第七课样品的全息制备PPT讲稿.ppt

第七课样品的全息制备第1页，共78页，编辑于2022年，星期二 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样蛋白质，但由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是有难度的。当然，样品制备的等，要达到真正的全息制备是有难度的。当然，样品制备的方法还必须与后续的分离或鉴定方法相匹配，如采用双向凝方法还必须与后续的分离或鉴定方法相匹配，如采用双向凝胶电泳，需谨慎使用胶电泳，需谨慎使用SDS抽提蛋白质，如果以液相色谱作为抽提蛋白质，如果以液相色谱作为分离手段，太多的去污剂和两性电解质不是一个好的选择。分离手段，太多的去污剂和两性电解质不是一个好的选择。更重要的是，样品的来源千差万别，针对不同来源的样品更重要的是，样品的来源千差万别，针对不同来源的样品(如细胞样品、动物组织样品、植物样品、体液等如细胞样品、动物组织样品、植物样品、体液等)，需要采，需要采取不同的蛋白质抽提方法。本章就常规样品的制备和不同来取不同的蛋白质抽提方法。本章就常规样品的制备和不同来源蛋白质的样品制备进行详细阐述。源蛋白质的样品制备进行详细阐述。第2页，共78页，编辑于2022年，星期二实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高。纯度高、周期长、设备要求高。碱溶法碱溶法 质粒质粒DNA纯度低、快速、操作简便。纯度低、快速、操作简便。沸水浴法沸水浴法 质粒质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间。和碱溶法之间。第3页，共78页，编辑于2022年，星期二质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化 碱溶法：碱溶法：用含有用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体；的缓冲液悬浮菌体；加溶菌酶裂解细菌细胞壁；加溶菌酶裂解细菌细胞壁；加加NaOH和和SDS的混合溶液，去膜释放内含物；的混合溶液，去膜释放内含物；加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质；及大部分蛋白质；离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；质；乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA；用无用无DNase的的RNase去除残余的去除残余的RNA；第4页，共78页，编辑于2022年，星期二第一节 双向凝胶电泳常规样品制备及其改进 一、概一、概 述述 目前蛋白质组研究技术发展很快，新的研究方法和研究手段不断涌目前蛋白质组研究技术发展很快，新的研究方法和研究手段不断涌现，如毛细管等电聚焦、多维色谱、分子扫描仪和微流芯片等。而双向现，如毛细管等电聚焦、多维色谱、分子扫描仪和微流芯片等。而双向凝胶电泳凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis)技术是蛋白质组研究技术是蛋白质组研究中最早的支撑技术之一。由于双向凝胶电泳技术具有高分辨率、高重复中最早的支撑技术之一。由于双向凝胶电泳技术具有高分辨率、高重复性、微量分析和制备等性能，仍然是当今蛋白质组分析研究中的一个强性、微量分析和制备等性能，仍然是当今蛋白质组分析研究中的一个强有力的工具。因而针对双向凝胶电泳样品制备方法的探索也是蛋白质组有力的工具。因而针对双向凝胶电泳样品制备方法的探索也是蛋白质组研究的一个重要方面。研究的一个重要方面。所以，在样品制备过程中，一切影响等电聚焦和凝胶电泳的因素都应所以，在样品制备过程中，一切影响等电聚焦和凝胶电泳的因素都应该考虑在内。样品制备绝对是一门艺术，方法可以从简单的缓冲液溶该考虑在内。样品制备绝对是一门艺术，方法可以从简单的缓冲液溶解，到应用离液剂、还原剂及去污剂来进行复合物提取，以及到更复杂解，到应用离液剂、还原剂及去污剂来进行复合物提取，以及到更复杂的顺序提取的顺序提取(sequence extracting)和亚细胞分级等。由于实验需求的不和亚细胞分级等。由于实验需求的不同以及样品本身的特殊性，没有一种样品制备方法能够广泛地适用于各同以及样品本身的特殊性，没有一种样品制备方法能够广泛地适用于各种各样的样品。所以，对于每一个有着不同要求的样品，都需要通过大种各样的样品。