星期二Bacillus thuringiensis spore and protein crystals第29页，讲稿共65张，创作于星期二o（3）芽孢和伴孢晶体的释放 孢子囊孢子囊到一定时间后破裂，释放出游离的芽孢到一定时间后破裂，释放出游离的芽孢和杀虫晶体蛋白。和杀虫晶体蛋白。芽孢是细菌的休眠体芽孢是细菌的休眠体，对高温、干燥等不良环境条件有较强，对高温、干燥等不良环境条件有较强的抵抗力，菌剂即以芽孢粉状态可以长期贮存。的抵抗力，菌剂即以芽孢粉状态可以长期贮存。芽孢遇适宜条件可萌发成新的营养体。芽孢遇适宜条件可萌发成新的营养体。伴孢晶体内含蛋白质毒素，是杀虫的主要有效物质。伴孢晶体内含蛋白质毒素，是杀虫的主要有效物质。第30页，讲稿共65张，创作于星期二2 2、培养特征、培养特征o苏云金杆菌能在多种培养基上生长，苏云金杆菌能在多种培养基上生长，在不同的培养基在不同的培养基上形成的茵落形态有所不同上形成的茵落形态有所不同。o苏云金杆菌的苏云金杆菌的不同变种不同变种在相同的固体培养基上，培在相同的固体培养基上，培养性状基本上颇为近似，但也表现有一定程度的差养性状基本上颇为近似，但也表现有一定程度的差异。异。第31页，讲稿共65张，创作于星期二3 3、生理特性、生理特性oBtBt.对营养条件要求不高。对营养条件要求不高。碳源：碳源：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖等。淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖等。氮源：氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉，玉米浆等。粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉，玉米浆等。无机盐：无机盐：磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙等。碳酸钙等。oBtBt.在在12-4012-40间的温度条件下都能生长，以间的温度条件下都能生长，以27-3227-32较为适较为适宜宜，35-4035-40生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。o该菌适于微碱性条件，最适该菌适于微碱性条件，最适pHpH是是7.57.5，当，当pHpH达达8.58.5时还能正常形时还能正常形成芽孢，如成芽孢，如pHpH降至降至5 5以下则不能形成芽孢。以下则不能形成芽孢。第32页，讲稿共65张，创作于星期二o4 4、苏云金芽孢杆菌的类群苏云金芽孢杆菌的类群 根据根据营养细胞鞭毛抗原的血清学反应营养细胞鞭毛抗原的血清学反应及其它特性，苏及其它特性，苏云金芽孢杆菌可划分为云金芽孢杆菌可划分为7171个血清型和个血清型和8888个血清型亚种。个血清型亚种。到目前为止，已发现苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体蛋白到目前为止，已发现苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体蛋白至少对脊椎动物中至少对脊椎动物中4 4个门和节肢动物门中个门和节肢动物门中9 9个目的有害生物有活个目的有害生物有活性。性。少数苏云金杆菌产生外毒素（少数苏云金杆菌产生外毒素（exotoxinexotoxin）血清，对家蝇亦）血清，对家蝇亦有毒性。有毒性。