凝胶过滤和高效液相色谱.ppt

关于凝胶过滤与高效液相色谱第一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝 胶第二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等特点。收率高等特点。适用于：适用于：a.a.分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质(包括酶类包括酶类)、核酸、多糖、激、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质素、氨基酸和抗生素等物质b.b.测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量c.c.样品的浓缩和脱盐等方面。样品的浓缩和脱盐等方面。第四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月一、凝胶的分类及性质一、凝胶的分类及性质性质：性质：凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分子筛凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分子筛功能。功能。分类：分类：葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶凝胶(生物胶生物胶)和交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚的凝胶和交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚的凝胶等。等。第五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（一）（一）葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶商品名：商品名：SephadexSephadex，它是由葡聚糖，它是由葡聚糖 右旋糖酐右旋糖酐(G(G型型)；和；和3-3-氯氯-1,2-1,2-环氧丙烷（交联剂环氧丙烷（交联剂)以醚链相以醚链相互交联而成的。在交联葡聚糖互交联而成的。在交联葡聚糖G-25G-25和和G-50G-50中分别中分别加入羟丙基基团反应，即可构成加入羟丙基基团反应，即可构成LHLH型烷基化葡聚型烷基化葡聚糖凝胶。糖凝胶。第七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月1 1理化性质理化性质葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见其葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见其表面的网状皱纹。它带有大量的羟基，亲水性好，表面的网状皱纹。它带有大量的羟基，亲水性好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。不同型号的在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。不同型号的葡聚糖凝胶的交联度葡聚糖凝胶的交联度(交联剂在葡聚糖凝胶中占交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数的百分数)不同，使其在水中的膨胀度不同，使其在水中的膨胀度(床体积床体积)、吸水量吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量量。但不包括颗粒间所带的水量)、筛孔的大小、筛孔的大小和分组范围有明显的差异和分组范围有明显的差异。第十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月例如，例如，Sephadex G-25Sephadex G-25比比G-100G-100交联度大。而膨交联度大。而膨胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者。另外，胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者。另外，前者对球形蛋白质的分级范围较窄，即在前者对球形蛋白质的分级范围较窄，即在1000(1000(下限下限)-5000()-5000(上限上限)之间，而后者的分级之间，而后者的分级范围较宽，即在范围较宽，即在4000-1500004000-150000之间。之间。第十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月本质：本质：葡聚糖凝胶置盐溶液或清洁剂中引起的膨胀程度葡聚糖凝胶置盐溶液或清洁剂中引起的膨胀程度并不影响样品的分级效果。但盐溶液或清洁剂能并不影响样品的分级效果。但盐溶液或清洁剂能改变分离物质的结构时，则会影响分级效果。改变分离物质的结构时，则会影响分级效果。葡葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不同聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不同。第十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月1 1）以）以G G型葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀经水溶液膨胀)作为固作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层葡聚糖凝胶过滤层析析。2 2）以）以LHLH型葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或酰胺或N,N-N,N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗葡聚糖凝胶渗透层析透层析。第十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2 2稳定性稳定性葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解。