实验一质粒提取以及琼脂糖凝胶电泳.ppt
关于实验一质粒的提关于实验一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳取及琼脂糖凝胶电泳第一张，PPT共二十三页，创作于2022年6月载体构建过程载体构建过程一、质粒DNA的提取及电泳检测二、目的基因的PCR扩增及产物检测三、DNA的定性定量分析及酶切产物检测质粒双酶切PCR产物双酶切四、酶切产物及PCR产物的纯化及检测五、DNA的连接及检测六、大肠杆菌的培养和超级感受态细胞的制备七、质粒DNA的原核转化和蓝白斑筛选酶切产物+酶切产物T载体+PCR产物第二张，PPT共二十三页，创作于2022年6月实验学时：6学时实验类型：综合性每组人数：4人组实验一实验一质粒质粒DNA的提取的提取及及琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测第三张，PPT共二十三页，创作于2022年6月一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法。一、碱裂解法小量制备质粒DNA第四张，PPT共二十三页，创作于2022年6月质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒 20200个拷贝/细胞 严紧型质粒 12个拷贝/细胞实验背景实验背景质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNADNA分子，能稳定地独立存在于染分子，能稳定地独立存在于染分子，能稳定地独立存在于染分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质粒质粒DNADNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNADNA；如果质粒；如果质粒DNADNA的的两条链在同一处断裂，则形成线状两条链在同一处断裂，则形成线状DNADNA。当提取的质粒。当提取的质粒DNADNA电泳时，同一质粒电泳时，同一质粒DNADNA其其超螺旋超螺旋形式的泳动速度要比形式的泳动速度要比开环开环和线状分子的泳动速度快。和线状分子的泳动速度快。第五张，PPT共二十三页，创作于2022年6月由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的MCS处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有PCR产物的3末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。复制起点筛选标记基因多克隆位点第六张，PPT共二十三页，创作于2022年6月二、实验原理二、实验原理高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质第七张，PPT共二十三页，创作于2022年6月三、仪器、材料与试剂(一)仪器1恒温培养箱2恒温摇床3台式离心机4高压灭菌锅(二)材料 1含连接外源基因质 粒的E.coli 21.5mL Eppendorf管 3吸头、微量移液器 第九张，PPT共二十三页，创作于2022年6月SolutionI50mmolL葡萄糖25mmolLTrisHCl(pH8.0)10mmolLEDTA(三)主要试剂溶液：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成(保护、缓冲)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒(保护作用)EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）第十张，PPT共二十三页，创作于2022年6月SolutionII 0.4mol/LNaOH，2SDS,用前等体积混合溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）第十一张，PPT共二十三页，创作于2022年6月 溶液溶液溶液溶液IIIIII：HAcHAc和和和和 KAcKAc组成的高盐溶液组成的高盐溶液组成的高盐溶液组成的高盐溶液(复性，分离复性，分离复性，分离复性，分离)HAcHAc溶液溶液溶液溶液能中和溶液能中和溶液能中和溶液能中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNADNA变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，并使质粒并使质粒并使质粒并使质粒DNADNA复性。复性。复性。复性。KAcKAc会与会与会与会与SDSSDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的溶液中的溶液中的溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS复合物缠绕成大分子而与小分复合物缠绕成大分子而与小分复合物缠绕成大分子而与小分复合物缠绕成大分子而与小分子质粒子质粒子质粒子质粒DNADNA分离。分离。分离。分离。SolutionIII 5molL 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 115mL 水 285mL 第十二张，PPT共二十三页，创作于2022年6月TE缓冲液 10mmo1L TrisHCl 1mmo1L EDTA(pH8.0)胰RNA酶溶液 将RNA酶溶于10mmo1/L TrisHCl(pH75)和15mmo1/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20。