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酶学分子克隆过程第1页，此课件共43页哦三。工具酶。三。工具酶。1。限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）:识别识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割的特异序列，并在识别位点或其周围切割DNA双链双链结构的一类内切酶。结构的一类内切酶。根据酶的结构，所需要辅助因子及裂解根据酶的结构，所需要辅助因子及裂解DNA的方式不同，分为三类。的方式不同，分为三类。I 类：由三种不同的亚基组成，需要类：由三种不同的亚基组成，需要Mg+,SAM和和ATP为辅助因子，为辅助因子，这类酶识别部位复杂，特异性差。这类酶识别部位复杂，特异性差。II 类：由三种亚基组成，需要类：由三种亚基组成，需要Mg+，ATP为辅助因子。为辅助因子。III 类：由一种亚基组成，其活性仅需要类：由一种亚基组成，其活性仅需要Mg+作为辅助因子，作为辅助因子，DNA切割就发生在特异识别的部位范围内。切割就发生在特异识别的部位范围内。根据识别部位核苷酸组成的特点，可将识别部位分为四种类型。根据识别部位核苷酸组成的特点，可将识别部位分为四种类型。第2页，此课件共43页哦（1）回文结构：比如：）回文结构：比如：EcoRI5-G AATTC 33-CTTAA G 5KpnI5-GGTAC C 33-C CATGG 5MspI5-CC GG 33-GG CC 5(2)间断回文结构间断回文结构:Bgl I5-GCCNNNN NGGC 33-CGGN NNNNCCG 5第3页，此课件共43页哦（3）简并序列简并序列Ava II5-G GA/TCC-33-CCT/AG G-5(4)非回文序列非回文序列Mbo II5-GAAGAN8 33-CTTCTN7 -5第4页，此课件共43页哦同识异切酶，比如同识异切酶，比如 Hpa II,MspI-CCGG-GGCC-所切割的所切割的DNA具有相同的粘性末端的一类酶：比如，具有相同的粘性末端的一类酶：比如，SalI和和XhoISalI5-G TCGAC 33 CAGCT G 5Xho I 5-C TCGAG 33-G AGCT C 5二。修饰酶二。修饰酶1。DNA聚合酶聚合酶I：活性包括：活性包括(1)53 DNA聚合作用聚合作用(2)35外切酶活性外切酶活性(3)53外切酶活性外切酶活性第5页，此课件共43页哦Klenow片段：片段：DNA聚合酶聚合酶I C 端的大片段，端的大片段，活性包括活性包括(1)53 DNA聚合作用聚合作用(2)35外切酶活性外切酶活性用途：用途：(1)标记标记DNA的的3末端末端(2)修饰突出的修饰突出的3或或5末端以产生平端末端以产生平端(3)随机寡核苷酸引物介导的随机寡核苷酸引物介导的DNA标记标记(4)克隆克隆cDNA时合成第二链时合成第二链(5)双脱氧法双脱氧法DNA测序测序2。T4 DNA聚合酶聚合酶：活性：活性：(1)DNA聚合酶活性聚合酶活性(2)35端外切酶活性端外切酶活性（单链或双链）（单链或双链）(3)缺少缺少53端外切酶活性端外切酶活性第6页，此课件共43页哦(1)放射性标记放射性标记DNA片段的片段的3末端末端(2)选择性及无选择标记线性化双链选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的分子的3末端，末端，即所谓的即所谓的“置换合成置换合成”(3)变双链变双链DNA的粘性末端成平端的粘性末端成平端用途：用途：3。