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农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2008,16(6):10011005*基金项目：国家高技术研究与发展(863)项目(No.2006AA02Z174 和 No.2006AA03A243）和国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.2003CB114201)资助。*通讯作者。Author for correspondencd.博士，教授，主要从事芽胞杆菌分子生物学研究。Tel:86-27-87283455;Fax:86-27-87280670;E-mail:.收稿日期：2008-02-20接受日期：2008-04-07 研究论文 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 Cry7Ba1 溶解性分子改良*朱自敏，宋 荣，余子全，喻子牛，孙 明*(华中农业大学生命科学技术学院，农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)摘要：苏云金芽胞杆菌（）杀虫晶体蛋白 Cry7Ba1 需要在强碱性缓冲液中(pH 12.5)才能溶解，而且只有溶解后才能对小菜蛾()表现出毒力，其50为 1.33 滋g/mL。分别用 Cry1Ac 和 Cry1C 晶体蛋白的 C-半段替换 Cry7Ba1 的 C-半段，结果发现当 Cry7Ba1 的 C-半段被替换后，重组晶体蛋白与 Cry1Ac 和 Cry1C 等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下(pH 9.5)能有效溶解，而且重组晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性没有发生明显变化，其50分别为 1.32 和 1.39滋g/mL。结果还显示重组晶体蛋白不需要经过体外溶解就能对小菜蛾表现出杀虫活性。研究结果揭示 Cry7Ba1 晶体蛋白难溶的特性是由其 C-半段结构决定的，通过改变其 C-半段结构改善溶解性，为该晶体蛋白在害虫生物防治中的应用提供了可能。关键词：苏云金芽胞杆菌；Cry7Ba1；晶体蛋白；溶解性中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006-1304(2008)06-01001-05Molecular Improvement of Solubility of Cry7Ba1Crystal fromZHU Zi-min,SONG Rong,YU Zi-quan,YU Zi-niu,SUN Ming*The Cry7Ba1 crystal protein fromcan be dissolved at least at pH value of 12.5,and can exhibittoxicity to the third stage larva ofwith a50value of 1.33 滋g/mL only when it is dissolved.In this study,the C-ter-minal half of Cry7Ba1 was replaced by that of Cry1C and Cry1Ac,respectively.The results indicated that,when the C-terminal half ofCry7Ba1 was substituted,the crystal formed by the recombinant crystal proteins could be dissolved in alkaline buffer(pH 9.5)as thatof Cry1Ac and Cry1C did,and exhibited toxicity towithvalue of 1.32 and 1.39 滋g/mL,respectively.The toxi-cities were nearly equal with Cry7Ba1.The study indicated that the constructed recombinant crystal protein also showed toxicity with-out dissolving.These data suggest that the property of insolubility of Cry7Ba1 crystal is associated with the structure of C-terminalhalf,which can improve the solubility through swapping the C-terminal half of Cry7Ba1,and supplies possibility for the crystal proteinbiocontrol application.;Cry7Ba1;crystal protein;solubility苏云金芽胞杆菌()在芽胞形成过程中会产生由一种或几种杀虫晶体蛋白(in-secticidal crystal proteins,ICPs)组成的伴胞晶体，该晶 体 蛋 白 对 多 种 昆 虫 有 毒 杀 活 性（Crickmore,2006）。