高级生化技术实验精选PPT.ppt

高级生化技术实验第1页，此课件共85页哦实验内容安排实验内容安排40学时学时 实验一实验一 鸡卵类粘蛋白的分离与纯化鸡卵类粘蛋白的分离与纯化 实验二实验二 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量 实验三实验三 凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量实验四实验四 离子交换层析技术分离单核苷酸离子交换层析技术分离单核苷酸 第2页，此课件共85页哦掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；验技能；培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质；学作风、创新能力等综合素质；掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；纯化和测定技术的原理及方法；实验目的实验目的第3页，此课件共85页哦通过实验应该做到通过实验应该做到学习设计实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严学习设计实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生化实验仪器。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生化实验仪器。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是电泳掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。第4页，此课件共85页哦u 实验前应认真预习，写好实验前应认真预习，写好实验预习报告实验预习报告实验预习报告实验预习报告。实验中应及时。实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。准确地记录所观察到的现象和测量的数据。u 实验预习报告格式实验预习报告格式u 实验原理实验原理u 实验方法与步骤（实验方法与步骤（表格或流程式表格或流程式表格或流程式表格或流程式）u 主要仪器、材料主要仪器、材料u 实验数据记录表格实验数据记录表格u 预习遇到的问题预习遇到的问题uu 实验记录与实验报告实验记录与实验报告第5页，此课件共85页哦实验记录与实验报告实验记录与实验报告 实验报告实验报告实验报告实验报告是学生实验研究结果的记录和总结，同时也是评价学生是学生实验研究结果的记录和总结，同时也是评价学生实验课成绩的重要依据。实验课成绩的重要依据。实验报告的格式实验报告的格式 实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验方法与步骤实验方法与步骤 实验数据记录、处理及结果分析实验数据记录、处理及结果分析 思考题思考题 讨论、心得讨论、心得 注意注意注意注意：实验结果的讨论要充分，尽可能充分运用己学过的知识实验结果的讨论要充分，尽可能充分运用己学过的知识和生物化学技术原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分和生物化学技术原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。第6页，此课件共85页哦考核方式与评分方法考核方式与评分方法v 采取采取“学生实验平时考核学生实验平时考核学生实验平时考核学生实验平时考核”的方法进行实验考核。评分方法采的方法进行实验考核。评分方法采用百分制，每个环节都制定了用百分制，每个环节都制定了评分标准评分标准评分标准评分标准（见高级生化技术实验评（见高级生化技术实验评分标准）分标准）,各实验项目总成绩的平均值就是实验的成绩。各实验项目总成绩的平均值就是实验的成绩。vv 实验成绩实验成绩实验成绩实验成绩（预习成绩（预习成绩1010实验过程成绩实验过程成绩40%40%报告成绩报告成绩5050）N Nv 预习报告预习报告10101010v 实验过程实验过程40404040v 实验报告实验报告50505050v N N为所做实验项目的总个数为所做实验项目的总个数第7页，此课件共85页哦实验一实验一 鸡卵类粘蛋白的分离与纯化鸡卵类粘蛋白的分离与纯化第8页，此课件共85页哦【目的要求】【目的要求】【目的要求】【目的要求】掌握从鸡卵清中提取鸡卵类粘蛋白的原理及方法。掌握从鸡卵清中提取鸡卵类粘蛋白的原理及方法。了解凝胶过滤层析的工作原理，掌握基本操作技术。了解凝胶过滤层析的工作原理，掌握基本操作技术。掌握离子交换层析的工作原理及基本操作技术。掌握离子交换层析的工作原理及基本操作技术。