T7 DNA聚合酶聚合酶（1）天然天然T7 DNA聚合酶聚合酶（T7基因基因5蛋白蛋白/硫氧还原蛋白复合物）硫氧还原蛋白复合物）（1）DNA聚合酶活性很强聚合酶活性很强（2）35末端外切酶活性（单链或双链）末端外切酶活性（单链或双链）用途：用途：A:延伸长的延伸长的DNA模板模板B:用于定点诱变中互补链的合成用于定点诱变中互补链的合成C:应用于应用于3末端的标记末端的标记D:将双链将双链DNA的粘性末端的粘性末端（5或或3末端突出）转变为平端末端突出）转变为平端第7页，此课件共43页哦(2)经修饰的经修饰的T7 DNA聚合酶：其聚合酶：其35外切酶活性可选择性的降低，外切酶活性可选择性的降低，或通过基因工程改造使之完全失活，而保留了或通过基因工程改造使之完全失活，而保留了DNA聚合酶活性。聚合酶活性。用途：用途：(1)用于用于DNA测序测序(2)用于标记用于标记5末端突出的末端突出的DNA的的3末端。由于它会在末端。由于它会在3端端 留下一个额外的碱基，因此不能应用于将粘性留下一个额外的碱基，因此不能应用于将粘性DNA末端末端 转变成平端。转变成平端。4。反转录酶反转录酶来源：来源：1.禽类成髓细胞瘤病毒禽类成髓细胞瘤病毒（avian myoblastosis virus,AMV）2.莫洛尼鼠白血病病毒莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus,MMLV）活性：活性：1.RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性2.DNA指导的指导的DNA聚合酶活性（不具聚合酶活性（不具35外切酶活性外切酶活性）3.具有具有RNaseH活性活性,即从即从5或或3端连续降解端连续降解RNA与与DNA杂杂 种双链内的种双链内的RNA链部分。链部分。第8页，此课件共43页哦用途：用途：(1)将真核基因的将真核基因的mRNA转录成转录成cDNA文库文库(2)对具有对具有5突出端突出端DNA片段的片段的3端进行填补和标记端进行填补和标记(3)代替代替Klenow酶用于酶用于DNA序列测定序列测定5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）活性：催化水解活性：催化水解DNA，RNA，dNTP和和NTP上的上的5磷酸残基。磷酸残基。用途：用途：(1)去除去除DNA和和RNA的的5端磷酸基，而后在端磷酸基，而后在T4多聚核苷酸激多聚核苷酸激 酶催化下，用酶催化下，用 -32P ATP在在 5端进行标记，以便进行序列端进行标记，以便进行序列 分析。分析。除去载体除去载体DNA5磷酸基，可以防止自身环化，提高重组磷酸基，可以防止自身环化，提高重组 DNA效率。效率。6。T4多聚核苷激酶多聚核苷激酶第9页，此课件共43页哦活性：活性：(1)催化催化ATP的的 位磷酸转移到位磷酸转移到DNA或或RNA的的5端羟基（活性高）端羟基（活性高）(2)将将RNA或或DNA5端的磷酸基转移给端的磷酸基转移给ADP生成生成ATP,而而5端又成端又成 为羟基。为羟基。用途：用途：（1）单双链核酸分子）单双链核酸分子5末端的同位素标记。末端的同位素标记。（2）对单双链核酸分子）对单双链核酸分子5末端磷酸化，以利于重组末端磷酸化，以利于重组DNA分子分子 之间的连接。之间的连接。7。DNA连接酶连接酶活性：催化双链活性：催化双链DNA中相邻碱基的中相邻碱基的5磷酸和磷酸和3羟基间磷酸二酯羟基间磷酸二酯 键的形成。键的形成。（1）T4 DNA连接酶：连接酶：此酶是唯一在正常条件下，有效连接平端此酶是唯一在正常条件下，有效连接平端DNA的连接酶。粘性的连接酶。粘性末端的连接通常在末端的连接通常在1215度进行，平端的连接通常在室温度进行，平端的连接通常在室温（低于（低于30度），所需酶量是粘端连接的度），所需酶量是粘端连接的10100倍。倍。第10页，此课件共43页哦（2）大肠杆菌）大肠杆菌DNA连接酶：连接酶：活性：修复双链活性：修复双链DNA中的单链切口，并可催化互补粘性末端的连接。中的单链切口，并可催化互补粘性末端的连接。在正常反应条件下，它不能连接平端。在正常反应条件下，它不能连接平端。8。T4 RNA连接酶：连接酶：活性：在活性：在ATP存在下，催化单链存在下，催化单链DNA或或RNA的的5端磷酸与单链端磷酸与单链DNA 或或RNA的的3端羟基共价连接。