第33页，讲稿共65张，创作于星期二o5 5、苏云金杆菌不同亚种或菌株对昆虫的致病性和毒、苏云金杆菌不同亚种或菌株对昆虫的致病性和毒力的差异力的差异 苏云金杆菌的不同亚种对昆虫的毒力差异很大。苏云金杆菌的不同亚种对昆虫的毒力差异很大。即使是同一个亚种，不同菌株对昆虫的毒力差异即使是同一个亚种，不同菌株对昆虫的毒力差异也可以很大。也可以很大。毒力的大小与产生的毒素有关，也与毒力的大小与产生的毒素有关，也与细菌的致病机制和寄主昆虫的特异性有关。细菌的致病机制和寄主昆虫的特异性有关。第34页，讲稿共65张，创作于星期二（二）苏云金杆菌的毒素和致病机理o1、苏云金杆菌的毒素 苏云金杆菌能产生对多种昆虫或其他无脊椎动物有苏云金杆菌能产生对多种昆虫或其他无脊椎动物有害的活性成分，这些害的活性成分，这些活性成分是其杀虫的核心活性成分是其杀虫的核心。目前，。目前，已从已从BtBt中发现了中发现了1010几种有不同功能的生物活性成几种有不同功能的生物活性成分。分。第35页，讲稿共65张，创作于星期二o（1）杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP）伴孢晶体（伴孢晶体（Parasporal crystalParasporal crystal）、伴孢晶体包含体）、伴孢晶体包含体（Parasporal crystal inclusion bodyParasporal crystal inclusion body）、晶体蛋白）、晶体蛋白（Crystal proteinCrystal protein）、晶体毒素（）、晶体毒素（Crystal toxinCrystal toxin），又称），又称-内毒素，是苏云金杆菌具有杀虫性能的主要毒素内毒素，是苏云金杆菌具有杀虫性能的主要毒素。ICPICP由由cry基因和基因和cyt基因编码基因编码，这些基因大多位于染色体外的，这些基因大多位于染色体外的质粒上。质粒上。ICPICP的分子量的分子量27-140kDa,27-140kDa,形状各异。形状各异。BtBt的杀虫活性与的杀虫活性与ICPICP的形状、结构、大小密切相关的形状、结构、大小密切相关。第36页，讲稿共65张，创作于星期二 ICP ICP基因的命名基因的命名o1981年年Schnepf从从HD-1中克隆到了第中克隆到了第1个个ICP基因。基因。o1998年年Crickmore依据依据ICPICP基因的核苷酸序列及其演基因的核苷酸序列及其演化关系，将化关系，将ICPICP基因分为基因分为4 4级级。o20092009年年8 8月，月，ICPICP基因按照基因按照核苷酸序列的同源性核苷酸序列的同源性已被已被分为分为cry1-cry59,cyt1和和cyt2共共61类，类，487个，其中个，其中cry基因基因460个，个，cyt基因基因27个。个。第37页，讲稿共65张，创作于星期二ICP的三维结构及功能的三维结构及功能oICP中最先获得三维结构的是鞘翅目昆虫特异性毒素蛋白中最先获得三维结构的是鞘翅目昆虫特异性毒素蛋白Cry3A，接着又获得鳞翅目昆虫特异性毒素蛋白，接着又获得鳞翅目昆虫特异性毒素蛋白Cry1Aa的三维的三维结构。结构。结构域结构域：由：由8 8个个螺旋组成，与细胞膜插入及孔隙形成螺旋组成，与细胞膜插入及孔隙形成有关；有关；结构域结构域：由：由3 3个个折叠片和折叠片和2 2个短的个短的螺旋组成，与昆螺旋组成，与昆虫上皮细胞表面毒素受体的结合有关；虫上皮细胞表面毒素受体的结合有关；结构域结构域：由：由2 2个个折叠片形成一个面对面的折叠片形成一个面对面的夹层结夹层结构，具有毒素的稳定性、特异性与结合有关。构，具有毒素的稳定性、特异性与结合有关。