动物细胞工程第六部分动物克隆与核移植技术课件 高中生物竞赛.ppt

,第六部分动物克隆与核移植技术,第一节 动物克隆与核移植技术简介,一、动物克隆 克隆（clone）：一词源于希腊文“klone”，指用无性方式培养后代群体的过程，可以在分子水平、细胞水平和个体水平三个水平上进行。 动物个体水平的克隆称为动物克隆，包括胚胎分割技术和核移植技术。,2、细胞核移植(cell nuclear transfer) 将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体基因得到完全复制。 细胞核移植动物：用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到扩繁种群的目的。,同种胚胎细胞克隆,同种体细胞克隆,异种体细胞克隆,克隆动物技术的发展已经历了60余年的漫长探索，根据供体细胞核与去核卵细胞的来源可归纳为3个标志性的发展阶段。,1938 年，德国科学家施丕曼(Spemann) 首先在 两栖类动物中进行了核移植的实验,得出的结论为:早 期胚胎每个分裂球的发育分化能力是等同的。 1952 年美国科学家勃立基(Briggs) 和金(King)首先用显微操作器将豹蛙囊胚时期的细胞核移到已去掉细胞核的成熟卵母细胞内，获得了发育到期的幼蛙，说明囊胚期的细胞具有发育的全能性。,第一阶段 同种胚胎细胞克隆,我国著名胚胎学家童第周教授领导的科研小组(包括叶毓芬、吴尚勤、严绍颐、陆德裕等)60 年代初对“异种核质杂交克隆鱼”进行了研究,首次将核移植技术应用到鱼类。他们不但创造出有经济价值的细胞工程鱼（如鲤鲫移核鱼），而且在细部的核质关系的理论研究方面取得了许多重大突破。,70年代后期，由于哺乳类卵子的体外培养、体外受精核胚胎移植技术的发展，使哺乳类的核移植研究取得了一系列的重大突破。 1982年，Hoppe和Illmensee用显微注射法把小鼠囊胚内细胞团（ICM）的细胞核直接注入去核受精卵中，并获得了移核小鼠。 1983年，McGrather和Solter首次用细胞融合方法（Cell fusion）进行核移植也获得了产仔的结果，并提出了重复性很高的核移植技术的操作程序。 1984年，丹麦科学家Willadsen第一只胚胎克隆羊诞生。,1990年，中国科学院发育生物学研究所杜淼获得了克隆兔。 随后，90年代，中国科学家利用胚胎细胞相继克隆成了兔、羊、猪、牛、小鼠等几种动物。 1993年，美国的First用牛内细胞团细胞成功地获得了克隆牛 1997年，中国学者孟励在美国成功获得克隆猴。 至此，国内外动物克隆采用的均为胚胎细胞。,1997年，孟励首次用胚胎细胞获得的克隆猴。,1998年，日本科学家Kato等用牛的输卵管细胞得到克隆牛。,第二个阶段 同种体细胞克隆,1997年，2月24日，英国罗思林研究所I.Wilmut等宣布克隆羊“多莉”培育成功。他们用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功的一只克隆羊。这是第一个体细胞克隆动物。,1998年1999年，美国人White用珍稀动物盘羊的体细胞核与牛卵结合，韩国黄禹锡将白头山老虎体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将大熊猫体细胞核与兔卵结合，均成功克隆出早期胚胎。,2001年10月,意大利科学家报道异种克隆濒危的欧洲盘羊获得成功。,第三个阶段 异种体细胞克隆,三、 哺乳动物克隆的技术方法,动物克隆技术方法包括胚胎分割和核移植技术。根据核供体的来源不同，可将核移植分为胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、胚胎成纤维细胞核移植、体细胞核移植和连续细胞核移植，其中体细胞核移植主要包括乳腺细胞核移植和皮肤细胞核移植。,（一）胚胎分割 是用机械方法把已发育的胚胎分割，再把每一部 分移植到动物体内，经发育后出生，以提高动物生 产效率。,胚胎分割技术：采用机械方法将未着床的早期胚胎分割成2等分、4部分或者8等分，分别移植给受体，切割成的每一部分再单独发育成个体。 