端羟基共价连接。用途用途：（1）RNA 3末端的放射性标记。末端的放射性标记。（2）寡聚的）寡聚的DNA和和RNA分子环化分子环化（3）增加）增加T4 DNA连接酶的平端连接活性连接酶的平端连接活性9。外切核酸酶外切核酸酶：9.1 外切核酸酶外切核酸酶VII活性：从单链活性：从单链DNA 5和和3末端进行外切消化的活性，产生小的末端进行外切消化的活性，产生小的 寡核苷酸片段。寡核苷酸片段。第11页，此课件共43页哦用途：用途：（1）基因组）基因组DNA中内含子的位置作图。中内含子的位置作图。（2）切除通过）切除通过poly(dAdT)加尾插入到质粒载体中的加尾插入到质粒载体中的 DNA片段。片段。9.2 双链双链5-3末端外切核酸酶末端外切核酸酶（1）噬菌体外切核酸酶噬菌体外切核酸酶活性活性：催化从双链：催化从双链DNA5带磷酸基因的末端开始的持续水带磷酸基因的末端开始的持续水 解，解，释放释放5核苷核苷单磷酸，但不降解单磷酸，但不降解5为羟基的末端。为羟基的末端。应用应用：在应用双脱氧法测序时，将双链：在应用双脱氧法测序时，将双链DNA转变为单链转变为单链DNA。（2）T7基因基因6外切核酸酶外切核酸酶活性活性：催化双链：催化双链DNA的的5末端的依次水解，生成末端的依次水解，生成5核苷单磷酸。它的作核苷单磷酸。它的作用持续性较低，对用持续性较低，对5端为磷酸基因或羟基的端为磷酸基因或羟基的DNA链都能作用。链都能作用。第12页，此课件共43页哦应用应用：与：与噬菌体外切酶活性相比，此酶的优势在于它从噬菌体外切酶活性相比，此酶的优势在于它从5末端的降解末端的降解均匀且可控制，此外，它也可降解均匀且可控制，此外，它也可降解5为羟基的末端。为羟基的末端。9.3 双链双链3-5外切核酸酶外切核酸酶。外切核酸酶外切核酸酶III活性活性:催化双链催化双链DNA从从3羟基末端开始水解，释放核苷单磷酸。它的外切酶活性是羟基末端开始水解，释放核苷单磷酸。它的外切酶活性是非持续的，因而是用在双链非持续的，因而是用在双链DNA中产生均匀的单链区的理想工具酶，水解的速度受中产生均匀的单链区的理想工具酶，水解的速度受核苷酸组成的影响（核苷酸组成的影响（CA-TG）应用应用（1）与）与Klenow酶联用，制备链特异性探针，类似于利用酶联用，制备链特异性探针，类似于利用T4 DNA聚合酶活性进行交换合成反应。聚合酶活性进行交换合成反应。(2)制备单链模板用于双脱氧测序。制备单链模板用于双脱氧测序。10。内切核酸酶。内切核酸酶10.1 S1核酸酶核酸酶活性：高度特异性的单链内切酶，在尿素，活性：高度特异性的单链内切酶，在尿素，SDS和甲酰胺中稳定。和甲酰胺中稳定。第13页，此课件共43页哦应用应用:（1）分析抗）分析抗S1核酸酶降解的核酸酶降解的RNA:DNA杂合体以定位杂合体以定位RNA转录物转录物 的的5和和3末端。末端。（2）通过消化成熟）通过消化成熟RNA分子与分子与32P 标记的基因组标记的基因组DNA杂交形成杂交形成 的杂合体，确定内含子的位置。的杂合体，确定内含子的位置。（3）消化在以反转录酶合成）消化在以反转录酶合成cDNA时形成的发卡结构。时形成的发卡结构。（4）去掉）去掉DNA 片段的单链突出末端，产生用于连接的平端。片段的单链突出末端，产生用于连接的平端。10.2 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶I（DNase I）活性：活性：Dnase 酶酶I 是需二价阳离子的内切酶，降解双链是需二价阳离子的内切酶，降解双链DNA 产生带产生带3羟基羟基的寡核苷酸。在的寡核苷酸。在Mg2+存在下，在双链存在下，在双链DNA上产生缺口，在上产生缺口，在Mn2+存在下，存在下，断裂双链断裂双链DNA。应用应用:(1)切口平移标记探针。切口平移标记探针。(2)用于足文（用于足文（Footprint）实验。）实验。