所以，对于每一个有着不同要求的样品，都需要通过大量的实验来摸索最合适的实验条件。有效的可重复的样品制备方法是双量的实验来摸索最合适的实验条件。有效的可重复的样品制备方法是双向凝胶电泳成功的关键。向凝胶电泳成功的关键。第5页，共78页，编辑于2022年，星期二一般来说，一种理想的有效的样品制备方法应该满足以下几一般来说，一种理想的有效的样品制备方法应该满足以下几点要求。点要求。在合适盐浓度下，可重复地溶解所有的蛋白质，在合适盐浓度下，可重复地溶解所有的蛋白质，包括疏水性蛋白质，并使样品中的蛋白质以分离的包括疏水性蛋白质，并使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在。多肽链形式存在。避免溶解性低的蛋白质避免溶解性低的蛋白质(如膜蛋白如膜蛋白)在等电聚焦时在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出。由于溶解度降低而沉淀析出。防止蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白防止蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰。酶或尿素热分解后所引起的修饰。排除核酸、多糖、脂类和其他干扰分子。排除核酸、多糖、脂类和其他干扰分子。获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要去获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要去除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。第6页，共78页，编辑于2022年，星期二二、样品裂解液中各种成分分析二、样品裂解液中各种成分分析 为获得最佳的双向电泳分离结果，样品一般使用为获得最佳的双向电泳分离结果，样品一般使用促溶剂、去污剂、还原剂、促溶剂、去污剂、还原剂、IPG缓冲液和两性电解缓冲液和两性电解质等将其变性并充分溶解。然而这些化学物质应满质等将其变性并充分溶解。然而这些化学物质应满足一些化学和电学要求，如适合足一些化学和电学要求，如适合IPG胶条的胶条的IEF技术、技术、保持蛋白质最大的溶解性和尽可能低的离子强度保持蛋白质最大的溶解性和尽可能低的离子强度(等等电聚焦加以高电压时，低离子强度使得电流很低，电聚焦加以高电压时，低离子强度使得电流很低，保证了聚焦的快速和高效保证了聚焦的快速和高效)。第7页，共78页，编辑于2022年，星期二(一一)离液剂离液剂 尿素是最常用的离液剂尿素是最常用的离液剂(chaotropic agent)，它，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性。尿素和硫脲有效地破坏了疏水键，防止的溶解性。尿素和硫脲有效地破坏了疏水键，防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性。然而硫脲在水中构的形成会改变蛋白质的迁移性。然而硫脲在水中的溶解性很差，需要高浓度的尿素来助溶，因此在的溶解性很差，需要高浓度的尿素来助溶，因此在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2molL硫脲和硫脲和58molL尿素联合使用。尿素联合使用。第8页，共78页，编辑于2022年，星期二(二二)还原剂还原剂 还原剂还原剂(reducing agent)主要是用来断裂蛋白质分子中主要是用来断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的还原剂有还原剂有巯基乙醇、巯基乙醇、DTT或或DTE(Dithioerythreit01)和和三丁基膦三丁基膦(TBP)等。其中等。其中DTT是使用比较广泛的还原剂，它是使用比较广泛的还原剂，它在在50mmolL时能有效地还原大部分的二硫键，但有些蛋时能有效地还原大部分的二硫键，但有些蛋白质仍不能完全被还原。但是如果过分提高白质仍不能完全被还原。但是如果过分提高DTT的浓度，的浓度，由于它的由于它的pKa在在8左右，因而会影响到左右，因而会影响到pH梯度。另外，梯度。另外，DTT在碱性在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足，导致二硫键复原，蛋损耗而不足，导致二硫键复原，蛋白质沉淀。而非离子型还原剂白质沉淀。