第十三张，PPT共二十三页，创作于2022年6月四、四、实实验验步步骤骤加加加加1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml培养物于培养物于培养物于培养物于EPEPEPEP管，管，管，管，12000g12000g12000g12000g30S30S30S30S 除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的200 200 200 200 l l l l 溶液溶液溶液溶液I I I I，剧烈振荡，剧烈振荡，剧烈振荡，剧烈振荡EPEPEPEP管，室温管，室温管，室温管，室温3min3min3min3min 加入加入加入加入300300300300 l l l l 溶液溶液溶液溶液IIIIIIII，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴3min3min3min3min 加入加入加入加入400400400400 l l l l 冰冰冰冰溶液溶液溶液溶液IIIIIIIIIIII，温和振荡，温和振荡，温和振荡，温和振荡10s10s10s10s，冰浴，冰浴，冰浴，冰浴5min5min5min5min，12000g12000g12000g12000g5min5min5min5min转移上清到新转移上清到新转移上清到新转移上清到新EPEPEPEP管，加入等体积管，加入等体积管，加入等体积管，加入等体积酚酚酚酚/氯仿氯仿氯仿氯仿(1:1)(1:1)(1:1)(1:1)，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴3min3min3min3min，12000g12000g12000g12000g5min5min5min5min 上层水相转移到新上层水相转移到新上层水相转移到新上层水相转移到新EPEPEPEP管管管管，加入，加入，加入，加入2 2 2 2倍体积倍体积倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇，颠倒混匀，颠倒混匀，颠倒混匀，颠倒混匀，-20 -20 -20 -20 冰箱中放置冰箱中放置冰箱中放置冰箱中放置15min15min15min15min，12000g12000g12000g12000g 10min10min10min10min 弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加1ml 1ml 1ml 1ml 70%70%70%70%乙醇乙醇乙醇乙醇，12000g12000g12000g12000g5min 5min 5min 5min 去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置10min10min10min10min，20 20 20 20 l TE l TE l TE l TE 溶解溶解溶解溶解DNADNADNADNA 第十四张，PPT共二十三页，创作于2022年6月一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。2.琼脂糖凝胶电泳检测DNA第十五张，PPT共二十三页，创作于2022年6月DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。二、实验原理二、实验原理第十六张，PPT共二十三页，创作于2022年6月凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的质粒DNA，有3种构型,这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。第十七张，PPT共二十三页，创作于2022年6月三、仪器、材料与试剂(一)仪器1微波炉2琼脂糖凝胶电泳系统3移液器4凝胶成像系统第十八张，PPT共二十三页，创作于2022年6月(二)试剂1（1）5TBE(50倍体积的TBE贮存液）配1000 mL 5TBE Tris 54 g 硼酸 27.5 g 0.5molL EDTA 20 mL pH 8.0 或（2）50TAE(50倍体积的TAE贮存液）Tris 242 g 乙酸 57 mL 0.5molL EDTA 100 mL pH 8.0 2凝胶加样缓冲液(6x)3琼脂糖 4溴化乙锭溶液(EB)0.5ugmL第十九张，PPT共二十三页，创作于2022年6月四、实验步骤(一一)、称取、称取0.5g0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50mL0.5xT50mL0.5xTA AE E缓冲液，缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至6060左右时加入少许左右时加入少许EBEB溶液，摇匀，则为溶液，摇匀，则为1 1琼脂糖凝胶液。琼脂糖凝胶液。(二二)胶板的制备胶板的制备11将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。2 2将冷到将冷到6060左右的琼脂糖凝胶液，加入左右的琼脂糖凝胶液，加入EBEB后，缓缓倒入有机玻后，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(不要形成气泡不要形成气泡)。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。染环境。3 3待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。44加入电泳缓冲液至电泳槽中。加入电泳缓冲液至电泳槽中。第二十张，PPT共二十三页，创作于2022年6月(三三)加样加样用移液枪将已加入上样缓冲液的用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样品加入加样品加入加样品加入加样孔样孔样孔样孔(记录点样顺序及点样量记录点样顺序及点样量)。(四四)电泳电泳1 1接通电泳槽与电泳仪的电源接通电泳槽与电泳仪的电源接通电泳槽与电泳仪的电源接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，注意正负极，注意正负极，注意正负极，DNADNA片片片片段从负极向正极移动段从负极向正极移动段从负极向正极移动段从负极向正极移动)。DNADNA的迁移速度与电压成正的迁移速度与电压成正的迁移速度与电压成正的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过比，最高电压不超过比，最高电压不超过比，最高电压不超过5V/cm5V/cm。2 2当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1 1 2cm2cm处，停止电处，停止电处，停止电处，停止电泳。泳。泳。泳。第二十一张，PPT共二十三页，创作于2022年6月五、实验结果在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用)。M 1 第二十二张，PPT共二十三页，创作于2022年6月感谢大家观看第二十三张，PPT共二十三页，创作于2022年6月