第38页，讲稿共65张，创作于星期二（2）营养期杀虫蛋白（）营养期杀虫蛋白（Vegetative insecticidal protein，VIP）o是专指营养期表达的杀虫蛋白。是专指营养期表达的杀虫蛋白。o具有热不稳定性的可溶蛋白，具有热不稳定性的可溶蛋白，95处理处理20min便便失去活性。失去活性。o2009年年8月，有月，有65个个vip基因被鉴定分离。基因被鉴定分离。VIP由由vip1、vip2、vip3三种基因编码，杀虫活性各不相同，且在三种基因编码，杀虫活性各不相同，且在氨基酸序列的进化上与氨基酸序列的进化上与ICP没有任何同源性。没有任何同源性。第39页，讲稿共65张，创作于星期二oVip3A以可溶性蛋白的形式存在于害虫中肠，与中肠以可溶性蛋白的形式存在于害虫中肠，与中肠上皮细胞上的受体结合，形成稳定的离子通道，破坏上皮细胞上的受体结合，形成稳定的离子通道，破坏中肠形成孔洞，造成昆虫死亡中肠形成孔洞，造成昆虫死亡。对夜蛾科害虫具有对夜蛾科害虫具有广谱的杀虫活性。广谱的杀虫活性。o一些对一些对Bt杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫对杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫对Vip3A都较为敏感，都较为敏感，如如Vip3A对小地老虎的毒性要比对小地老虎的毒性要比Cry1Ac高高260多倍。多倍。第40页，讲稿共65张，创作于星期二（3）-外毒素（苏云金素外毒素（苏云金素thuringiensin）o是是Bt在生产阶段产生的一种热稳定（在生产阶段产生的一种热稳定（121处理处理15min，杀虫毒，杀虫毒力不降低）、低分子量（力不降低）、低分子量（701kDa）腺嘌呤核苷酸衍生物，主）腺嘌呤核苷酸衍生物，主要存在于要存在于Bt血清型血清型H1菌株中。菌株中。o它是一种胞外因子，对蝇类毒力高，称为它是一种胞外因子，对蝇类毒力高，称为“蝇因子蝇因子”或或“蝇毒素蝇毒素”；对紫外线稳定。；对紫外线稳定。o杀虫谱较杀虫晶体蛋白广，对线虫、螨类均有毒杀作用。主要通杀虫谱较杀虫晶体蛋白广，对线虫、螨类均有毒杀作用。主要通过抑制过抑制RNA聚合酶的活性阻断聚合酶的活性阻断RNA合成导致昆虫死亡，因合成导致昆虫死亡，因而对人类和动物有一定毒性。而对人类和动物有一定毒性。第41页，讲稿共65张，创作于星期二（4 4）双效菌素（）双效菌素（zwittermicia A）o即即ZwA因子，是在因子，是在BtBt和蜡质芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌Bacillus cereus(Bc)(Bc)中发现的一种线形氨基多元醇类化合物。中发现的一种线形氨基多元醇类化合物。o可溶于水，碱性条件下易水解，对热敏感。可溶于水，碱性条件下易水解，对热敏感。o可抑制子囊菌、担子菌的生长。可抑制子囊菌、担子菌的生长。o虽然其杀虫活性低，但对虽然其杀虫活性低，但对BtBt的其他杀虫活性物质具增的其他杀虫活性物质具增效作用，特别是与许多效作用，特别是与许多ICPICP混用时，不但具高的增效混用时，不但具高的增效作用，还可减缓害虫的抗性。作用，还可减缓害虫的抗性。o双效菌素化学结构简单，可以人工合成，具有很好的开发双效菌素化学结构简单，可以人工合成，具有很好的开发利用前景。利用前景。第42页，讲稿共65张，创作于星期二2 2、苏云金杆菌致病机理苏云金杆菌致病机理o苏云金杆菌对昆虫的致病作用主要是通过昆虫食入菌苏云金杆菌对昆虫的致病作用主要是通过昆虫食入菌剂而引起的剂而引起的。