(3)在在Mn2+存在时裂解双链存在时裂解双链DNA，用于随机克隆。，用于随机克隆。第14页，此课件共43页哦11.核糖核酸酶核糖核酸酶11.1 核糖核酸酶核糖核酸酶 A(RNase A)活性：活性：在在C 和和U 残基后特异性水解残基后特异性水解RNA的内切酶。的内切酶。11.2 核糖核酸酶核糖核酸酶 H活性：活性：特异性的水解特异性的水解RNA:DNA杂交体中杂交体中RNA的磷酸二酯键。的磷酸二酯键。不降解单链或双链的不降解单链或双链的DNA或或RNA.113 核糖核酸酶核糖核酸酶III（RNaseIII）活性：活性：水解双链水解双链RNA应用应用：制备：制备12末端转移酶（末端转移酶（Terminal Transferase）活性活性：末端转移酶是一种无需模板的：末端转移酶是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到合到DNA分子的分子的3羟基端。带有突出、凹陷或平末端的单双链羟基端。带有突出、凹陷或平末端的单双链DNA分分子均可作为子均可作为TdT的底物的底物第15页，此课件共43页哦13T7 RNA聚合酶聚合酶活性活性：体外合成：体外合成RNA应用应用：1，放射标记，放射标记RNA探针探针 2，合成，合成RNA，用于体外翻译，用于体外翻译 3，合成双链，合成双链RNA，用于，用于RNA干涉实验干涉实验14Poly(A)聚合酶聚合酶活性活性：加：加AMP到的到的末端。也可加（）末端。也可加（）和（）到和（）到末端，但效率更低末端，但效率更低应用应用：，：，加（）到的加（）到的末末端端，末端标记末端标记第16页，此课件共43页哦第17页，此课件共43页哦1,插入片断两端的酶切位点与载体完全匹配插入片断两端的酶切位点与载体完全匹配GGTACCCTCGAGCCATGGGAGCTCKpnIXhoICATGGCCGGTACCGAGCTTCGAGCGGTACCTCGAGC载体载体第18页，此课件共43页哦2，一端匹配，另一端不匹配，一端匹配，另一端不匹配先用不匹配一端限制性酶切，补平成为平末端，然后再用匹配一端酶切先用不匹配一端限制性酶切，补平成为平末端，然后再用匹配一端酶切GCTAGCCGATCGCTCGAGGAGCTCNheIXhoI先用先用NheI切割切割CTAGCGGAGCTCCTCGAG用用T4DNA聚合酶或聚合酶或Klenow酶补平酶补平CTAGCGATCGCTCGAGGAGCTCdNTP XhoI切割切割第19页，此课件共43页哦GATCGCTAGCCGAGCTTCGAGCCG载体载体3，两端都不匹配，两端都不匹配（1）平末端连接）平末端连接CGATCGGCTAGCNheICATATGGTATACNdeI用用NdeI和和NheI切割，回收切割，回收目的片断目的片断第20页，此课件共43页哦CTAGCGCAGTAT用用T4DNA聚合酶补平聚合酶补平dNTP CTAGCGATCGGTATCATACpGCGp用碱性磷酸酶去除用碱性磷酸酶去除5端磷酸根端磷酸根GCCG第21页，此课件共43页哦（2）用末端转移酶加入多聚核苷酸）用末端转移酶加入多聚核苷酸GATCGCTAGCCATAGTAT末端转移酶末端转移酶dATP CATAGTATCTAGCGATCGAAAAAAAAGpTTTTCGTTTTCp第22页，此课件共43页哦（3）在目的片断两端加入接头）在目的片断两端加入接头CTAGCGATCGCATAGTATKpnICATACTAGCGATCGCAGGTTATTCCG CATGGTCCAATAAGGCCGGAATAACCTGGTACGCCTTATTGGACKpnIGTATGGTACCCGGTAC第23页，此课件共43页哦二核酸探针的标记二核酸探针的标记（一），（一），末端标记末端标记1，单末端标记，单末端标记GCTAGCCGATCGCATATGGTATACNheI NdeI 用用NheI切割切割第24页，此课件共43页哦GCGATCCTAGCGGTATACCATATGKlenow酶酶dNTP(-32P-dNTP)C