敏感昆虫吞食芽胞晶体混合物后，晶体蛋白在中肠碱性环境及一系列蛋白酶的作用下，原毒素降解为 6065 kD 的激活毒素,然后结合到中肠上皮细胞的特异性位点上使细胞膜形成微孔而改变细胞的渗透性，最后细胞裂解导致昆虫死亡(Bravo.,2007)。典型的杀虫晶体蛋白（如 Cry1、Cry4 和Cry7）的结构总体上可分为两部分，氨基端半段(N-半段，N-terminal half)和羧基半段（C-半段，C-termi-nal half）。其中 N-半段为抗胰蛋白酶的毒性区，而C-半段的功能还不是很明确(Schneptf,1998)。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 农 业 生 物 技 术 学 报2008 年表 1 菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids质粒和菌株Strains and plasmids质粒 PlasmidpHT304pBMBLCpBMB0632pBMB0495p0184p0185菌株 StrainsDH5琢BMB171BMB0502BMBLCBMB0632BMB0184BMB0185特征CharacterizationShuttle vector ofand Bt,Ermrand AmprErmrand Ampr,carriedgeneA 4.8 kb fragment harboringcloned into pHT304 at the site of玉A 5.2 kb fragment harboringcloned into pHT304 at the site of玉,Ermrand AmprRecombinant gene(5-terminal+3-terminal)cloned intopHT304 at the site of玉 andR玉Recombinant gene(5-terminal+3-terminal)cloned into pHT304at the site of玉 andR玉strain,44(渍80M15)endBt subsp.acrystalliferous mutant()CryB-containing pBMB0495BMB171 containing pBMBLCBMB171 containing pBMB0632BMB171 containing p0184BMB171 containing p0185来源ResourcesArante and Lereclus(1991)Stored in this labStored in this labStored in this labThis workThis workStored in this labStored in this labStored in this labStored in this labStored in this labThis workThis work根据 Cry1 晶体蛋白序列特征，一般推测认为 C-半段 对 维 持 晶 体 蛋 白 稳 定 性 与 晶 体 形 成 有 关(Crickmore.,2006)。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对靶标昆虫发生毒杀活性首先必须要让晶体蛋白在昆虫肠道碱性环境下溶解活化才能变成有活性的毒素(Bravo.,2007)。由不同晶体蛋白组成的伴胞晶体具有不同的溶解性，在 pH 9.5 条件下，Cry1 类晶体蛋白以及Cry3A 晶体蛋白可被溶解，而 Cry2 类晶体蛋白只有在 pH10.5 才能溶解。以色列亚种(subsp.)的伴胞晶体，在 pH 10.5 溶液中Cry4D 和 CytA 晶体蛋白可被溶解出来，Cry4A 和Cry4B 晶体蛋白不能溶解(Yamamoto and Iizuka,1983)。Cry1Ac 和 Cry1C 为典型的 Cry1 类晶体蛋白，对鳞翅目昆虫具有毒性，分子量为 130 kD 左右，形成菱形晶体，在弱碱性环境中（pH9.5）能被溶解，这一点与靶标昆虫肠道 pH 值是相对应的(Pigott andEllar,2007）。