中稳定，不溶解，很少产生化学降解。在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)(120)消毒消毒3030分钟，分钟，其性质并不改变。在其性质并不改变。在0.1mol/L HCl0.1mol/L HCl溶液中浸泡溶液中浸泡1-21-2小时，甚至在小时，甚至在0.02mol/L HCl0.02mol/L HCl溶液中浸泡溶液中浸泡6 6个月以上，对分离效果无明显的影个月以上，对分离效果无明显的影响。响。耐酸、耐碱、耐高温耐酸、耐碱、耐高温第十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月但当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷键水解断但当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷键水解断裂，要避免与其接触。葡聚糖凝胶欲在室温下长期保裂，要避免与其接触。葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐存时，应加入适量的防腐剂如剂如氯仿、叠氮化钠氯仿、叠氮化钠等。等。否则，微生物将生长。否则，微生物将生长。第十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 3 3吸附性吸附性葡聚糖凝胶系弱酸性物质葡聚糖凝胶系弱酸性物质,由于其每克干胶中含由于其每克干胶中含10-2010-20微克当量的羧基基团所致。该基团能与分离微克当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。发生吸附作用。但这种吸附作用可用提高洗脱液的离子强度解决。但这种吸附作用可用提高洗脱液的离子强度解决。当离子强度大于当离子强度大于0.050.05时，一般对弱碱性蛋白质就时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此葡聚糖凝胶层析时无吸附力了。因此葡聚糖凝胶层析时,常用含有常用含有NaClNaCl的缓冲液作洗脱液。的缓冲液作洗脱液。第十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月新葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附力新葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附力了。虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋了。虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响。层析，以便消除其影响。第十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，若采物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸吸附原理附原理，而不是排阻原理。，而不是排阻原理。第十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（二）琼脂糖凝胶（二）琼脂糖凝胶琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典称称Sepharose,Sepharose,美国称美国称Bio-gel ABio-gel A；英国称；英国称SegavacSegavac；丹麦；丹麦Gelarose,Gelarose,我国的同类产品与瑞典相同，这我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中除些琼脂糖中除SegavacSegavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。形式出售。第二十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月琼脂糖凝胶按其浓度分：琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose 2B(2Sepharose 2B(2浓度浓度)、4B4B(4(4)和和6B(66B(6)。Sepharose 6BSepharose 6B的机械强度大于的机械强度大于2B2B，但是筛孔小于，但是筛孔小于2B2B。琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。以快些。第二十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（三）聚丙烯酰胺凝胶（三）聚丙烯酰胺凝胶商品名商品名Bio-gelBio-gel。是以甲撑双丙烯酰胺（双体）作。是以甲撑双丙烯酰胺（双体）作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，N,N,N,N-N,N,N,N-四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）为加速剂，将丙烯酰胺）为加速剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓度时，就可（单体）聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有得吸水率不同的产物，商品型号有Bio-gel P-2Bio-gel P-2到到P-300P-300。第二十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。胶形式出售，使用前必须溶胀。特点：不溶于水和普通有机溶剂，特点：不溶于水和普通有机溶剂，能在浓盐、能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡尿素和胍盐等溶液中浸泡：在：在pH l-10pH l-10或短时问或短时问超过此超过此pHpH值的溶液中较稳定；要避免长期与强值的溶液中较稳定；要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解（高温条件）。