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第二章之微生物菌种选育本讲稿第一页，共七十五页Contents菌种的来源菌种的来源1发酵高产菌种选育发酵高产菌种选育2菌种退化和菌种保藏菌种退化和菌种保藏3微生物菌种的扩大培养微生物菌种的扩大培养4本讲稿第二页，共七十五页第一节第一节 菌种的来源菌种的来源担子菌担子菌细菌细菌酵母酵母霉菌霉菌放线菌放线菌菌种菌种一、工业发酵一、工业发酵常见微生物常见微生物本讲稿第三页，共七十五页细菌细菌醋酸杆菌假单胞菌乳酸菌Add Your Add Your TitleTitle大肠杆菌枯草芽孢杆菌棒杆菌、短杆菌本讲稿第四页，共七十五页酵母菌酵母菌酿酒酵母异常汉逊氏酵母异常变种假丝酵母属Add Your Add Your TitleTitle毕赤氏酵母属汉逊氏酵母属本讲稿第五页，共七十五页霉菌霉菌曲霉属青霉属根霉属毛霉属本讲稿第六页，共七十五页二、工业微生物来源二、工业微生物来源source 1source 2source 3向菌种保藏机构索取从大自然中分离筛选从发酵制品中分离本讲稿第七页，共七十五页三、微生物菌种的选择性分离三、微生物菌种的选择性分离微生物样品的采集微生物样品的富集培养目的菌种的分离目的菌的筛选1234本讲稿第八页，共七十五页微生物样品的采集微生物样品的采集本讲稿第九页，共七十五页微生物样品的富集培养1控制培养基的营养成分2控制培养条件3抑制不需要的菌类本讲稿第十页，共七十五页目的菌种的分离目的菌种的分离平板稀释法平板稀释法平板划线法平板划线法本讲稿第十一页，共七十五页平板划线法b.连续划线分离法 分区划线分离法本讲稿第十二页，共七十五页1.稀释平皿分离法平板稀释法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释本讲稿第十三页，共七十五页b.倾注平皿分离法a.涂布平皿分离法（2）倒平板本讲稿第十四页，共七十五页用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株 羧甲基纤维素钠作培养物抗生素筛选检定菌培养，加上发酵液目的菌的筛选目的菌的筛选本讲稿第十五页，共七十五页影印平板法筛选目的菌本讲稿第十六页，共七十五页四、重要工业微生物菌种的分离四、重要工业微生物菌种的分离筛选菌株的一些重要指标：（1）菌的营养特征（2）菌的生长温度（3）菌对所采用的设备和生产过程的适应性（4）菌的稳定性（5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度（6）容易从培养液中回收产物。生产性能本讲稿第十七页，共七十五页抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选Text抗生素产生菌的筛选抑菌圈法稀释法生物自显影法扩散法本讲稿第十八页，共七十五页抑菌圈法抑菌圈法本讲稿第十九页，共七十五页p生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选p产生药理活性化合物菌株的筛选产生药理活性化合物菌株的筛选p多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选本讲稿第二十页，共七十五页自然选育自然选育诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种基因工程育种基因工程育种原生质体融合原生质体融合第二节第二节 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育本讲稿第二十一页，共七十五页菌种改良菌种改良物理化学生物遗传基因本讲稿第二十二页，共七十五页一、自然选育一、自然选育自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，选育出优良菌种的过程。本讲稿第二十三页，共七十五页诱变育种诱变育种诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。本讲稿第二十四页，共七十五页诱变育种的原理诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变诱变育种的理论基础是基因突变生物诱变剂生物诱变剂化学诱变剂化学诱变剂物理诱变剂物理诱变剂紫外线快中子NTGNM噬菌体转座子本讲稿第二十五页，共七十五页超净工作台小型小型X射线衍射仪射线衍射仪Co60射线机本讲稿第二十六页，共七十五页诱变育种的诱变育种的一般步骤一般步骤保保诱变筛选放大罐试验，中试考查放大罐试验，中试考查大型投产大型投产本讲稿第二十七页，共七十五页诱变育种步骤诱变育种步骤u出发菌株的选择u制备菌悬液u诱变处理u突变菌株的筛选本讲稿第二十八页，共七十五页(一一)出发菌株的选择出发菌株的选择1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。本讲稿第二十九页，共七十五页4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。本讲稿第三十页，共七十五页(二二)处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水本讲稿第三十一页，共七十五页(三三)诱变处理诱变处理 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。本讲稿第三十二页，共七十五页(四四)突变菌株的筛选突变菌株的筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。本讲稿第三十三页，共七十五页1)1)营养缺陷型的选育营养缺陷型的选育营营养养缺缺陷陷型型是是指指通通过过诱诱变变而而产产生生的的缺缺乏乏合合成成某某些些营营养养物物质质如如氨氨基基酸酸、维维生生素素和和碱碱基基等等的的能能力力，必必须须在在其其基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应的的营营养成分才能正常生长的变异株。养成分才能正常生长的变异株。与营养缺陷型对应的是与营养缺陷型对应的是野生型野生型。本讲稿第三十四页，共七十五页与筛选营养缺陷型营养缺陷型有关的三类培养基：基本培养基（MM，minimal medium）能满足某一菌种的野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。