第9页，此课件共85页哦鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白，它具有强烈的抑制蛋白酶的作用，常用，它具有强烈的抑制蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可于胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂将其制成亲和吸附剂将其制成亲和吸附剂将其制成亲和吸附剂，通过亲和，通过亲和层析技术有效的层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶分离与纯化胰蛋白酶分离与纯化胰蛋白酶分离与纯化胰蛋白酶。另外，还可用于分离纯化麦胚。另外，还可用于分离纯化麦胚凝集素。凝集素。【实验原理实验原理实验原理实验原理】鸡卵类粘蛋白在鸡卵类粘蛋白在中性及偏酸性溶液中较稳定中性及偏酸性溶液中较稳定中性及偏酸性溶液中较稳定中性及偏酸性溶液中较稳定，对热、高浓，对热、高浓 度脲及有机度脲及有机溶剂均有较高的耐受性，在溶剂均有较高的耐受性，在10101010三氯乙酸或三氯乙酸或三氯乙酸或三氯乙酸或50505050丙酮溶液中有较好的溶丙酮溶液中有较好的溶丙酮溶液中有较好的溶丙酮溶液中有较好的溶解度解度解度解度。本实验采用选择性变性沉淀、凝胶过滤柱层析、离子交换柱层。本实验采用选择性变性沉淀、凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析等方法分离纯化鸡卵类粘蛋白。析等方法分离纯化鸡卵类粘蛋白。第10页，此课件共85页哦选择性变性沉淀选择性变性沉淀选择性变性沉淀选择性变性沉淀在鸡蛋蛋清中，加入在鸡蛋蛋清中，加入 10101010TCATCATCATCA溶液作为初步分溶液作为初步分离，在离，在pH3.5pH3.5pH3.5pH3.5的条件下，的条件下，杂蛋白变性沉淀杂蛋白变性沉淀杂蛋白变性沉淀杂蛋白变性沉淀，离心后，上清液中，离心后，上清液中含有鸡卵类粘蛋白。含有鸡卵类粘蛋白。离子交换层析纯化离子交换层析纯化离子交换层析纯化离子交换层析纯化 不同蛋白质不同蛋白质pIpI不同，在同一不同，在同一pH pH 溶液中其电离有所溶液中其电离有所不同，利用不同，利用 DEAE-DEAE-纤维素纤维素离子交换柱层析离子交换柱层析离子交换柱层析离子交换柱层析，可，可将目标蛋白与杂蛋白将目标蛋白与杂蛋白将目标蛋白与杂蛋白将目标蛋白与杂蛋白分开分开分开分开。从而使鸡卵类粘蛋白得到进一步纯化。从而使鸡卵类粘蛋白得到进一步纯化。凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析 蛋白质相对分子质量较残留丙酮及蛋白质相对分子质量较残留丙酮及TCATCA大的多，选择大的多，选择Sephadex G-25Sephadex G-25Sephadex G-25Sephadex G-25依分子筛效应依分子筛效应依分子筛效应依分子筛效应，可去除粗分离样品中的小分子。，可去除粗分离样品中的小分子。第11页，此课件共85页哦 透析纯化透析纯化透析纯化透析纯化离子交换层析后，样品中盐的质量较高，需要离子交换层析后，样品中盐的质量较高，需要脱盐脱盐脱盐脱盐才才能得到纯品，一般采用能得到纯品，一般采用透析的方法透析的方法透析的方法透析的方法。蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定 鸡卵类粘蛋白在鸡卵类粘蛋白在280nm280nm处的消光系数处的消光系数=4.13=4.13，即蛋白质浓度为即蛋白质浓度为1mg/mL1mg/mL1mg/mL1mg/mL时溶液的吸光度时溶液的吸光度时溶液的吸光度时溶液的吸光度A A A A280280280280=0.413=0.413=0.413=0.413，据此可以测定其，据此可以测定其蛋白质的含量。蛋白质的含量。第12页，此课件共85页哦【操作方法】【操作方法】【操作方法】【操作方法】一、一、一、一、鸡卵类粘蛋白的提取鸡卵类粘蛋白的提取鸡卵类粘蛋白的提取鸡卵类粘蛋白的提取1)1)1)1)取取1 1个鸡蛋蛋清，加入个鸡蛋蛋清，加入等体积的等体积的等体积的等体积的1010TCATCATCATCA溶液，充分搅匀后，测定溶溶液，充分搅匀后，测定溶液的液的pHpH值（精密值（精密pHpH试纸），若偏离试纸），若偏离3.53.5，用，用10 NaOH NaOH 溶液溶液调调调调pH3.5pH3.5pH3.5pH3.5，室，室温温静置静置静置静置4h4h4h4h以上。以上。2)2)2)2)3000r/min3000r/min3000r/min3000r/min离心离心离心离心10min10min10min10min 。收集清液，再用滤纸过滤并检查滤液的。收集清液，再用滤纸过滤并检查滤液的pHpH值是否值是否3.53.5，若不是，则要调整。滤液量体积后转入，若不是，则要调整。