（高温条件）。缺点：缺点：对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附吸附现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可以克服以克服第二十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第二十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第二十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（四）四）SephacrylSephacrylSephacrylSephacryl由烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺被共由烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺被共价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小的筛价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。孔和少量的羧基基团。SephacrylSephacryl吸水时，其珠吸水时，其珠状颗粒直径平均值为状颗粒直径平均值为7070m m。通常是用于水相系。通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。变化。第二十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第二十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月特点：特点：1.在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；2.它可在它可在pH2-11范围内使用，当范围内使用，当pH低时，葡聚糖低时，葡聚糖链将发生少许水解作用；在链将发生少许水解作用；在0.2mol/L NaOH溶溶液中液中(室温下室温下)处理处理100小时小时,对其低流速和多孔性对其低流速和多孔性没有明显影响。没有明显影响。3.用清洁剂用清洁剂(如如SDS)、6mol/L盐酸胍和盐酸胍和8 mol/L尿尿素活液可作为洗脱剂素活液可作为洗脱剂,高温（高温（120）消毒）消毒(pH 7时时)处理后处理后,层析性质没各明显变化。层析性质没各明显变化。第二十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月SephacrylSephacryl能用于分离蛋白质、核酸，多糖和蛋白聚糖能用于分离蛋白质、核酸，多糖和蛋白聚糖(Proteoglycans)(Proteoglycans)。也可用硕大的病毒颗粒。也可用硕大的病毒颗粒(直径直径300-400)300-400)的的分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。第二十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月二、基本原理二、基本原理凝胶过滤层析的基质是具有凝胶过滤层析的基质是具有立体网状结构、筛立体网状结构、筛孔直径一致孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全，或者部分排阻某些大分子化合物于可以完全，或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外。而对某些小分子化合物则不能排阻。筛孔之外。而对某些小分子化合物则不能排阻。但可让其在筛孔中自由地但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透扩散、渗透。任何一。任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在均在0-1000-100之间。之间。第三十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月其被排阻的程度可以用分配系数其被排阻的程度可以用分配系数Kav(分离化合物分离化合物在在内水内水和和外水外水体积中的比例关系体积中的比例关系)表示。表示。Kav值的大小值的大小依赖于凝胶床的总体积依赖于凝胶床的总体积(Vt)、外水体积、外水体积(V。)以及分以及分离物本身的洗脱体积离物本身的洗脱体积(Ve)。即即 Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）在限定的层析条件下，在限定的层析条件下，Vt和和Vo都为恒定值，而都为恒定值，而Ve则是随着分离物分子量的变化而变化的。则是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分离物分子量大，分子量大，Kav值小，反之则大。值小，反之则大。第三十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第三十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子量不同的因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生发生排阻和扩散排阻和扩散效应。若缓冲液连续的倾入柱效应。若缓冲液连续的倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续的发中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续的发生，其级终结果是生，其级终结果是分子量大的物质先从柱中流分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出出，分子量小的物质则后从柱中流出，流出物，流出物用部分收集器分管等量或等时的收集起来，检用部分收集器分管等量或等时的收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分于量不同的物质相互筛分开了。