而非离子型还原剂TBP则比则比DTT更加有效，能大更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。还原。第9页，共78页，编辑于2022年，星期二(三三)去污剂去污剂 去污剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作去污剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。去污剂用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的去有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的去污剂有阴离子去污剂污剂有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂，非离子去污剂TritonX-100和和NP-40，两性离子去污剂，两性离子去污剂CHAPS等。原则上去污剂应该是非离等。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦，不利于等电聚焦，然而由于然而由于SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的初级阶段。在此一般只用于样品处理的初级阶段。在SDS浓度不高于浓度不高于0.3时，对等电聚焦不会产生太大的影响。现多数以兼性离子时，对等电聚焦不会产生太大的影响。现多数以兼性离子去污剂去污剂CHAPS代替。代替。CHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更强，其使用浓度一般在酸残基的能力更强，其使用浓度一般在12。然而它在。然而它在高浓度脲中的溶解度比较低，因此不断有新的去污剂涌现出高浓度脲中的溶解度比较低，因此不断有新的去污剂涌现出来。来。第10页，共78页，编辑于2022年，星期二(四四)两性电解质载体两性电解质载体 在去污剂存在的情况下，某些蛋白质在等电聚焦的时候仍在去污剂存在的情况下，某些蛋白质在等电聚焦的时候仍旧容易沉淀在它们的等电点上。为了防止这种现象的出现需旧容易沉淀在它们的等电点上。为了防止这种现象的出现需要向蛋白质溶液中加入某些盐类以增加蛋白质溶解度，但是要向蛋白质溶液中加入某些盐类以增加蛋白质溶解度，但是与此同时这些盐类又会使聚焦效果不理想。为了解决这个问与此同时这些盐类又会使聚焦效果不理想。为了解决这个问题，通常在缓冲液中加入两性电解质作为载体。两性电解质题，通常在缓冲液中加入两性电解质作为载体。两性电解质能够促进蛋白质的溶解，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰能够促进蛋白质的溶解，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子酸盐离子(cyanateions)，离心时还有助于核酸的沉淀。此，离心时还有助于核酸的沉淀。此外，它还可以阻止样品蛋白质和外，它还可以阻止样品蛋白质和IPG胶条中固相化的两性电胶条中固相化的两性电解质相互作用。一定浓度的两性电解质会提高蛋白质溶解解质相互作用。一定浓度的两性电解质会提高蛋白质溶解性，在第一向等电聚焦时，提高极性端蛋白质的聚焦效果。性，在第一向等电聚焦时，提高极性端蛋白质的聚焦效果。第11页，共78页，编辑于2022年，星期二 以上介绍的是常规使用的各种裂解液成分对样品蛋白质的以上介绍的是常规使用的各种裂解液成分对样品蛋白质的作用，保证蛋白质达到最大的溶解度并适合双向凝胶电泳。作用，保证蛋白质达到最大的溶解度并适合双向凝胶电泳。关于裂解液的配方，由于不同实验室有着不同的习惯和需关于裂解液的配方，由于不同实验室有着不同的习惯和需求，配方也千差万别。求，配方也千差万别。Gorg总结了三种裂解液的配方：总结了三种裂解液的配方：9mol/L脲，脲，1(m/V)DTT，2-4(m/V)CHAPS，2(V/V)两性电解质，两性电解质，pH3-10和和10mmol/L Pefabloc蛋白酶抑蛋白酶抑制剂。制剂。7mol/L脲，脲，2mol/L硫脲，硫脲，1(m/V)DTIT，24(m/V)CHAPS，2(V/V)两性电解质，两性电解质，pH310和和10mmol/L Pefabloc蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂。热的热的SDS缓冲液：缓冲液：1(m/V)SDS，100mmolLTris-HCl，pH7.0，该缓冲液裂解样品后至少，该缓冲液裂解样品后至少3倍稀释于倍稀释于1或或2的裂解液中。