菌剂包括芽孢和细菌所产生的毒素。菌。菌剂包括芽孢和细菌所产生的毒素。菌体本身的繁殖可导致害虫的死亡，而昆虫能在短时间体本身的繁殖可导致害虫的死亡，而昆虫能在短时间内死亡往往是苏云金杆菌产生的毒素所致。内死亡往往是苏云金杆菌产生的毒素所致。o苏云金杆菌对多种昆虫能引起发病而致死，但对另苏云金杆菌对多种昆虫能引起发病而致死，但对另一些昆虫则致病力很差，甚至没有作用。一些昆虫则致病力很差，甚至没有作用。第43页，讲稿共65张，创作于星期二ICP的致病机理的致病机理o首先首先溶解在昆虫的中肠中，溶解在昆虫的中肠中，ICP被昆虫的中肠蛋白酶加被昆虫的中肠蛋白酶加工成有活性的毒素；工成有活性的毒素；随后随后被激活的被激活的ICP结合到中肠上皮结合到中肠上皮细胞的刷状缘膜上的特异受体上；细胞的刷状缘膜上的特异受体上；最后最后ICP与受体结合与受体结合从而引起毒素构象变化，并使之能够融合到中肠膜上，从而引起毒素构象变化，并使之能够融合到中肠膜上，使膜形成孔隙和离子通道，导致昆虫死亡。使膜形成孔隙和离子通道，导致昆虫死亡。o昆虫对昆虫对ICP抗性的产生往往就是因为受体结构的改变。抗性的产生往往就是因为受体结构的改变。第44页，讲稿共65张，创作于星期二Whalon and Winge,2003第45页，讲稿共65张，创作于星期二（三）Bt内毒素的利用o1、含Bt内毒素新菌株的利用 从20世纪80年代中后期开始，利用DNA重组技术对毒素基因进行改造，构建综合性能优良的重组菌株已成为国外各大生物农药公司的目标，目前已有10余种遗传重组杀虫剂被批准进行后期田间试验。通过构建重组菌株可以实现以下目标：（1）扩大杀虫谱；（2）延长杀虫毒素的持效期及改进释放性能；（3）提高毒力和杀虫晶体蛋白的产量。第46页，讲稿共65张，创作于星期二o2、含Bt内毒素的转基因作物的利用 19811981年，年，SchnepfSchnepf等人首次成功地克隆了第一个编码等人首次成功地克隆了第一个编码BtBt杀杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。目前全世界总共已获得了目前全世界总共已获得了5050多种转多种转BtBt杀虫晶体蛋白基因植物，杀虫晶体蛋白基因植物，其中以双子叶植物居多，而单子叶植物由于其遗传转化较其中以双子叶植物居多，而单子叶植物由于其遗传转化较困难困难，所以获得的转，所以获得的转BtBt基因的植物就相对较少。在已获得的转基因的植物就相对较少。在已获得的转BtBt杀虫晶体蛋白基因植物中，绝大多数植物对靶标昆虫产生了强杀虫晶体蛋白基因植物中，绝大多数植物对靶标昆虫产生了强烈的毒杀作用，有效地减少了害虫损失。烈的毒杀作用，有效地减少了害虫损失。第47页，讲稿共65张，创作于星期二第48页，讲稿共65张，创作于星期二第49页，讲稿共65张，创作于星期二2004年全球转年全球转基因玉米、大豆、基因玉米、大豆、棉花和其它作物棉花和其它作物播种面积达到了播种面积达到了2亿英亩，比亿英亩，比2003年的年的1.67亿英亩增长了亿英亩增长了20%。第50页，讲稿共65张，创作于星期二第51页，讲稿共65张，创作于星期二Unsprayed,non-transgenic cotton(left)and unsprayed Bt(Cry 1Ac)cotton(right)prior to harvest 第52页，讲稿共65张，创作于星期二转基因作物的优点转基因作物的优点：（1 1）己发现的高水平的己发现的高水平的BtBt抗性基因都是隐性基因，在植物体内抗性基因都是隐性基因，在植物体内可稳定地遗传与表达；可稳定地遗传与表达；（2 2）杀虫蛋白对昆虫的幼虫特别有效，可实现虫害的早期）杀虫蛋白对昆虫的幼虫特别有效，可实现虫害的早期防治；防治；（3 3）可实现植物的整株保护，尤其是化学药剂喷施不到的部）可实现植物的整株保护，尤其是化学药剂喷施不到的部位的防治（如钻心虫）位的防治（如钻心虫）（4 4）对人、畜及非靶标动物群休无害，不会破坏生态平衡。）