滤液量体积后转入500 mL500 mL烧杯烧杯内，缓慢加入内，缓慢加入3 3 3 3倍体积冷丙酮倍体积冷丙酮倍体积冷丙酮倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放冰箱放冰箱放冰箱放置过夜置过夜置过夜置过夜。3)3)3)3)小心虹吸出部分上清液，剩余浑浊液转入小心虹吸出部分上清液，剩余浑浊液转入50mL50mL离心管中，离心管中，3500r/min 3500r/min 3500r/min 3500r/min 离心离心离心离心10min10min10min10min，弃清夜，将沉淀抽真空弃清夜，将沉淀抽真空弃清夜，将沉淀抽真空弃清夜，将沉淀抽真空去净丙酮。去净丙酮。第13页，此课件共85页哦4)4)4)4)量取量取100mL Sephadex G-25100mL Sephadex G-25100mL Sephadex G-25100mL Sephadex G-25,加入加入200mL pH6.5 200mL pH6.5 的磷酸盐缓冲液，的磷酸盐缓冲液，沸水中沸水中沸水中沸水中1h1h1h1h。冷却后脱气。冷却后脱气。冷却后脱气。冷却后脱气。7)7)7)7)取上述蛋白粗提液上取上述蛋白粗提液上Sephadex G-25Sephadex G-25层析柱。层析柱。控制流速控制流速控制流速控制流速15d/min15d/min15d/min15d/min，待样品全部入床后，用同样的缓冲液洗脱，待样品全部入床后，用同样的缓冲液洗脱，收集第收集第收集第收集第峰峰峰峰。在蛋白峰。在蛋白峰流出后盐及杂质才开始流出。流出后盐及杂质才开始流出。5)5)5)5)装柱（装柱（25300mm25300mm）用约用约2 2 2 2倍体积的倍体积的倍体积的倍体积的0.02mol/L,pH6.50.02mol/L,pH6.5磷酸盐磷酸盐缓缓缓缓冲液平衡冲液平衡冲液平衡冲液平衡。直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。6)6)6)6)离心管中加入离心管中加入20mL20mL20mL20mL蒸馏水溶解蒸馏水溶解蒸馏水溶解蒸馏水溶解，若溶解液浑浊，可用滤纸去，若溶解液浑浊，可用滤纸去掉不溶物。掉不溶物。第14页，此课件共85页哦二、二、二、二、鸡卵类粘蛋白的纯化鸡卵类粘蛋白的纯化鸡卵类粘蛋白的纯化鸡卵类粘蛋白的纯化1)1)1)1)处理离交剂处理离交剂处理离交剂处理离交剂 量取量取 DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-纤维素粉纤维素粉纤维素粉纤维素粉（DE-32DE-32）50 mL50 mL，用，用100 mL 100 mL 0.5 mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.5 mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.5 mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.5 mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡溶液浸泡溶液浸泡溶液浸泡20min 20min。用。用G-3G-3漏漏斗抽滤后再用蒸馏斗抽滤后再用蒸馏水洗至水洗至水洗至水洗至pH 8.0pH 8.0pH 8.0pH 8.0 左右，抽干。然后移至左右，抽干。然后移至250250 mLmL烧烧杯内，用杯内，用100100 mL mL 0.5 mol/L HCl0.5 mol/L HCl0.5 mol/L HCl0.5 mol/L HCl溶液浸泡溶液浸泡20min20min，再转移到，再转移到G-G-3 3漏斗内，抽滤，用蒸馏漏斗内，抽滤，用蒸馏水洗至水洗至水洗至水洗至pH6.0pH6.0pH6.0pH6.0左右，抽干。最后转移左右，抽干。最后转移到烧杯内，用到烧杯内，用60mL 0.02mol/L,pH 6.5 60mL 0.02mol/L,pH 6.5 磷酸盐缓冲液浸泡约磷酸盐缓冲液浸泡约15mim15mim，脱气后装柱脱气后装柱脱气后装柱脱气后装柱（15200mm15200mm）。）。第15页，此课件共85页哦2)2)2)2)装柱装柱装柱装柱 （小心操作）。用（小心操作）。用pH6.5pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，直至流出磷酸盐缓冲液平衡，直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。4)4)4)4)洗脱洗脱洗脱洗脱 改用改用含含含含0.3mol/LNaCl0.3mol/LNaCl0.3mol/LNaCl0.3mol/LNaCl的的的的0.02 mol/L pH 6.50.02 mol/L pH 6.50.02 mol/L pH 6.50.02 mol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲的磷酸盐缓冲液洗脱，收集鸡卵类粘蛋白的洗脱峰并量体积。