苏云金芽胞杆菌中华亚种(subsp.H40)的伴胞晶体由 Cry7Ba1 杀虫晶体蛋白组成，该伴胞晶体在常规溶解的碱性环境(pH 9.5)条件下不能溶解，而必须在强碱性条件下(pH12.5)才开始溶解，没有溶解的 Cry7Ba1 伴胞晶体不表现出杀虫活性，而溶解后的蛋白对小菜蛾表现出很高的毒力（资料未发表）。本研究利用 Cry1Ac和 Cry1C 的 C-半段置换 Cry7Ba1 晶体蛋白的 C-半段，试图改变 Cry7Ba1 晶体蛋白的溶解性，为更好地利用该晶体蛋白防治害虫提供基础资料。1 材料和方法1.1 菌株和质粒实验所用的菌株和质粒见表 1。大肠杆菌()和 苏 云 金 杆 菌()分别在 37和 28培养。抗生素使用浓度为氨苄青霉素(Amp)100 滋g/mL，红霉素(Erm)25 滋g/mL。1.2 酶和主要试剂各种限制性内切酶、DNA 聚合酶和 T4DNA 连接酶均购自大连 TaKaRa 公司；蛋白质分子量标准购自深圳晶美生物有限公司；其它生化试剂及药品购自美国 Sigma 等公司；DNA 胶回收和PCR 产物回收试剂盒购自美国 Omega 公司。1.3培养基实验采用 LB 培养基活化菌种，ICPM 培养基培养苏云金芽胞杆菌到芽胞成熟(Arvidson.,1989)。1.4供试昆虫供试的小菜蛾()是华中农业大学昆虫中心饲养的稳定的敏感品系，生物测定时采用三龄幼虫进行生测。1.5引物设计分析已知的 Cry1C、Cry1Ac 和 Cry7Ba1 蛋白的氨基酸序列，根据其胰蛋白酶酶切位点，设计重组质粒 N-和 C-半段互换的引物，且不改变重组蛋白 N-和 C-半段的结构域（表 2）。1002PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 第 6 期表 2 扩增所用引物Table 2 Primer used for amplification引物 Primersp4-Fp4-Rp5-Fp5-R序列 SequencesTTA GAATTC ATTCCAGTTACTGCAACAR玉ACA GAATTC CCCTATTAGTGCTTTATTTR玉AATGAATTCGAAATTATTCTAGCAGATGCR玉AAAGAATTCCGTAATACCACCCTTCTAR玉扩增片段 Amplified fragmentsAmplification for the 3-terminal fragment ofinthe construction of p0184Amplification for the 3-terminal fragment ofinthe construction of p01851.6重组质粒的构建目的基因片段的 PCR 扩增、质粒抽提、酶切反应、电泳鉴定、DNA 片段回收、连接反应和大肠杆菌的转化均参照 Sambrook(1989)。重组基因的DNA 测序由北京奥科生物公司完成。1.7苏云金杆菌的电击转化重组质粒转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171(Turgeon,2006)。转化条件：0.2 cm 的电转杯，电压 212 kV，电阻 400 赘，电容 25 滋F。1.8晶体蛋白 SDS-PAGE重组 Bt 菌株在 ICPM 液体培养基中培养 36 h至芽胞成熟。取等体积的发酵液离心收集菌体，用 1mol/L NaCl 和去离子水分别洗涤 3 次，加入等体积的 2 倍加样缓冲液重悬菌体，充分混匀后在沸水中煮 510 min，离心后取上清 1020 滋L 点样。按常规方法在 Bio-Rad 电泳仪上进行稳流电泳，用考马斯亮蓝 R-250 染色。1.9晶体蛋白的溶解性测定苏云金芽胞杆菌在 ICPM 培养基中培养至芽胞成熟后，15 000 r/min 离心 5 min 各收集 2 mL 菌体，分别用 1 mol/L NaCl 和蒸馏水洗 3 遍；然后用 1 mL合适 pH 的 50 mmol/L Na2CO3加入胞晶混合物中，混匀，在 37水浴 30 min；15 000 r/min 离心 5 min收集上清，用乙酸调 pH 5.0，在 4沉淀过夜；15000 r/min 离心 5 min 收集沉淀物，用去离子水清洗3 遍，溶于 50 滋L 合适 pH 的 50 mmol/L Na2CO3中，加入等体积的 2 倍加样缓冲液，充分混匀后在沸水中煮 510 min，离心后取上清 20 滋L 点样。1.10 生物测定采用浸叶法测定苏云金芽胞杆菌对小菜蛾三龄幼虫的毒力。将菜叶剪成 3 cm伊3 cm 小片，在发酵液中浸泡 20 min，取出叶片于 2830自然晾干，放入培养皿中。以未接菌的培养基作为对照。每皿接入10 头三龄小菜蛾幼虫，于温度 251、相对含水量 75%的人工气候箱中饲养。每个样品的生物测定重复 3 次(喻子牛等,1993)。3 d 后统计死亡虫数，计算半致死浓度。2结果和分析2.1 用和基因编码区的 3-端分别替换的 3-端构建重组质粒为了揭示 Cry7Ba1 的 C-半段对其溶解性的影响，用和基因编码区的 3-端分别替换cry7Ba1 的 3-半段。