对人、畜及非靶标动物群休无害，不会破坏生态平衡。由于毒蛋白存留在植物组织中，不会污染环境；由于毒蛋白存留在植物组织中，不会污染环境；（5 5）抗性持久，不易被环境因素所破坏。）抗性持久，不易被环境因素所破坏。第53页，讲稿共65张，创作于星期二o3 3、害虫对害虫对BtBt的抗性的抗性 自自20世纪世纪90年代以来，在美国、泰国、马来西年代以来，在美国、泰国、马来西亚、日本、中国等先后发现亚、日本、中国等先后发现小菜蛾田间种群对小菜蛾田间种群对Bt产产生抗性以来生抗性以来，至少已有，至少已有10种蛾类、种蛾类、2种甲虫、种甲虫、4种蚊种蚊蝇类经蝇类经50次以上反复次以上反复Bt处理而表现有选择抗性。在处理而表现有选择抗性。在16种虫种中经种虫种中经3120代后增高代后增高10倍。倍。大多数对大多数对Cry毒素抗性产生的机理都和受体结毒素抗性产生的机理都和受体结合区域的突变有关。合区域的突变有关。第54页，讲稿共65张，创作于星期二 Some insect species and nematodes resistant to Cry toxinsBravo and Soberon,2008.第55页，讲稿共65张，创作于星期二延缓害虫产生抗性的方法：延缓害虫产生抗性的方法：o（1）在转基因作物中加入新的杀虫基因在转基因作物中加入新的杀虫基因，如，如Bin-like-Cry、Mtx-like-Cry和和Vip毒素等。毒素等。o（2）在转基因作物或工程菌中加入多种作用机理在转基因作物或工程菌中加入多种作用机理不同的不同的cry基因基因，如将能够与不同受体结合的，如将能够与不同受体结合的cry基因基因在一株植物中表达。这样，害虫世代间同时产生对多在一株植物中表达。这样，害虫世代间同时产生对多种毒素抗性的可能性就呈指数级下降了。种毒素抗性的可能性就呈指数级下降了。第56页，讲稿共65张，创作于星期二o（3）对对Cry毒素进行分子改造，使其绕过与主要受毒素进行分子改造，使其绕过与主要受体的作用，而直接产生活性体的作用，而直接产生活性。o（4）利用钙粘蛋白碎片来抑制害虫的抗性利用钙粘蛋白碎片来抑制害虫的抗性。钙粘。钙粘蛋白的蛋白的CR12区域能够提高区域能够提高Cry1A对鳞翅目害虫的对鳞翅目害虫的活性。活性。第57页，讲稿共65张，创作于星期二五、苏云金杆菌在害虫防治上的应用o1 1、杀虫范围、杀虫范围 苏云金芽孢杆菌类的各变种对鳞翅目、膜翅目、直翅目、苏云金芽孢杆菌类的各变种对鳞翅目、膜翅目、直翅目、双翅目、鞘翅目等双翅目、鞘翅目等350350余种昆虫有不同程度的防治效果，但主余种昆虫有不同程度的防治效果，但主要应用于防治下列害虫：要应用于防治下列害虫：（1 1）经济作物类：棉铃虫、红铃虫、造桥虫、烟青虫；）经济作物类：棉铃虫、红铃虫、造桥虫、烟青虫；（2 2）蔬菜类：菜青虫、小菜蛾、菜螟；）蔬菜类：菜青虫、小菜蛾、菜螟；（3 3）粮食作物类：二化螟、三化螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟，玉米）粮食作物类：二化螟、三化螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟，玉米螟等，螟等，（4 4）果树类：松毛虫、桃小食心虫、尺蠖、大袋蛾，卷叶蛾等）果树类：松毛虫、桃小食心虫、尺蠖、大袋蛾，卷叶蛾等。