液洗脱，收集鸡卵类粘蛋白的洗脱峰并量体积。3)3)3)3)上样吸附上样吸附上样吸附上样吸附 脱盐后的鸡卵类粘蛋白溶液上柱吸附。控制流速脱盐后的鸡卵类粘蛋白溶液上柱吸附。控制流速20d/20d/minmin，待样品全部入床后，用，待样品全部入床后，用 0.02mol/L 0.02mol/L，pH6.5pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，的磷酸盐缓冲液平衡，洗去未被吸附的杂蛋白，直至基线稳定。洗去未被吸附的杂蛋白，直至基线稳定。第16页，此课件共85页哦1)1)透析透析 将层析收集的蛋白样品将层析收集的蛋白样品装入透析袋装入透析袋装入透析袋装入透析袋内，对蒸馏水进行内，对蒸馏水进行透透透透析析析析，间隔，间隔1 12h2h更换一次蒸馏水，直至经更换一次蒸馏水，直至经1%AgNO1%AgNO3 3检查无氯离子为止检查无氯离子为止（过夜）。（过夜）。三、三、三、三、鸡卵类粘蛋白纯品的制备鸡卵类粘蛋白纯品的制备鸡卵类粘蛋白纯品的制备鸡卵类粘蛋白纯品的制备3)3)蛋白样品中加入蛋白样品中加入3 3 3 3倍体积的冷丙酮倍体积的冷丙酮倍体积的冷丙酮倍体积的冷丙酮，用塑料薄膜封口，在，用塑料薄膜封口，在冰箱冰箱冰箱冰箱静置静置静置静置4h4h4h4h。2)2)量透析后蛋白样品体积，转移到烧杯内。量透析后蛋白样品体积，转移到烧杯内。取出取出取出取出1mL,1mL,1mL,1mL,稀释稀释稀释稀释10101010倍，倍，倍，倍，在在紫外分光光度计上，紫外分光光度计上，280nm280nm280nm280nm处测定鸡卵类粘蛋白的含量处测定鸡卵类粘蛋白的含量处测定鸡卵类粘蛋白的含量处测定鸡卵类粘蛋白的含量。剩余样品小心。剩余样品小心用用1mol/L HCl1mol/L HCl调至调至pH4.0pH4.0。4)4)倾去上清，剩余浑浊液转移到倾去上清，剩余浑浊液转移到50mL50mL离心管内，于离心管内，于 3500r/min 3500r/min 3500r/min 3500r/min 离心离心离心离心10min10min10min10min,收集沉淀，将收集沉淀，将沉淀抽真空沉淀抽真空沉淀抽真空沉淀抽真空干燥，即可得到透明胶状物鸡卵干燥，即可得到透明胶状物鸡卵类粘蛋白纯品。类粘蛋白纯品。第17页，此课件共85页哦 BA 1)1)鸡卵类粘蛋白（鸡卵类粘蛋白（mg/mLmg/mL）=2)2)鸡卵类粘蛋白的产率（鸡卵类粘蛋白的产率（mg/mLmg/mL）=100mL=100mL鸡蛋清得到鸡卵粘蛋白的鸡蛋清得到鸡卵粘蛋白的mgmg数。数。3)3)绘制绘制Sephadex G-25Sephadex G-25柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。4)4)绘制离子交换柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。绘制离子交换柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。A A280280稀释倍数稀释倍数0.4130.413【思考题】【思考题】【思考题】【思考题】在鸡卵粘蛋白的提取、分离及纯化过程中，直接影响产率的在鸡卵粘蛋白的提取、分离及纯化过程中，直接影响产率的是哪几步？操作过程中应当注意什么？是哪几步？操作过程中应当注意什么？四、四、四、四、实验结果与数据处理实验结果与数据处理实验结果与数据处理实验结果与数据处理第18页，此课件共85页哦实验二实验二实验二实验二 SDSSDSSDSSDSPAGEPAGEPAGEPAGE测定蛋白质测定蛋白质测定蛋白质测定蛋白质 相对分子质量相对分子质量相对分子质量相对分子质量第19页，此课件共85页哦【目的要求目的要求目的要求目的要求】学习学习SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。运用运用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。测定蛋白质分子量及染色鉴定。第20页，此课件共85页哦【实验原理实验原理实验原理实验原理】电泳电泳电泳电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。移动的现象。PAGE PAGE PAGE PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（PAGPAG）是由）是由单体单体单体单体丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)(Acr)和交联剂和交联剂甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)在加速剂在加速剂四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)(TEMED)(TEMED)和催化剂和催化剂过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGEPAGEPAGEPAGE。第21页，此课件共85页哦 CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺N,N,N-N-甲叉甲叉甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺双丙烯酰胺双丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m第22页，此课件共85页哦SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白质样品中是在蛋白质样品中加入加入加入加入SDSSDSSDSSDS和含有和含有巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇的样品处的样品处理液，理液，SDSSDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结破坏蛋白质分子的二级和三级结破坏蛋白质分子的二级和三级结破坏蛋白质分子的二级和三级结构。构。构。构。强还原剂强还原剂巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇可以可以断开二硫键断开二硫键断开二硫键断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与解聚后的侧链与SDSSDS充分结合形成带负电荷的充分结合形成带负电荷的蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质-SDS-SDS-SDS-SDS 复合复合复合复合物。物。物。物。【SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE基本原理】基本原理】基本原理】基本原理】第23页，此课件共85页哦SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE ：在在PAGEPAGEPAGEPAGE中中，蛋蛋白白质质的的迁迁迁迁移移移移率率率率取取取取决决决决于于于于它它它它所所所所带带带带的的的的净净净净电电电电荷荷荷荷的的的的多多多多少少少少，分分子子的的大大小小和和形形状状。如如果果在在PAGPAG系系统统中中加加加加入入入入阴阴离离子子去去污污剂剂SDSSDSSDSSDS（十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠），蛋蛋白白质质分分子子表表面面完完全全被被负负电电荷荷所所覆覆盖盖，电电泳泳时时，其其迁迁迁迁移移移移率率率率取取取取决决决决于于于于蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的分子量大小分子量大小分子量大小分子量大小而而与其所带电荷和形状无关。与其所带电荷和形状无关。PAG PAG PAG PAG 具有机械强度好，有弹性，透明，化学性具有机械强度好，有弹性，透明，化学性 质稳定，对质稳定，对pHpH和温度变化小，没有吸附和电渗作和温度变化小，没有吸附和电渗作 用小的特点。改变用小的特点。改变AcrAcr浓度或浓度或AcrAcr与与BisBis的比例可以得的比例可以得到到不同不同 孔径的凝胶。孔径的凝胶。第24页，此课件共85页哦当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在17,00017,000165,000165,000之间时，之间时，蛋白质蛋白质-SDS-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=K-bmlgMW=K-bm 蛋白质分子蛋白质分子结合结合结合结合SDSSDSSDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远阴离子后，所带负电荷的量远 远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋 白质之间所带净电荷的差异。白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移蛋白质的电泳迁移蛋白质的电泳迁移蛋白质的电泳迁移 率主要决定于亚基的相对分子质量。率主要决定于亚基的相对分子质量。率主要决定于亚基的相对分子质量。率主要决定于亚基的相对分子质量。