的裂解液中。根据目标蛋白质的特性和实验要求，我们同样可以摸索出根据目标蛋白质的特性和实验要求，我们同样可以摸索出更合适的裂解液配方，进行有效重复的样品制备。更合适的裂解液配方，进行有效重复的样品制备。第12页，共78页，编辑于2022年，星期二三、三、双向凝胶电泳常规样品制备双向凝胶电泳常规样品制备 样品制备时要使用新鲜的样品或者将新鲜样品速冻样品制备时要使用新鲜的样品或者将新鲜样品速冻(液氮液氮或或70)保存；注意防止污染，佩戴乳胶手套等。整个操保存；注意防止污染，佩戴乳胶手套等。整个操作过程在冷库或冰浴中进行，避免蛋白质的降解、修饰。作过程在冷库或冰浴中进行，避免蛋白质的降解、修饰。下面以最简单的培养细胞的样品制备为例，介绍操作步骤下面以最简单的培养细胞的样品制备为例，介绍操作步骤如下。如下。常规细胞培养，待长至常规细胞培养，待长至80左右密度时，在处理前一天更左右密度时，在处理前一天更换新鲜培养液。换新鲜培养液。吸去培养液，用预冷吸去培养液，用预冷PBS清洗细胞，重复清洗细胞，重复3次。次。按按1 X 106细胞加细胞加50tl的量往培养皿中加裂解液的量往培养皿中加裂解液(8molL Urea，4CHAPS，40mmolLTris，65mmolLDTT)，刮刀收集。刮刀收集。进行超声波处理，处理时间为进行超声波处理，处理时间为5s，间歇时间为，间歇时间为10s，功率，功率为为100120W，超声处理至溶液清澈无黏稠物为止。，超声处理至溶液清澈无黏稠物为止。4、25 000g离心离心1h。取上清测蛋白质浓度后，分装后取上清测蛋白质浓度后，分装后70冰箱中冻存。冰箱中冻存。第13页，共78页，编辑于2022年，星期二四、蛋白质顺序提取法四、蛋白质顺序提取法 由于在由于在2-DE胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白质的胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白质的拷贝数、蛋白质的上样量及电泳后染色方法的灵敏度。为了能够富集低拷贝数、蛋白质的上样量及电泳后染色方法的灵敏度。为了能够富集低拷贝蛋白质，很多实验室采用了样品预分级的方法，如亚细胞分级、亲拷贝蛋白质，很多实验室采用了样品预分级的方法，如亚细胞分级、亲和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶解性的顺序提取法等。另和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶解性的顺序提取法等。另外，窄外，窄pH范围的范围的lPG胶条在一定意义上也可以说是富集了低拷贝蛋白胶条在一定意义上也可以说是富集了低拷贝蛋白质，提高了低丰度蛋白质在质，提高了低丰度蛋白质在2-DE中的分辨率。中的分辨率。这里主要介绍蛋白质顺序提取法，它是根据蛋白质溶解性差异，用具这里主要介绍蛋白质顺序提取法，它是根据蛋白质溶解性差异，用具有不同溶解能力的溶解液进行顺序提取，从而提高了样品在有不同溶解能力的溶解液进行顺序提取，从而提高了样品在2-DE中的可中的可检测范围。其具体操作步骤如下所述。检测范围。其具体操作步骤如下所述。溶液溶液A(40mmolLTris)提取：将细胞裂解，振荡混匀，提取：将细胞裂解，振荡混匀，12 000rmin离心离心8min，取上清，抽提出细胞中的可溶性蛋白质。，取上清，抽提出细胞中的可溶性蛋白质。溶液溶液B(8molL脲，脲，4CHAPS，25mmolDTT)提取：在上一步的提取：在上一步的沉淀物中加入溶液沉淀物中加入溶液B，振荡混匀，振荡混匀，12 000rmin离心离心8min，取上清。，取上清。溶液溶液C(5molL脲，脲，2molL硫脲，硫脲，2CHAPS，2SB310、2mmolLTBP)提取：上一步的沉淀物用溶液提取：上一步的沉淀物用溶液A洗洗2次，加溶液次，加溶液C，振荡，振荡混匀，混匀，12 000rmin离心离心8min，取上清。，取上清。第14页，共78页，编辑于2022年，星期二 如有必要也可用更强烈的溶解液进行第四步提取，这样就如有必要也可用更强烈的溶解液进行第四步提取，这样就根据蛋白质溶解性不同，提取出了不同的蛋白质组分，对疏根据蛋白质溶解性不同，提取出了不同的蛋白质组分，对疏水性很强的蛋白质如膜蛋白和低丰度的蛋白质起了富集作用。水性很强的蛋白质如膜蛋白和低丰度的蛋白质起了富集作用。顺序提取法是目前获得更多蛋白质点的一种良好策略。，应顺序提取法是目前获得更多蛋白质点的一种良好策略。