把分于量不同的物质相互筛分开了。第三十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月影响筛分效果的因素：影响筛分效果的因素：1 1）操作条件操作条件：如基质的颗粒大小、均匀度、筛：如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等；的种类等；2 2）KavKav值的差异性值的差异性。KavKav值差异性大，分离效果值差异性大，分离效果好；好；KavKav值差异性小，乃至等于值差异性小，乃至等于1 1或等于零或等于零(即使即使样品个各组分的分子量相样品个各组分的分子量相差很大差很大)，则分离效果，则分离效果相差，或根本不能分开。相差，或根本不能分开。第三十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月分配系数分配系数(Kav)(Kav)既是判断分离效果的一个参数，既是判断分离效果的一个参数，又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav=Kav=（Ve-VoVe-Vo）/（Vt-VoVt-Vo）看出，只要测出床体）看出，只要测出床体积积VtVt和外水体积和外水体积VoVo以及洗脱体积以及洗脱体积VeVe。即可计算。即可计算出出KavKav，而凝胶床总体积，而凝胶床总体积VtVt可用二种方法得到。可用二种方法得到。第三十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月1 1）计算法，即根据层析柱体积计算其总体积。）计算法，即根据层析柱体积计算其总体积。公式表示：公式表示：Vt=rVt=r2 2 h h 式中式中r r为层析柱半径，为层析柱半径，h h为为凝胶床高度；凝胶床高度；为圆周率。在用此公式计算凝胶为圆周率。在用此公式计算凝胶床总体积时，须精确的分段测量，以防内径不均床总体积时，须精确的分段测量，以防内径不均匀造成误差，另外还须注意到，在层析过程中，匀造成误差，另外还须注意到，在层析过程中，尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶床的高度降尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。低。第三十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2 2）测量法：）测量法：由凝胶床的组成可知，床体积由凝胶床的组成可知，床体积VtVt等于外水体体积等于外水体体积VoVo、内水体积、内水体积Vi,Vi,与凝胶颗粒实际占有体积与凝胶颗粒实际占有体积VgVg之和。之和。即即 Vt=Vo+Vi+Vg Vt=Vo+Vi+Vg 因因VgVg与与VtVt相比是很小的。可忽略不计，故相比是很小的。可忽略不计，故 Vt VtVoVo十十ViVi第三十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月VoVo和和ViVi可通过实验测得：分子量不同的混合液在凝胶中的内水可通过实验测得：分子量不同的混合液在凝胶中的内水体积和外水体积中的分布不同。溶液中的分子大于凝胶孔径上体积和外水体积中的分布不同。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积凝胶床的洗脱体积VeVe刚好等于外水体积。即刚好等于外水体积。即Ve=Vo(Kav=0)Ve=Vo(Kav=0)。溶。溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内，液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内，凝胶凝胶床的洗脱体积床的洗脱体积VeVe应等于凝胶床总体积、即应等于凝胶床总体积、即Ve=Vt=VoVe=Vt=Vo十十Vi(Kav=1)Vi(Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则之间者，则有一部分能进入凝胶网孔有一部分能进入凝胶网孔、故其洗脱体积、故其洗脱体积VeVe是在是在VoVo和和VtVt之间之间(Kav(Kav在在0-10-1之间之间)。第三十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月常选用：蓝色葡聚糖常选用：蓝色葡聚糖20002000作为测定外水体积的物作为测定外水体积的物质。质。其理由：其理由：1 1）分子量大）分子量大(为为200200万万)，呈蓝色，在各种型号的，呈蓝色，在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻；葡聚糖凝胶中都被完全排阻；2 2）借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度仪检测）借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（在（在210nm210nm或或260nm260nm及及620nm)620nm)洗脱体积洗脱体积(即即Vo)Vo)。第三十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月缺点：在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝缺点：在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖色葡聚糖20002000测定外水体积。因为它对激酶有吸附测定外水体积。因为它对激酶有吸附作用。所以有时用巨球蛋白代替。作用。所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积测定内水体积(Vi)(Vi)的物质：的物质：可选用硫酸铵、可选用硫酸铵、N-N-乙酰酪乙酰酪氨酸乙酯氨酸乙酯,或其它与凝胶无吸附力的小分子物质。或其它与凝胶无吸附力的小分子物质。第四十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月以床体积以床体积VtVt（公式算）和测得值（公式算）和测得值VoVo来计算分配系来计算分配系数的值为数的值为KavKav（计算法计算法）。）