第25页，此课件共85页哦将已知分子量的将已知分子量的标准蛋白质标准蛋白质标准蛋白质标准蛋白质在在SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE 中的电泳迁移率中的电泳迁移率对分对分对分对分子量的对数作图子量的对数作图子量的对数作图子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。线求得其分子量。SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统和和不不连连续续系系统统两两大大类类。连连续续系系统统是是指指电电泳泳槽槽中中缓缓冲冲液液的的pHpH值值与与凝凝胶胶中中的的相相同同.连连连连续续续续体系体系体系体系中中由电极缓冲液由电极缓冲液由电极缓冲液由电极缓冲液、和分离胶组成和分离胶组成和分离胶组成和分离胶组成。第26页，此课件共85页哦不连续体系由不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离电极缓冲液、浓缩胶及分离胶胶胶胶所组成。所组成。浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶是是大大大大孔胶孔胶孔胶孔胶，凝胶缓冲液为，凝胶缓冲液为pH6.7pH6.7pH6.7pH6.7的的的的Tris-HC1Tris-HC1Tris-HC1Tris-HC1。分离胶是小孔胶分离胶是小孔胶分离胶是小孔胶分离胶是小孔胶，凝，凝胶缓冲液为胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1pH8.9 Tris-HC1pH8.9 Tris-HC1pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液电极缓冲液电极缓冲液电极缓冲液是是pH8.3pH8.3pH8.3pH8.3 Tris-Gly Tris-Gly Tris-Gly Tris-Gly缓冲缓冲液。液。2 2种孔径的凝胶、种孔径的凝胶、2 2种缓冲体系、种缓冲体系、3 3种种pHpH值使不连续体系形成值使不连续体系形成了凝胶孔径、了凝胶孔径、pHpH值、缓冲液离子成分的不连续性。值、缓冲液离子成分的不连续性。第27页，此课件共85页哦 浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩胶浓缩胶pH6.7pH6.7浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液Tris-HCl,Tris-HCl,电极缓冲液电极缓冲液Tris-GlyTris-Gly解离度解离度 ：ClCl 蛋蛋 GlyGly m mclcl clclmm蛋蛋 蛋蛋m m GlyGly GlyGlyv凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子，GlyGly为慢离为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。子，蛋白质样品被夹在中间。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液样品样品样品样品浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶分离胶分离胶 SDS-PAGE SDS-PAGE过程有浓缩效应和分子筛效应过程有浓缩效应和分子筛效应过程有浓缩效应和分子筛效应过程有浓缩效应和分子筛效应第28页，此课件共85页哦浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 样品样品样品样品浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶分离胶分离胶第29页，此课件共85页哦浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应样品进入浓缩胶有一个堆积浓样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应缩效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。变慢，堆积浓缩。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 样品样品样品样品浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶分离胶分离胶第30页，此课件共85页哦浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。变慢，堆积浓缩。