，应用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得10002000个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，对不同个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，对不同组分进行分离，据报道能够获得上万个不同的蛋白质点。在组分进行分离，据报道能够获得上万个不同的蛋白质点。在样品量充足的情况下，先进行亚细胞器分级，然后对各个分样品量充足的情况下，先进行亚细胞器分级，然后对各个分级组分再进行顺序提取，可以在一定程度上富集溶解度差及级组分再进行顺序提取，可以在一定程度上富集溶解度差及低丰度的蛋白质，尽量把细胞中的全部蛋白质提取出来。低丰度的蛋白质，尽量把细胞中的全部蛋白质提取出来。第15页，共78页，编辑于2022年，星期二五、注意事项五、注意事项 以上介绍的是双向凝胶电泳蛋白质样品制备的一些常规方法。然而这以上介绍的是双向凝胶电泳蛋白质样品制备的一些常规方法。然而这些制备方法并不是十分完善的，相信随着不断的实验探索，会有更理想些制备方法并不是十分完善的，相信随着不断的实验探索，会有更理想的制备方法出现。但不管采用什么方法，都应该注意以下问题。的制备方法出现。但不管采用什么方法，都应该注意以下问题。在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。因在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。因此，在样品制备过程中可选择合适的增溶试剂此，在样品制备过程中可选择合适的增溶试剂(如脲、硫脲等如脲、硫脲等)，以减少，以减少疏水性蛋白质的损失。疏水性蛋白质的损失。选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量除去核酸、多糖、脂类等于扰分子。尽量除去核酸、多糖、脂类等于扰分子。防止蛋白质在样品处理过程中的人为修饰，制备过程应在低温下进防止蛋白质在样品处理过程中的人为修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(建议加入合适的蛋白酶抑建议加入合适的蛋白酶抑制剂制剂)；含有脲的试剂不要加热；含有脲的试剂不要加热(温度不高于温度不高于37)，避免尿素分解产生的，避免尿素分解产生的异硫氰酸盐引起氨基甲酰化而导致电荷的不均一性；佩戴乳胶手套，减异硫氰酸盐引起氨基甲酰化而导致电荷的不均一性；佩戴乳胶手套，减少来自头发和皮肤的角蛋白污染。少来自头发和皮肤的角蛋白污染。裂解液新鲜配置，分装后置裂解液新鲜配置，分装后置80冰箱中保存，注意不要反复冻融。冰箱中保存，注意不要反复冻融。样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或者直接以液体状态置样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或者直接以液体状态置-80冰箱中保存，但要注意不要反复冻融。冰箱中保存，但要注意不要反复冻融。第16页，共78页，编辑于2022年，星期二第二节 培养细胞蛋白质样品的制备 在蛋白质组研究中，我们经常利用细胞培养技术，观察细胞在不同生在蛋白质组研究中，我们经常利用细胞培养技术，观察细胞在不同生理条件下的蛋白质动态变化。下面主要介绍关于细胞破碎样品的几种制理条件下的蛋白质动态变化。下面主要介绍关于细胞破碎样品的几种制备方法。备方法。一、细胞破碎的处理方法一、细胞破碎的处理方法细胞破碎主要包括机械和化学方法两种。由于在细胞破碎时会释放出一细胞破碎主要包括机械和化学方法两种。由于在细胞破碎时会释放出一些蛋白酶及其他引起蛋白质修饰的酶。为了避免这种情况，样品中应加些蛋白酶及其他引起蛋白质修饰的酶。为了避免这种情况，样品中应加蛋白酶抑制剂，同时尽量将样品直接加入强变性裂解液中，在低温及使蛋白酶抑制剂，同时尽量将样品直接加入强变性裂解液中，在低温及使用预冷的溶液下进行操作。根据裂解程度的不同，细胞破碎方法又可分用预冷的溶液下进行操作。根据裂解程度的不同，细胞破碎方法又可分为以下两种。为以下两种。(一一)温和的裂解方法温和的裂解方法裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。有时在制备样品的时候需要多种裂解方法综合使用来获得基体和膜等。有时在制备样品的时候需要多种裂解方法综合使用来获得目标蛋白质。