第58页，讲稿共65张，创作于星期二o2、苏云金杆菌的使用方法（1）防治适期）防治适期 锦铃虫锦铃虫产卵盛期，即百株卵量产卵盛期，即百株卵量20粒开始施药，以后每粒开始施药，以后每隔隔34d施药一次，每代施药施药一次，每代施药23次。次。菜青虫菜青虫在卵孵化盛期幼虫在卵孵化盛期幼虫1龄期施药，则药效高达龄期施药，则药效高达92；用；用Bt剂防治二化螟，在卵孵化前剂防治二化螟，在卵孵化前l3d施药，施药，防效为防效为79.485.3；第59页，讲稿共65张，创作于星期二防治防治玉米螟玉米螟应在心叶末期施药，亩用颗粒剂应在心叶末期施药，亩用颗粒剂700750g，幼虫死亡率高达，幼虫死亡率高达97.9，为害，为害率下降率下降91.5。烟青虫、豆天蛾、造桥虫、松毛虫及果树害烟青虫、豆天蛾、造桥虫、松毛虫及果树害虫虫，可在产卵盛期或幼龄期施药。，可在产卵盛期或幼龄期施药。第60页，讲稿共65张，创作于星期二（2）使用技术 虫龄越小防治效果越好，使用时必须掌虫龄越小防治效果越好，使用时必须掌握好时机和用量。握好时机和用量。BtBt农药药效较慢，一般害农药药效较慢，一般害虫进食虫进食30min30min后停止为害作物；后停止为害作物；24h24h开始死亡，开始死亡，48h48h达到死亡高峰，达到死亡高峰，72h72h死亡率达死亡率达9595以上。以上。单用单用：喷粉、喷雾均可。：喷粉、喷雾均可。第61页，讲稿共65张，创作于星期二 混用混用：为提高药剂的防治效果，特别是在害虫大：为提高药剂的防治效果，特别是在害虫大发生和多种害虫混合发生时，可发生和多种害虫混合发生时，可与非碱性与非碱性的杀虫双、的杀虫双、杀虫单、甲胺磷、三唑磷等常用化学杀虫剂混用，作杀虫单、甲胺磷、三唑磷等常用化学杀虫剂混用，作用互补，效果更佳。用互补，效果更佳。必须现配现用。最好不和其他杀必须现配现用。最好不和其他杀菌剂混用，以免影响防效菌剂混用，以免影响防效。与生物农药混用与生物农药混用：可与白僵菌、小菜蛾：可与白僵菌、小菜蛾GVGV等混用。等混用。第62页，讲稿共65张，创作于星期二（3）使用方法（做到四看）使用方法（做到四看）一看温度一看温度。使用使用Bt的适宜温度在的适宜温度在25以上以上，温度过，温度过低完全失去杀虫作用。在低完全失去杀虫作用。在2530时使用，其防治效时使用，其防治效果比果比1015时高出时高出12倍。温度低于倍。温度低于20时最好不时最好不使用。使用。二看湿度二看湿度。环境湿度越大，其防效发挥越好环境湿度越大，其防效发挥越好，因，因此宜在早晚有露水时喷施粉剂，利于菌剂粘附在茎此宜在早晚有露水时喷施粉剂，利于菌剂粘附在茎叶上，并促进芽抱繁殖。较湿润的土壤有助于菌剂叶上，并促进芽抱繁殖。较湿润的土壤有助于菌剂的吸附，从而提高杀虫效果。的吸附，从而提高杀虫效果。第63页，讲稿共65张，创作于星期二 三看阳光三看阳光。为了。为了避免阳光中紫外线避免阳光中紫外线对对BtBt细菌芽孢的细菌芽孢的破坏作用，最好在阴天或晴天下午破坏作用，最好在阴天或晴天下午4 4时以后使用。时以后使用。如能在如能在BtBt中加人粗糖蜜、玉米糖浆或洗衣粉，其中加人粗糖蜜、玉米糖浆或洗衣粉，其防效更佳。防效更佳。四看雨水四看雨水。中到大雨会冲刷喷洒在茎叶上的药液，降。中到大雨会冲刷喷洒在茎叶上的药液，降低防效。如果喷后低防效。如果喷后5h5h下毛毛细雨有增加防效作用。下毛毛细雨有增加防效作用。第64页，讲稿共65张，创作于星期二感感谢谢大大家家观观看看第65页，讲稿共65张，创作于星期二