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶样品样品样品样品分离胶分离胶分离胶分离胶第31页，此课件共85页哦浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应样品进入浓缩胶有一个堆积浓样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应缩效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。变慢，堆积浓缩。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶样品样品样品样品分离胶分离胶分离胶分离胶第32页，此课件共85页哦 分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离解离度增大，不存在快、慢离子之度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强分，蛋白质样品在均一电场强度和度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。由于各种蛋白质分子量不同，由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的因此质点的 有效迁移率不有效迁移率不同，形成不同区带。同，形成不同区带。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶分离胶分离胶第33页，此课件共85页哦分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应分离胶的孔径小，各分子由于分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的同，表现出不同的 泳动速度，泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。状为球形的泳动速度最快。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶分离胶分离胶第34页，此课件共85页哦【操作方法操作方法操作方法操作方法】、安装、安装、安装、安装夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽 1)1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。2)2)将将长长、短短玻玻璃璃板板分分别别插插到到凵凵形形硅硅橡橡框框的的凹凹形形槽槽中中，注注意意勿勿用用手手接接触灌胶面的玻璃。触灌胶面的玻璃。3)3)将将已已插插好好玻玻璃璃板板的的凝凝胶胶模模平平放放在在上上贮贮槽槽上上，短短玻玻璃璃板板应应面面对对上上贮槽。贮槽。4)4)将将下下贮贮槽槽的的销销孔孔对对准准已已装装好好螺螺丝丝销销钉钉的的上上贮贮槽槽，双双手手对对角角线线的的方式旋紧螺丝帽。方式旋紧螺丝帽。5)5)竖竖直直电电泳泳槽槽，在在长长玻玻璃璃板板下下端端与与硅硅胶胶模模框框交交界界的的缝缝隙隙加加入入已已融融化化的的1%1%琼琼脂脂(糖糖)。其其目目的的是是封封住住空空隙隙，凝凝固固后后的的琼琼脂脂(糖糖)中中应应避免有气泡。避免有气泡。第35页，此课件共85页哦1 1 1 1）分离胶的制备）分离胶的制备）分离胶的制备）分离胶的制备（按表按表按表按表3-23-23-23-2配制配制配制配制10%10%10%10%的分离胶的分离胶的分离胶的分离胶）将将制制备备的的分分离离胶胶溶溶液液，加加至至长长、短短玻玻璃璃板板间间的的窄窄缝缝内内，加加胶胶高高度度距距样样品品模模板板梳梳齿齿下下缘缘约约1 1 cmcm。用用1 1 mLmL注注射射器器在在凝凝胶胶表表面面沿沿短短玻玻璃璃板板边边缘缘轻轻轻轻加加一一层层重重蒸蒸水水(约约3 34 4 mm)mm)，用用于于隔隔绝绝空空气气，使使胶胶面面平平整整。约约30-60 30-60 minmin凝凝胶胶完完全全聚聚合合，则则可可看看到到水水与与凝凝固固的的胶胶面面有有折折射射率率不不同同的的界界线线。将将贮贮槽槽的的蒸蒸馏馏水水倒倒去去 ，用用细细条条滤滤纸吸去残留的水液。纸吸去残留的水液。2 2、凝胶的制备凝胶的制备凝胶的制备凝胶的制备第36页，此课件共85页哦 将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，距短玻璃将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，距短玻璃上缘上缘0.5 cm0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，30 min30 min左右，上胶左右，上胶即可聚合，再放置即可聚合，再放置10-20 min10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约玻璃板约0.5 cm0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。