。若以床体积若以床体积Vt(Vt(等于等于VoVo十十Vi)Vi)和测得值和测得值VoVo来计算分来计算分配系数的值为配系数的值为KdKd（测量法测量法）。）。同一层析条件下、对同一物质计算出的同一层析条件下、对同一物质计算出的KavKav和和KdKd仅仅尽管有一定的差异性，但那是有效的。只因尽管有一定的差异性，但那是有效的。只因KavKav计计算方便，所以目前使用算方便，所以目前使用KavKav较多。分离物在凝胶过较多。分离物在凝胶过滤层析时的行为，还可用滤层析时的行为，还可用VeVeVoVo或或VoVoVe(RVe(R值值)表表示。示。第四十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月三、操三、操 作作（一）凝胶的选择和处理（一）凝胶的选择和处理1 1凝胶的选样凝胶的选样(1)(1)型号型号 凝胶型号很多。型号不同，筛分范围也不同。凝胶型号很多。型号不同，筛分范围也不同。市售的市售的SephadexSephadex的分离范围，常用的分离范围，常用高聚糖或球蛋高聚糖或球蛋白测定白测定。Sephadex GSephadex G型一般适宜于分离蛋白质。型一般适宜于分离蛋白质。如果用于分离核酸时、则限于其空间结构和所带如果用于分离核酸时、则限于其空间结构和所带基团的影响，选用基团的影响，选用高于它们分子量范围的型号高于它们分子量范围的型号，或者或者选用适当型号的生物胶和选用适当型号的生物胶和S Sephacrylephacryl。第四十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶Sephadex Sephadex G-25G-25。当溶液通过。当溶液通过G-25G-25柱时、蛋白质被排阻在凝胶外柱时、蛋白质被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类扩散到凝胶网孔里后流出来。这面先流出来，而盐类扩散到凝胶网孔里后流出来。这样蛋白质就得到纯化。样蛋白质就得到纯化。一般来说，在规定的筛分范围内，一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分子混合物之间分子量差别越大，分离的效果越好量差别越大，分离的效果越好。第四十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 (2)(2)粒度粒度凝胶的粒度有粗有细凝胶的粒度有粗有细(与交联度无关与交联度无关)。细颗粒。细颗粒凝胶之间空间小、装柱易均一，因此分离效果凝胶之间空间小、装柱易均一，因此分离效果好好(与粗颗粒凝胶相比、但是由于细颗粒凝胶流与粗颗粒凝胶相比、但是由于细颗粒凝胶流速慢，故宜速慢，故宜用大直径的层析柱用大直径的层析柱。这类凝胶用于。这类凝胶用于小型试验，能得到满意结果；而粗颗粒凝胶流小型试验，能得到满意结果；而粗颗粒凝胶流速快宜速快宜用小直径的层析柱用小直径的层析柱，如操作得当可得到，如操作得当可得到较满意的结果。较满意的结果。第四十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第四十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 2 2凝胶用量的计算凝胶用量的计算根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，公式可计根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，公式可计算出所需干凝胶的用量：算出所需干凝胶的用量：干凝胶用量（干凝胶用量（g g）=r r2 2 h/h/膨涨度（床体积膨涨度（床体积/克克干胶）干胶）用此法计算出的干凝胶用量还需增加用此法计算出的干凝胶用量还需增加10%10%-2020，因为凝胶在处理过程会有一部分损失。因为凝胶在处理过程会有一部分损失。第四十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月3 3凝胶的处理凝胶的处理将所用的干凝胶缓慢的倾入将所用的干凝胶缓慢的倾入5-105-10倍的蒸馏水中，根据凝胶溶涨所倍的蒸馏水中，根据凝胶溶涨所需的时间进行充分浸泡，用倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，需的时间进行充分浸泡，用倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，再用再用0.5mol/L NaOH-0.5mol NaCl0.5mol/L NaOH-0.5mol NaCl溶液在室温下浸泡半个小时，溶液在室温下浸泡半个小时，以抽滤法除去碱液，用蒸馏水洗至中性，为了除去凝胶颗粒中以抽滤法除去碱液，用蒸馏水洗至中性，为了除去凝胶颗粒中空隙中的气泡，可把处理过的凝胶浸泡于蒸馏水和平衡液中用空隙中的气泡，可把处理过的凝胶浸泡于蒸馏水和平衡液中用抽气方法实现。有时采用加热煮沸方法，不仅能达到此目的，抽气方法实现。有时采用加热煮沸方法，不仅能达到此目的，而且还能加快凝胶的溶胀速度。但是，必须避免置于酸或碱溶而且还能加快凝胶的溶胀速度。但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热。液中加热。第四十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（二）二）凝胶柱的制备凝胶柱的制备1.1.柱的选择柱的选择 层析柱重要组成部分。对层析柱（包括体积和长度等）层析柱重要组成部分。对层析柱（包括体积和长度等）的选择，将直接影响分离效果。的选择，将直接影响分离效果。当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时。当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时。长层析柱比长层析柱比短的分辨率高短的分辨率高；当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，；当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱分离；当用同样体积的层析柱分离两种以上的物质时，仍是两种以上的物质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高层析柱长的比短的分辨率高。