哺乳动物发育到8细胞之前的早期胚胎，每个卵裂球都有全能型，具有发育为正常个体的潜能。,2000年美国科学杂志报道了通过胚胎分割技术获得的恒河猴Tetra（泰特拉）,（二）核移植 1.胚胎细胞核移植 胚胎细胞核移植是用显微手术的方法将未着床的早期胚 胎细胞分离成单个的卵裂球，再把单个卵裂球细胞导入去除 染色体的卵母细胞中，再经一系列的步骤获得胚胎，经移植 后获得后代。 理论上讲，一个胚胎有多少个细胞，就可以克隆出多少 个动物。,2.胚胎干细胞核移植 胚胎干细胞核移植即将ES利用核移植技术导入去除染色质的成熟卵母细胞内，电融合后发育成胚胎，移植给受体，妊娠产仔，得到克隆动物。,3. 胎儿成纤维细胞核移植 从早期胎儿分离出单个成纤维细胞，导入去核的成熟卵母细胞内，电融合后发育成胚胎，移植给受体，得到克隆动物。 这比ES克隆动物更进一步，因为成纤维细胞是 分化了的细胞，它发育成新的个体，是动物体细胞 全能性理论的突破。,4.体细胞核移植 动物体细胞作为细胞核来源，用核移植的方法将 其导入去核卵母细胞，得到克隆胚胎，移植产仔，获得体细胞克隆动物。,5. 连续细胞核移植 胚胎细胞核移植虽然可以得到两个以上的克隆动物, 但 数量仍有限。通过连续细胞核移植, 则可获得较大的群体。 所谓连续细胞核移植是指第一次移植的重组胚胎发育成 多个细胞的胚胎时将胚胎细胞分散, 并将它们作为第二次核移 植的供体细胞, 再进行第二次核移植, 获得第2代克隆胚胎，将 第2代克隆胚胎细胞作为核移植的供体细胞, 再进行第三次核移植, 获得第3代克隆胚胎, 依次类推, 即可获得第4、第5代克隆胚胎及克隆动物。 因此, 又称为继代核移植。,供体核的获得,第二节 细胞核移植克隆动物的技术路线,一、核移植技术的操作程序 供体核的获得 受体细胞的获得及其去核 细胞核移植 重组胚激活 重组胚培养和移植 体细胞核移植后代的鉴定,（一）供体核的获得 供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行15 天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态。 通常采用处于G0期细胞作为核移植的供体细胞。诱导细胞脱离正常周期而进入G0期。,采用细胞松弛素B（Cytochalasin B）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。,（二）受体细胞去核 1、盲吸去核法 2、功能性去核法 3、半卵（切割）法,盲吸法操作方法： 将微细玻璃管通过透明带插至卵周隙的第一极体处盲吸， 把第一极体连同其下质膜和质膜覆盖下的核区（该区为减数分 裂中期染色体所在位置）及其周围部分细胞质一起吸入微吸 管内，移出卵外，以除去卵内染色体。 可用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率,功能性去核法操作方法 功能性去核法是先将卵母细胞置于Hoechst 33342特异 染色液中，使其与DNA结合。然后，再用紫外线照射，使染 色体断裂成碎片，丧失功能。 采用此法处理牛和绵羊的卵母细胞，可以明显提高去核 效率。但也有实验证实， Hoechst 33342对猪和小鼠的胚胎 发育有一些不利的影响。,半卵（切割）法 先用微细玻璃吸针吸去一半卵母细胞内物质，移至另一空 透明带内，把一个卵母细胞分为两半。然后用Hoechst 33342染 色，选留不含染色体的一半卵母细胞为核移植的受体。,（三）细胞核移植 细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法。 前者是用微吸管吸取供体核后，直接刺破受体卵质膜，将核直接注入卵周隙，完成细胞核移植。 后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中，使供体细胞与卵质膜接触，融合处理使供体核进入受体卵胞质内，形成重组胚。