，轻轻取出样品槽模板，即可加样。2 2 2 2）浓缩胶的制备（）浓缩胶的制备（）浓缩胶的制备（）浓缩胶的制备（按表按表按表按表3-23-23-23-2配制配制配制配制3%3%3%3%的浓缩胶）的浓缩胶）的浓缩胶）的浓缩胶）第37页，此课件共85页哦3 3 3 3、蛋白质样品的处理、蛋白质样品的处理、蛋白质样品的处理、蛋白质样品的处理1 1 1 1）标准蛋白质样品的处理）标准蛋白质样品的处理）标准蛋白质样品的处理）标准蛋白质样品的处理低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B MW=97,400 MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 MW=66,200 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400 开封后溶于开封后溶于200200l l样品溶解液样品溶解液样品溶解液样品溶解液中，沸水浴中加热中，沸水浴中加热3-3-5 5minmin后上样。后上样。第38页，此课件共85页哦b)b)称称制备样品制备样品1mg1mg，按，按1mg/mL1mg/mL溶液比例溶液比例加加样品溶解液样品溶解液样品溶解液样品溶解液，将其转移到，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸不要塞紧，以免加热时迸出出)，在，在100100沸水浴中加热沸水浴中加热3min3min，取出冷却后加样。，取出冷却后加样。2 2 2 2）待测样品处理）待测样品处理）待测样品处理）待测样品处理 a)a)称称1 1、2 2、3 3号待测样品各号待测样品各1 1mgmg，按按1mg/mL1mg/mL溶液比例，加溶液比例，加 样品溶解液样品溶解液样品溶解液样品溶解液，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖 上盖子，在上盖子，在100100沸水浴中加热沸水浴中加热3min3min，取出冷却后加，取出冷却后加 样。样。第39页，此课件共85页哦 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为泳仪开关，开始时电流为10 mA10 mA，待样品进入分离胶后，将电流，待样品进入分离胶后，将电流调至调至20-30 mA20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm1 cm时，停止电泳，关闭电源。时，停止电泳，关闭电源。5 5、电泳、电泳、电泳、电泳4 4 4 4、加样、加样、加样、加样用移液器分别取用移液器分别取10 l l样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。并槽底部。并做好标记。做好标记。做好标记。做好标记。第40页，此课件共85页哦StakinggelSeparatinggel第41页，此课件共85页哦第42页，此课件共85页哦7 7 7 7、结果处理结果处理结果处理结果处理 量量出出加加样样端端距距细细铜铜丝丝间间的的距距离离(cm)(cm)以以及及各各蛋蛋白白质质样样品品区区带带中中心心与与加加样端的距离样端的距离(cm)(cm)，按下式计算相对迁移率，按下式计算相对迁移率m mR R：相对迁移率相对迁移率m mR R=蛋白质样品迁移距离蛋白质样品迁移距离(cm)(cm)溴酚蓝区带距加样端距离溴酚蓝区带距加样端距离(cm)(cm)6 6、染色与脱色、染色与脱色、染色与脱色、染色与脱色 电电泳泳结结束束后后，取取下下凝凝胶胶模模，卸卸下下硅硅胶胶框框，用用不不锈锈钢钢药药铲铲撬撬开开短短玻玻璃璃板板，从从凝凝胶胶板板上上切切下下一一角角作作为为加加样样标标记记，在在两两侧侧溴溴酚酚蓝蓝染染料料区区带带中中心心，插插入入细细铜铜丝丝作作为为前前沿沿标标记记。加加入入染染色色液液染染色色1-2 1-2 h h，再再用用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。第43页，此课件共85页哦第44页，此课件共85页哦【注意事项注意事项注意事项注意事项】1 1）安安装装电电泳泳槽槽时时要要注注意意均均匀匀用用力力旋旋紧紧固固定定螺螺丝丝，避避免免缓缓冲冲液液渗漏。渗漏。2 2）用用琼琼脂脂(糖糖)封封底底及及灌灌胶胶时时不不能能有有气气泡泡，以以免免电电泳泳时时影影响响电电流流的的通过。通过。3 3）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