如表目标蛋白质。如表13.1所示为温和裂解方法的应用对象和操作步骤。所示为温和裂解方法的应用对象和操作步骤。第17页，共78页，编辑于2022年，星期二(二二)更强烈的破碎方法更强烈的破碎方法 当破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或当破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或有坚韧细胞壁的细胞时，需要采用更强烈的破碎方有坚韧细胞壁的细胞时，需要采用更强烈的破碎方法对细胞进行破碎裂解。这些方法可使细胞完全破法对细胞进行破碎裂解。这些方法可使细胞完全破碎裂解，但在操作过程中应避免产热及产生泡沫。碎裂解，但在操作过程中应避免产热及产生泡沫。主要的方法如表主要的方法如表13.2所示。所示。第18页，共78页，编辑于2022年，星期二二、培养细胞总蛋白质的提取二、培养细胞总蛋白质的提取 裂解液裂解方法是很多实验室常用的裂解组织培养细胞的裂解液裂解方法是很多实验室常用的裂解组织培养细胞的样品制备方法。下面就裂解液裂解方法展开讨论，以下的操样品制备方法。下面就裂解液裂解方法展开讨论，以下的操作过程均在冰浴中进行。作过程均在冰浴中进行。这里所涉及的裂解液成分为：这里所涉及的裂解液成分为：8mol/L脲，脲，65mmol/LDTT，4CHAPS，40mmol/LTris。1胰酶酶解后裂解胰酶酶解后裂解细胞培养在直径为细胞培养在直径为10cm的培养皿中，待培养至的培养皿中，待培养至80左右密左右密度时，以含度时，以含0.02EDTA的的005胰蛋白酶消化，细胞经胰蛋白酶消化，细胞经预冷的预冷的PBS漂洗漂洗3次，离心收集在次，离心收集在15ml离心管中，加离心管中，加450l裂解液，反复吹打。裂解液，反复吹打。2皿上直接裂解皿上直接裂解细胞培养在直径为细胞培养在直径为10cm的培养皿中，待培养至的培养皿中，待培养至80左右密左右密度时，细胞用预冷的度时，细胞用预冷的PBS漂洗漂洗3次，加次，加4501裂解液，细胞裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复吹打。离心管中，反复吹打。第19页，共78页，编辑于2022年，星期二3热热SDS裂解裂解 细胞培养在直径为细胞培养在直径为10cm的培养皿中，待培养至的培养皿中，待培养至80左右密度时，细左右密度时，细胞用预冷的胞用预冷的PBS漂洗漂洗3次，加次，加450l热的热的SDS裂解液裂解液(每每10ml中，中，10SDS 300l，-巯基乙醇巯基乙醇100l，1.5mol/L TrisHCl，pH8.8，300l，去离子水去离子水9.3ml)，细胞刮刀收集，用移液器转移至，细胞刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复离心管中，反复吹打后，把离心管置人液氮中迅速冷冻。在不加热情况下，真空离心冻吹打后，把离心管置人液氮中迅速冷冻。在不加热情况下，真空离心冻干样品。用原来体积的样品缓冲液重新溶解样品干样品。用原来体积的样品缓冲液重新溶解样品(100ml中，尿素中，尿素59.7g，NP-40 4g，DTT1.54g，两性电解质，两性电解质pH310 5.5g，去离子水，去离子水44.9m1)。最终所有的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为最终所有的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为5s，间歇时，间歇时间为间为10s，功率为，功率为100120W，超声处理至溶液清澈无黏稠物为止，处，超声处理至溶液清澈无黏稠物为止，处理过程在冰浴中进行。超声处理后，理过程在冰浴中进行。超声处理后，4、25 000g离心离心1h。取上清进行。取上清进行蛋白质浓度测量，按实验所需的量分装后蛋白质浓度测量，按实验所需的量分装后80冰箱中保存备用。冰箱中保存备用。第20页，共78页，编辑于2022年，星期二 以上为贴壁培养细胞的样品制备方法，至于悬浮培养的细以上为贴壁培养细胞的样品制备方法，至于悬浮培养的细胞胞(包括植物细胞包括植物细胞)，常规的处理方法就是离心收集细胞；用，常规的处理方法就是离心收集细胞；用预冷预冷PBS清洗清洗3次；加裂解液进行处理；进行超声波处理；次；加裂解液进行处理；进行超声波处理；离心收集上清。注意无论是如何处理细胞，样品最终的蛋白离心收集上清。