用 p4-F和 p4-R(引入R玉酶切位点)扩增基因编码区的 3-半段,用 p5-F和 p5-R(引入R玉 酶切位点)扩增基因编码区的 3-半段，酶切后分别与用R玉 酶切pBMB0495 得到的的 5-端片段连接，构建出 2 个重组质粒 p0184 和 p0185(图 1)。2.2重组基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171 中的表达将构建的重组质粒分别电转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株 BMB171 中，转化后的重组菌株分别命名为 BMB0184 和 BMB0185。培养至芽胞形成期结束，提取和纯化芽胞和伴胞晶体的混合物，通过SDS-PAGE 检测重组基因伴胞晶体蛋白的表达情况。结果如图 2 所示，重组基因在无晶体突变株中均能表达出晶体蛋白，且与预计的分子量吻合（预计分子量分别为 BMB0184134kD 和 BMB0185135kD）。2.3重组基因表达的晶体蛋白溶解性将各重组菌株培养至芽胞完全成熟，收集胞晶图 1.重组基因构建Fig.1.Schematic of recombinant gene construction1003PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 农 业 生 物 技 术 学 报2008 年混合物充分洗涤后，分别用不同 pH 的碱性缓冲液溶解伴胞晶体，用 SDS-PAGE 检测其溶解性。结果表明，Cry7Ba1 晶体蛋白只有在强碱性缓冲液中（pH 12.5）才能被有效溶解（图 3，A）；当 Cry7Ba1 的C-半段分别被 Cry1Ac 和 Cry1C 的 C-端置换后(BMB0184 和 BMB0185)，其溶解性显著改变，像其它大多数晶体蛋白一样在弱碱性缓冲液中（pH 9.5和 10.5）就能有效溶解（图 3，B）。上述实验结果表明，Cry7Ba1 晶体蛋白需要在较强碱性条件下才能溶解是由其 C-半段结构决定的。2.4重组晶体蛋白毒力测定通过测定重组晶体蛋白对小菜蛾三龄幼虫的毒力来检测重组蛋白溶解性和杀虫活性之间的关系。结果显示当直接用 Cry7Ba1 晶体蛋白作用小菜蛾时没有表现出明显毒力，但是当用强碱性缓冲液（pH 12.5）溶解后对小菜蛾表现出很高的毒力（表3），这与以前测试的结果是一致的。当 Cry7Ba1 的C-半段被置换后其毒力没有发生明显变化，与Cry7Ba1 的毒力相当（溶解的晶体蛋白的50值分别为 BMB0502：1.33 滋g/mL；BMB0184：1.33 滋g/mL；BMB0185：1.39 滋g/mL），而且无论是胞晶混合物还是溶解的晶体蛋白都表现出毒力，说明 Cry1Ac 和Cry1C 的 C-半段都能使 Cry7Ba1 蛋白保持正常的溶解性质并表现杀虫活性（表 3）。3讨论苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的 C-半段与蛋白质的折叠和晶体形成相关，晶体蛋白进入昆虫肠道后被蛋白酶切除；N-半段与晶体蛋白的毒力相关，是毒力核心区域(Maagd.,2003)。晶体蛋白 Cry7Ba1 在常规的晶体蛋白弱碱性缓冲液(pH 9.5)中很难溶解，只有在强碱性缓冲液中才能溶解；而且未溶解的伴胞晶体没有杀虫活性，只有溶解后的晶体蛋白才对小菜蛾幼虫表现出较高的杀虫活性。晶体蛋白 Cry1Ac 和Cry1C 在常规的晶体蛋白弱碱性缓冲液中能够溶解，当用 Cry1Ac 和 Cry1C 晶体蛋白的 C-半段替换Cry7Ba1 的 C-半段时，发现当 Cry7Ba1 的 C-半段被替换后，重组晶体蛋白象 Cry1Ac 和 Cry1C 等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下有效溶解，而且其毒力没有发生明显变化。这一现象说明 Cry7Ba1 晶体蛋白难溶是由其 C-半段决定的。研究中还发现，当 Cry7Ba1 C-半段被置换后，不能形成与出发菌株一样的菱形晶体，只形成不规则的包涵体，这说明该蛋白的 C-半段与其晶体形成图 3.SDS-PAGE 检测重组蛋白溶解性Fig.3.Solubilization of the recombinant crystal proteinsdetected by SDS-PAGEA.Cry7Ba1在不同 pH缓冲液条件下的溶解。1,胞晶混合物;2,pH9.5;3,pH10.5;4,pH11.5;5,pH12.5。B.BMB0184和 BMB0185在不同 pH缓冲液条件下的溶解。1,胞晶混合物；25,BMB0184 分别在 pH10.5、11.5、12.5 和 9.5 条 件 下 的 溶 解；6，BMB0185 胞 晶 混 合 物；710,BMB0185 分别在 pH 9.5、10.5、11.5 和 12.5 条件下的溶解。