一般。一般理想的层析柱之直径与长度之比是理想的层析柱之直径与长度之比是1 1:25-125-1:100100。层析柱最。层析柱最好有夹套，可以控制温度，重复性好。好有夹套，可以控制温度，重复性好。第四十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第四十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第五十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2 2装柱装柱装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。分类：干装法和湿装法两种。分类：干装法和湿装法两种。干装法干装法直接加凝胶到柱中，然后倒入溶剂，直接加凝胶到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将此法不易将气泡排尽气泡排尽。第五十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月湿装法湿装法先加适量溶剂到柱内，排走其中的先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶搅匀，空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶搅匀，随即将此悬浮液连续倾入到柱中，待其自然沉随即将此悬浮液连续倾入到柱中，待其自然沉降至柱高的降至柱高的1/4-1/31/4-1/3时打开柱下端出口，让溶剂时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。凝胶表面要平整高度。凝胶表面要平整,应使其一直浸没在溶剂应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生中，严防气泡产生。这一种装。这一种装柱法柱法对对各种基各种基质质都适用。都适用。第五十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月3 3凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定新装的凝胶柱用适当缓冲液平衡后，将蓝色葡聚新装的凝胶柱用适当缓冲液平衡后，将蓝色葡聚糖糖-2000-2000，或红色葡聚糖或细胞色素，或红色葡聚糖或细胞色素C C或血红蛋白或血红蛋白等配成等配成2 2毫克毫克/毫升的溶液过柱，观察色带毫升的溶液过柱，观察色带是否均是否均匀下降匀下降。如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的、。如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的、柱中没有柱中没有裂缝和气泡裂缝和气泡，否则须重新装柱。如果凝，否则须重新装柱。如果凝胶柱鉴定时采用的是蛋白质类物质进行，除能起胶柱鉴定时采用的是蛋白质类物质进行，除能起到鉴定柱子的作用外，还可起到克服对到鉴定柱子的作用外，还可起到克服对某些分离某些分离物有不可逆吸附物有不可逆吸附的作用。的作用。第五十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 （三）加样与洗脱（三）加样与洗脱1 1加样加样 加样量与加样量与测定方法和层析柱大小有关测定方法和层析柱大小有关。测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，加样量加样量可少。否则反之可少。否则反之。例如，例如，般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法。当采用法。当采用280nm280nm观察消光读数时，加样量需观察消光读数时，加样量需5 5毫毫克左右克左右(柱体积柱体积260cm)260cm)；当采用；当采用220nm220nm观察消光观察消光读数时，加样量只需读数时，加样量只需1.21.2毫克左右，加样量掌握毫克左右，加样量掌握得当，可提高分离效果。得当，可提高分离效果。第五十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月一般来说，一般来说，加样量越少，或加样体积越小加样量越少，或加样体积越小(样品样品浓度高时浓度高时)，分辨率越高，分辨率越高。但是，当用于样品的。但是，当用于样品的制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前提制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前提下增大。究竟加样体积多少为宜？下增大。究竟加样体积多少为宜？这要视被分离这要视被分离物在层析柱的分配系数物在层析柱的分配系数(Kav)(Kav)或洗脱体积或洗脱体积(Ve)(Ve)来来决定决定。第五十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月假设，假设，A A、B B两个被分离物在层析柱中的洗脱体两个被分离物在层析柱中的洗脱体积分别为积分别为VeVeA A 、VeVeB B，分配系数分别为分配系数分别为KavKav，KavKav。A A、B B两物洗脱体积之差称为分离体积，两物洗脱体积之差称为分离体积，以以VsVs表示。则表示。则VsVsVeVeA A-Ve-VeB B。第五十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月当样品体积当样品体积(Vp)(Vp)正好与正好与VsVs相等时，理论上的洗脱相等时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开。但实际情况并非如此，图形是两种物质恰好分开。但实际情况并非如此，由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大。因此，大，致使其洗脱体积远比原来大。