注意无论是如何处理细胞，样品最终的蛋白质浓度不要低于质浓度不要低于0.1mg/ml，最合适的浓度为，最合适的浓度为15mg/ml(一一般来说般来说1X107个动物细胞能得到个动物细胞能得到lmg蛋白质蛋白质)。因为样品浓度。因为样品浓度过小，会使相对盐浓度增大，从而影响了等电聚焦。过小，会使相对盐浓度增大，从而影响了等电聚焦。第21页，共78页，编辑于2022年，星期二第三节第三节 组织样品制备组织样品制备 一、概一、概 述述 以疾病组织为实验材料的蛋白质组学研究，因为真实地反映机体内环以疾病组织为实验材料的蛋白质组学研究，因为真实地反映机体内环境的情况，既可以为疾病的早期诊断提供新的特异性的候选标志，又能境的情况，既可以为疾病的早期诊断提供新的特异性的候选标志，又能够为疫苗的研制寻找新的特异性的候选抗原，同时可以监测、跟踪疾病够为疫苗的研制寻找新的特异性的候选抗原，同时可以监测、跟踪疾病的发展及预后情况，并为认识发病机制、明确疾病的分型、分级、分期的发展及预后情况，并为认识发病机制、明确疾病的分型、分级、分期提供线索。因此，疾病组织的蛋白质组学研究有着不可替代的临床意义提供线索。因此，疾病组织的蛋白质组学研究有着不可替代的临床意义及应用前景。及应用前景。另外，由于水稻和拟南芥这些植物基因组序列测定的完成，随之而来另外，由于水稻和拟南芥这些植物基因组序列测定的完成，随之而来的问题是如何应用高通量的技术去研究其复杂的蛋白质网络。因此植物的问题是如何应用高通量的技术去研究其复杂的蛋白质网络。因此植物蛋白质组研究也越来越受到关注，对农业生产必将会产生巨大的影响，蛋白质组研究也越来越受到关注，对农业生产必将会产生巨大的影响，如现在的育种也将从以前的通过个别基因的转移来改进个别性能，发展如现在的育种也将从以前的通过个别基因的转移来改进个别性能，发展到整体性能的改善。植物蛋白质组的研究在以农业为本的国家里，有着到整体性能的改善。植物蛋白质组的研究在以农业为本的国家里，有着更丰富的内涵。然而由于动物组织与植物组织虽然同是组织样品，但是更丰富的内涵。然而由于动物组织与植物组织虽然同是组织样品，但是各有其物化特性，所以制备方法也不尽相同。有些制备方法可以借鉴通各有其物化特性，所以制备方法也不尽相同。有些制备方法可以借鉴通用，有些则必须根据其特有的性质和要求做相应的改变。用，有些则必须根据其特有的性质和要求做相应的改变。第22页，共78页，编辑于2022年，星期二二、动物组织样品的制备二、动物组织样品的制备 对于取材于机体组织样品的制备，不均一性和易污染性一对于取材于机体组织样品的制备，不均一性和易污染性一直是技术发展的症结所在。如何从多细胞、不均一的体系中直是技术发展的症结所在。如何从多细胞、不均一的体系中获取特定类型的细胞、亚细胞结构甚至特殊的蛋白质复合获取特定类型的细胞、亚细胞结构甚至特殊的蛋白质复合体，同时又避免各种血浆蛋白质、基质组分以及坏死组织成体，同时又避免各种血浆蛋白质、基质组分以及坏死组织成分的污染，是各类组织样品制备方法必须考虑的问题。分的污染，是各类组织样品制备方法必须考虑的问题。早期组织样品采用酶解样品制备法早期组织样品采用酶解样品制备法(enzymatm sample preparation，ESP)，即酶解、抽提细胞然后以，即酶解、抽提细胞然后以Percoll梯度梯度离心等方法分离。由于酶解处理会导致蛋白质图谱的改变，离心等方法分离。由于酶解处理会导致蛋白质图谱的改变，ESP已很少使用。目前，动物组织样品常采用非酶解样品制已很少使用。目前，动物组织样品常采用非酶解样品制备法、纯化法和微切割法进行制备。备法、纯化法和微切割法进行制备。第23页，共78页，编辑于2022年，星期二(一一)非酶解样品制备法非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)2试剂试剂RPM11640缓冲液缓冲液PercollPBS溶液，溶液，DNase I溶液，溶液，RNase A溶液，溶液，上样缓冲液上样缓冲液第24页，共78页，编辑于2022年，星期二3操作步骤操作步骤(1)细胞的提取细胞的提取 手术切除的组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、手术切除的组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块无坏死区域的小块(备份的原材料可用于平行的组织病理学、备份的原材料可用于平行的组织病理学、细胞学、免疫组化等实验细胞学、免疫组化等实验)。用预冷的。用预冷的RPM11640缓冲液洗缓冲液洗涤组织小块数次，根据组织病理学特征及组织块的大小涤组织小块数次，根据组织病理学特征及组织块的大小+选选择合适的细胞提取方法。