A.Cry7Ba1 dissolution with pH gradient alkaline buffer.1,spore andcrystalmixture;2,pH9.5;3,pH10.5;4,pH11.5;5,pH12.5.B.BMB0184 and BMB0185 dissolution with pH gradient alkalinebuffer.1,spore and crystal mixture of BMB0184;25,BMB0184dissolved with pH gradient alkaline buffer of pH 10.5,11.5,12.5 and9.5,respectively.6,spore and crystal mixture of BMB0185;710,BMB0185 dissolved with pH gradient alkaline buffer of pH 9.5,10.5,11.5 and 12.5,respectively.图 2.SDS-PAGE 检测重组晶体蛋白基因表达Fig.2.SDS-PAGE of the recombinant crystal proteinsM,蛋白质分子量标准;1,BMB0632 菌株;2,BMB0184 菌株;3,BMB0185 菌株;4,BMBLC 菌株;5,BMB171 菌株含有 pHT304载体;6,BMB0502 菌株。M,protein molecular weight;1,BMB0632;2,BMB0184;3,BMB0185;4,Cry1C;5,pHT304 in BMB171;6,BMB0502.1004PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 第 6 期表 3 重组晶体蛋白对小菜蛾三龄幼虫毒力生物测定Table 3 Toxicity bioassay of recombinant crystal protein against the third stage instar of-，表示无毒力；50单位，胞晶混合物为600浓度，碱溶蛋白质溶液为 滋g/mL。-,no obvious toxicity;unit of50,600value for spores and crystal mixture,滋g/mL for solution of crystal protein.菌株生物测定样品StrainBioassay sampleBMBLC胞晶混合物 Spore and crystal mixture晶体蛋白溶液 Solution of crystal proteinBMB0632胞晶混合物 Spore and crystal mixture晶体蛋白溶液 Solution of crystal proteinBMB0502胞晶混合物 Spore and crystal mixture晶体蛋白溶液 Solution of crystal proteinBMB0184胞晶混合物 Spore and crystal mixture晶体蛋白溶液 Solution of crystal proteinBMB0185胞晶混合物 Spore and crystal mixture晶体蛋白溶液 Solution of crystal protein回归方程Regression equation=0.5155+4.6652=0.7081+4.9362=1.0201+4.51=0.3856+4.9024-=0.7771+4.9053=0.5727+4.7973=0.74+4.9123=0.565+4.8225=0.6948+4.9002回归系数0.97710.99460.98270.9829-0.9890.99560.98660.97170.9879毒力/滋g mL-1504.472.43.021.79-1.332.261.322.061.39有关（Park,2000）。昆虫肠道一般是弱碱性环境，如果晶体蛋白在这种弱碱性环境中不能溶解，就不能对靶标昆虫表现出杀虫活性(Cheng.,1994)。难溶的 Cry7Ba1晶体蛋白进入昆虫肠道后不能被溶解和蛋白酶酶解活化，所以不能表现出毒力。该晶体蛋白这种难溶的特性给生物防治应用带来了很大困难。本研究通过置换 Cry7Ba1 晶体蛋白的 C-半段，有效地降低了其溶解所必须的 pH 值，为该晶体蛋白的生物防治应用提供了基础资料。参 考 文 献Arantes O and Lereclus D.Construction of cloning vectors for(J).,1991,1:108115Arvidson H,Dunn P E,Strnad S and Aronson A 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