因此，当当VpVp等等于或大于于或大于VsVs时，时，A A、B B两种物质就不能完全分开；两种物质就不能完全分开；而当而当VpVp小于小于VsVs时，时，A A、B B两种物质就能分开两种物质就能分开。根根据据VeVeVoVo十十KavKav（Vt-Vo)Vt-Vo)，则，则 Vs VsVeVeA A-Ve-VeB B (Kav-Kav(Kav-Kav)(VtVo)(VtVo)第五十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月分离效果是与加样体积、被分离样品在层析柱中分离效果是与加样体积、被分离样品在层析柱中的洗脱体积或分配系数，以及凝胶床的体积有关的洗脱体积或分配系数，以及凝胶床的体积有关。所以，为了提高分离效果，在一定范围内，所以，为了提高分离效果，在一定范围内，加样加样体积越小越好体积越小越好。例如在蛋白质溶液中脱盐时，因。例如在蛋白质溶液中脱盐时，因加样量过大会产生分离不完全的现象。而加样量加样量过大会产生分离不完全的现象。而加样量减少时，则产生良好的分离效果。通常减少时，则产生良好的分离效果。通常加样体积加样体积为床体积的为床体积的1-5%,1-5%,最好不超过最好不超过10%10%。第五十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月此外，样品的粘度也影响层析的分辨率此外，样品的粘度也影响层析的分辨率。样品的粘度大。样品的粘度大（11.8)11.8)比小的分辨率低。因此，一般使用的样比小的分辨率低。因此，一般使用的样品粘度以小于品粘度以小于2 2，或者与，或者与洗脱液的粘度洗脱液的粘度相当为宜相当为宜 第五十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 2 2洗脱洗脱所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则变性或失活为原则。除个别特殊情况外。一般。除个别特殊情况外。一般都以单一缓冲液都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、如磷酸缓冲液、Tris-HClTris-HCl缓冲缓冲液等液等)，或者盐溶液作为洗脱液。有时甚至也可，或者盐溶液作为洗脱液。有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。以用蒸馏水作洗脱液。第六十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月洗脱时的流速要严格控制洗脱时的流速要严格控制。否则收集的每一部。否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵以测出。控制流速的最好装置是恒流泵(微量泵微量泵)，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。若无此装置，可用控制操作较大范围内选择。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。事实上，大多数实验室是采用压的办法进行。事实上，大多数实验室是采用后一种方法进行控制流速的。后一种方法进行控制流速的。流流 速速第六十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月流速除与柱长度有关外，还与柱直径大小有关。流速除与柱长度有关外，还与柱直径大小有关。为了防止层析柱中洗脱液流干，可按图为了防止层析柱中洗脱液流干，可按图5-105-10装置装置进行操作。进行操作。第六十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第六十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 一般说来，一般说来，洗脱流速慢洗脱流速慢，分离效果就好，分离效果就好(见图见图5-55-5及及5-5-11)11)，但是太慢时也会因扩散加剧而降低分离效果。，但是太慢时也会因扩散加剧而降低分离效果。加样后，经洗脱收集到的每管洗脱液，可选用适当的加样后，经洗脱收集到的每管洗脱液，可选用适当的方法进行定性和定量测定方法进行定性和定量测定。第六十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月洗脱体积的计算洗脱体积的计算 峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用体积，常用Ve Ve 表示。表示。当使用样品的体积很少时，当使用样品的体积很少时，(与洗脱体积比较可以忽略与洗脱体积比较可以忽略不计不计)，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为积为VeVe。当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点升高的弯曲点(或半高处或半高处)。第六十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月分子量与洗脱体积的关系分子量与洗脱体积的关系在凝胶分离范围之内，蛋白质分子量与洗脱位在凝胶分离范围之内，蛋白质分子量与洗脱位置之间存在线性对应关系。置之间存在线性对应关系。在一定分子量范围内洗脱体积对分子量的对数在一定分子量范围内洗脱体积对分子量的对数为为线性关系线性关系，即，即分子量的标准曲线分子量的标准曲线。第六十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（四）凝胶柱的再生和保存（四）凝胶柱的再生和保存1 1再生再生 仅使用一次的凝胶柱，通常进行重仅使用一次的凝胶柱，通常进行重新平衡后即可使用。但使用过多次后，由于凝胶新平衡后即可使用。但使用过多次后，由于凝胶床体积变小，流动速度降低或污染杂质过多等原床体积变小，流动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受到影响。在此情况下，再因，致使其正常性能受到影响。在此情况下，再生方法是：先用水反复进行逆向冲洗。再用缓冲生方法是：先用水反复进行逆向冲洗。再用缓冲液进行平衡。平衡毕，即可重复使用；另一种方液进行平衡。平衡毕，即可重复使用