择合适的细胞提取方法。压挤压挤(squeezed)：在约：在约0.5ml预冷的预冷的RPM11640缓冲液缓冲液中，通过切、压、剁得到微小的碎片，添加缓冲液至中，通过切、压、剁得到微小的碎片，添加缓冲液至12ml。刮擦刮擦(scraped)：以锋利的解剖刀刀锋轻刮新鲜切出的组：以锋利的解剖刀刀锋轻刮新鲜切出的组织小块的截面，所得细胞置于织小块的截面，所得细胞置于12ml预冷的预冷的RPM11640缓冲缓冲液中。液中。针头吸取针头吸取(NeedleAspiration)：用：用07mmolL孔径的针孔径的针头，收集约头，收集约1 000万个细胞于万个细胞于12ml预冷的预冷的RPM11640缓冲缓冲液中。液中。第25页，共78页，编辑于2022年，星期二(2)去除组织碎片及红细胞去除组织碎片及红细胞先以两层直径先以两层直径10mm的尼龙网眼过滤器重悬细胞。尼龙网的尼龙网眼过滤器重悬细胞。尼龙网眼过滤器上层孔径为眼过滤器上层孔径为250m，下层孔径为，下层孔径为100m(可根据组可根据组织细胞的实际大小选择合适的上下滤器孔径织细胞的实际大小选择合适的上下滤器孔径)。这一步对以。这一步对以刮擦法或压挤法提取的细胞悬液尤其重要，因为其中不可避刮擦法或压挤法提取的细胞悬液尤其重要，因为其中不可避免地混有黏连组织和成纤维细胞等杂质成分。免地混有黏连组织和成纤维细胞等杂质成分。所得的细胞重悬液用所得的细胞重悬液用1.2mm的长针头的长针头(连在连在2ml注射器上注射器上)转移至新的转移至新的Effendorf管中，小心加入管中，小心加入1.01.5ml预冷的预冷的PercollPBS溶液，使得重悬细胞浸没其中。溶液，使得重悬细胞浸没其中。于于4，在低加减速率下，在低加减速率下(1 000g)离心离心10min。第26页，共78页，编辑于2022年，星期二 (3)收集并洗涤细胞收集并洗涤细胞 用连在用连在2ml注射器上注射器上0.7mm的针头挑取收集分界面处的细的针头挑取收集分界面处的细胞层，注意尽量减少胞层，注意尽量减少Percoll及及RPM11640缓冲液的污染。缓冲液的污染。根据细胞的多少用适当体积的预冷的根据细胞的多少用适当体积的预冷的PercollPBS溶液洗溶液洗涤。涤。若细胞层薄甚至几乎透明，洗涤后的细胞收集在体积小于若细胞层薄甚至几乎透明，洗涤后的细胞收集在体积小于0.4ml的的PBSPIH溶液中，在盛入溶液中，在盛入1.5ml预先称重的预先称重的Effendorf管中，加满管中，加满PBSPIH溶液后，溶液后，4、800g离心离心3min，沉淀物中的细胞颗粒重悬于，沉淀物中的细胞颗粒重悬于PBS溶液中。若细胞层溶液中。若细胞层较厚，洗涤后的细胞收集在体积小于较厚，洗涤后的细胞收集在体积小于lml的的PBSPIH溶液中，然后转移人溶液中，然后转移人1012ml的玻璃离心管中，加入的玻璃离心管中，加入56ml预冷的预冷的PBSPIH溶液后，溶液后，4 、800g离心离心3min，沉淀，沉淀物中的细胞颗粒重悬于物中的细胞颗粒重悬于12个盛有预冷的个盛有预冷的PBS溶液并预先称溶液并预先称重的重的Effendorf管中。管中。于于4、2 700g离心离心5min，小心去除所有的上清及，小心去除所有的上清及Effendorf管内外管壁黏着的液滴。称重并计算所得细胞的管内外管壁黏着的液滴。称重并计算所得细胞的净重净重(wetweight，WW)后后80冻存。冻存。第27页，共78页，编辑于2022年，星期二(4)细胞裂解及核酸降解细胞裂解及核酸降解按细胞净重按细胞净重(mg)：mQ水水(l)=1:1.89的比例，在的比例，在冻存细胞中加入相应体积的冻存细胞中加入相应体积的mQ水，冰上制成细胞水，冰上制成细胞重悬液。反复冻融重悬液。反复冻融4次以破碎细胞。次以破碎细胞。依次加入依次加入(0.089XWW)l10SDS/33.3Mercapthoethanol，(0.329XWW)l DNaseI溶溶液和液和RNaseA溶液，冰上静置溶液，冰上静置5min。冷冻干燥降解核酸后的样品。冷冻干燥降解核酸后的样品。冻干的蛋白质样品溶解在冻干的蛋白质样品溶解在(6XWW，或，或3XWV若若WW10mg)Pl适当的上样缓冲液中，混匀后静置适当的上样缓冲液中，混匀后静置3h使样品中的蛋白质充分溶解使样品中的蛋白质充分溶解(有文献报道只需有文献报道只需5min即可即可)。4 12 000rmin离心离心15rain，上清小心转，上清小心转移入新的移入新的Effendorf管中，管中，80冻存。冻存。第28页，共78页，编辑于2022年，星期二(二二)纯化法纯化法 由于方法所限，由于