TAGCGp*ATCGCGA TCGCTp*AGCATATGGTATAC第25页，此课件共43页哦2,双末端标记双末端标记CTAGCGGTATCAKlenow酶酶dNTP(-32P-dNTP)C TAGCGp*ATCGGTA TCATp*A 3,利用利用T4核苷酸激酶进行末端标记核苷酸激酶进行末端标记第26页，此课件共43页哦PP碱性磷酸酶碱性磷酸酶OHOHT4核苷酸激酶核苷酸激酶-32p-ATP*PP*第27页，此课件共43页哦应用：应用：DNaseI Footprint实验和实验和Gelshift实验实验2，随机引物标记，随机引物标记变性（加热）变性（加热）随机引物随机引物XXXXXXXXXXX XXXXKlenow酶酶 dNTP(-32p-dNTP)第28页，此课件共43页哦3,缺口平移标记缺口平移标记DNaseIKlenow酶酶 dNTP(-32p-dNTP)X X XXXXXXXX应用：应用：Northern和和Southern 杂交杂交第29页，此课件共43页哦三，三，cDNA 5末端扩增（末端扩增（5-Race）第一种方法：第一种方法：第30页，此课件共43页哦第二种方法第二种方法第31页，此课件共43页哦第三种方法第三种方法第32页，此课件共43页哦四，特异基因四，特异基因SiRNA的体外制备的体外制备RNaseIII第33页，此课件共43页哦五，五，micro-RNA的克隆的克隆OHPPoly(A)聚合酶聚合酶dATPPAAAAAAT4 RNA ligaseOHRNAAAAAAA逆转录酶逆转录酶AAAAAATTTTTTTTTTTTcDNAPCR和克和克隆隆上游引物上游引物下游引物下游引物第34页，此课件共43页哦六，六，DNA调节序列缺失体的构建调节序列缺失体的构建第35页，此课件共43页哦七，点突变七，点突变第36页，此课件共43页哦八，基因表达分析八，基因表达分析NASBA NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）55335533553355335533553333553355RT3355Primer 255335533335533555533335555333355Primer 1Primer 2RTRTRTRNase HCyclic PhaseCyclic Phase T7 RNAPolymerase5533Primer 1553355333355RT3355RNase H第37页，此课件共43页哦三三.载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒质粒：作为载体的质粒一般具有以下特点：质粒：作为载体的质粒一般具有以下特点：(1)分子相对较小，分子相对较小，310 kb左右；左右；(2)具有松弛型复制子；具有松弛型复制子；(3)在复制子以外适当的位置，存在几个单一内切酶位点，在复制子以外适当的位置，存在几个单一内切酶位点，便于外源便于外源DNA 片段的插入；片段的插入；(4)具有抗药性和具有抗药性和/或插入失活的筛选标记。或插入失活的筛选标记。第38页，此课件共43页哦表达载体：含特殊的表达载体：含特殊的DNA调节序列，核糖体结合位点调节序列，核糖体结合位点和表达表达标签等和表达表达标签等第39页，此课件共43页哦（2）带标签的表达载体）带标签的表达载体第40页，此课件共43页哦2，原核表达载体原核表达载体第41页，此课件共43页哦表达载体的修饰表达载体的修饰1，分泌型表达载体，分泌型表达载体2，可调节型表达载体，可调节型表达载体第42页，此课件共43页哦在原核生物中表达真核生物基因应该注意的问题在原核生物中表达真核生物基因应该注意的问题1，基因的基因组DNA不能在原核生物中进行表达，因为原核生物不能进行RNA加工2，如果蛋白质的生物学活性依赖于蛋白质的修饰，比如：糖基化等，不适于在原核生物中表达，因为原核生物不能进行翻译后加工3，真核生物基因的毒性作用第43页，此课件共43页哦