,带下注射 直接胞质内注射法,核注射方法,应用piezo-pulse设备直接注射法,显微注射法获得重构胚过程,（四）重组胚激活 正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制，成熟的卵母细胞质能使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化，从而使供体核的基因从头开始进行顺序表达。,重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法。 1、电激活：是可把重组胚放在电融合槽两极之间，用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活。 2、化学激活：常用的激活剂包括乙醇、放线菌酮、离子霉素等。,（五）重组胚培养和移植 激活后的重组胚可以采用体内和体外两种培养方式。 1、体内培养：将重组胚植入同种或异种动物的输卵管中发育至囊胚或桑椹胚，然后进行胚胎移植。 2、体外培养：将重组胚在特定培养液中培养至囊胚，选择优质胚胎移入同种的同期发情的受体中继续发育。,（六）体细胞核移植后代的鉴定 对于体细胞核移植培育的动物，可以从形态、性别上鉴定，还可以采用分子生物学技术鉴定。,二、胚胎细胞核移植克隆动物 哺乳动物的胚胎细胞具有全能性，理论上每个胚胎细胞经过核移植，都能发育成遗传性状完全相同的个体。将胚胎细胞分离，体外培养获得胚胎干细胞系，再经过胚胎干细胞核移植可培育更多的动物个体。,选用了三种不同品系小鼠作为核供体、核受体和养母，最后得到了具有核供体特征的克隆小鼠。,四、细胞核移植技术的应用 1、 畜牧业生产方面：利用体细胞克隆技术可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。 2、 保护濒危物种方面：挽救濒危物种，保护生态平衡。,3、 在医药方面： 利用转基因克隆动物生产珍贵的医用蛋白。, 利用转基因克隆动物细胞、组织器官作为异种移植的供体，治疗疾病。, 利用人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官，用于组织器官的移植。,4、在科研领域方面： 研究克隆动物和克隆细胞，从而更深入地了解胚胎发育及衰老过程； 利用克隆动物做疾病模型，使人们更好的追踪研究疾病的发展过程，从而治疗疾病。,受胎率低（26.2%） 流产率高(53.8%) 克隆动物的存活率低（35.7%) 常出现早衰现象,五 克隆技术存在问题,1提高成功率 动物体细胞克隆的成功率很低，目前公认的成功率在1% 3% , 克隆胚胎移植后的出生率低。因此，要最大限度地利用起动物克隆技术, 就要解决好成功率问题。 2解决部分个体生理或免疫缺陷问题 目前大多数研究发现体细胞克隆动物有半数多有严重缺陷或是畸形, 包括心脏、肺脏等器官携有罕见的缺陷, 生物学家认为, 克隆动物产生畸胎、器官缺陷、猝死等问题可能与遗传“印迹作用”受到破坏有关。除了“印迹作用”之外, 产前及围产期死亡率增加可能与目前的体外培养有关。,3 解决受体细胞质与供体细胞核周期相容性的问题 当受体细胞与供体细胞处于细胞周期同一时间, 核移植的成功率就大。,4.通过核移植产生的重构胚能否完成整个发育过程 解决问题的关键是移入的细胞核能否在受体细胞质的作用下正确的重新编程, 使重构胚成为全能性细胞，完成整个发育,5.减少或避免供体线粒体的带入 在核移植过程中, 供体核带入一部分细胞质，因此，核移植的克隆动物实际上是一种遗传嵌合体。为此，应尽量减少或避免供体线粒体的带入。,6、关于克隆动物的衰老问题,克隆羊“多莉”出现了早衰现象，其端粒长度比正常出生的羊短了20%，这与供核羊Finn Dorset的6岁年龄直接相关。,人类染色体端粒的荧光免疫原位杂交照片,1999年，美籍华人杨向中教授第一个报道了克隆动物具有正常长度的端粒和遗传年龄，得出克隆动物不会未老先衰、克隆动物的遗传年龄与供体动物年龄无关的结论。,此后，这一结论被美国麻省的ATC公司在克隆牛上和美国洛克菲勒大学在克隆鼠上得到证实。,总之，由于细胞衰老的分子机理至今仍未能研究清楚，因此有关克隆动物的衰老问题，目前仍在争论中，还需要进一步的研究来证实。,端粒酶结构的模式图解,