补充培养基（SM，supplemental medium）在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营营养养缺缺陷陷型型菌株生长需要（其他营营养养缺缺陷陷型型仍不能生长）的培养基。完全培养基（CM，complete medium）可满足该菌各种营养缺陷型营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。本讲稿第三十五页，共七十五页筛选营养缺陷型的步骤筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱本讲稿第三十六页，共七十五页一、诱变方法一、诱变方法物理诱变化学诱变本讲稿第三十七页，共七十五页二、淘汰野生型二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。本讲稿第三十八页，共七十五页 三、检出缺陷型原理：利用不同菌株在固体基本培养基（MM）和完全培养基（CM）上，生长情况完全不同的特点。缺陷型菌株在CM上生长良好，而在MM上则不生长，而野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法 本讲稿第三十九页，共七十五页(一)影印法 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。本讲稿第四十页，共七十五页(二)点种法也就是任意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。本讲稿第四十一页，共七十五页(三)夹层法先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。本讲稿第四十二页，共七十五页四、营养缺陷型的鉴定 验验证证确确定定是是缺缺陷陷型型后后，就就需需确确定定其其缺缺陷陷的的因因子子，即即生长谱测定生长谱测定。本讲稿第四十三页，共七十五页（1）氨基酸、维生素、核酸碱基三大类营养缺陷的鉴）氨基酸、维生素、核酸碱基三大类营养缺陷的鉴定定abcabcabca-氨基酸混合液 b-维生素混合液 c-核酸水解液本讲稿第四十四页，共七十五页（2）单一氨基酸营养缺陷的确定将将缺缺陷陷型型菌菌株株培培养养后后，收收集集菌菌体体，制制备备成成细细胞胞悬悬液液，与与MMMM培培养养基基(融融化化并并凉凉至至50)50)混混合合并并倾倾注注平平皿皿。待待凝凝固固后后，分分别别在在平平皿皿的的6 6个个区区间间放放上上不不同同的的营营养养组组合合的的混混合合物物或或吸吸饱饱此此组组合合营营养养物物的的滤滤纸纸圆圆片片。培培养养后后会会在在某某组组合合区区长长出出，就就可可测测得得所所需需营营养养。个个平平皿皿测测一一个个菌。菌。本讲稿第四十五页，共七十五页本讲稿第四十六页，共七十五页1组氨酸苏氨酸谷氨酸天冬氨酸亮氨酸甘氨酸2赖氨酸苏氨酸蛋氨酸异亮氨酸缬氨酸丙氨酸3苯丙氨酸谷氨酸蛋氨酸酪氨酸色氨酸丝氨酸4 胱氨酸天冬氨酸异亮氨酸酪氨酸精氨酸脯氨酸5亮氨酸缬氨酸色氨酸精氨酸6甘氨酸丙氨酸丝氨酸脯氨酸本讲稿第四十七页，共七十五页生长圈位置营养要求生长圈位置营养要求1组氨酸2、3蛋氨酸2赖氨酸2、4异亮氨酸3苯丙氨酸2、5缬氨酸4胱氨酸2、6丙氨酸1、2苏氨酸3、4酪氨酸1、3谷氨酸3、5色氨酸1、4天冬氨酸3、6丝氨酸1、5亮氨酸4、5精氨酸1、6甘氨酸4、6脯氨酸本讲稿第四十八页，共七十五页原理：抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株都是由于代谢失调所造原理：抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。成这一产物。方法：选育结构类似物抗性突变株方法：选育结构类似物抗性突变株 结构类似物结构类似物是指一些和微是指一些和微生物体内代谢产物结构相生物体内代谢产物结构相类似的物质，因而能够引类似的物质，因而能够引起反馈，但是它们不能参起反馈，但是它们不能参与生物合成。与生物合成。目的：主要用于末端产物的积累目的：主要用于末端产物的积累2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选本讲稿第四十九页，共七十五页在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照常能合成该种末端产物。例如，用类似物D-精氨酸选出的谷氨酸棒杆菌的抗反馈突变株可使L-精氨酸的产量得到提高。本讲稿第五十页，共七十五页3）抗性突变菌株的筛选）抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株抗生素抗性突变株 在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。变可提高抗生素产量。抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。能提高其它代谢产物的量。条件抗性突变条件抗性突变 因环境不同，能表现为因环境不同，能表现为 野生型野生型 菌株的特性和突变型菌株特菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。温度敏感突变常用于提温度敏感突变常用于提高代谢产物产量高代谢产物产量 致死致死营养缺陷营养缺陷本讲稿第五十一页，共七十五页抗性突变菌株的筛选方法抗性突变菌株的筛选方法 一次性筛选法一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株噬菌体抗性菌株 耐高温菌株耐高温菌株 本讲稿第五十二页，共七十五页 阶梯性筛选法阶梯性筛选法 梯度平板法梯度平板法 本讲稿第五十三页，共七十五页基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程本讲稿第五十四页，共七十五页三、杂交育种三、杂交育种标记标记亲和力亲和力A+B+C-D-A-B-C+D+A+B+C+D+本讲稿第五十五页，共七十五页接合接合两株两株E.coli的接合电镜照片的接合电镜照片本讲稿第五十六页，共七十五页DNA的转化的转化 本讲稿第五十七页，共七十五页转导转导 本讲稿第五十八页，共七十五页准性生殖准性生殖本讲稿第五十九页，共七十五页四、原生质体融合四、原生质体融合通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。原生质体的重组频率已大于1/10，而诱变育种一般仅为百万分之一。本讲稿第六十页，共七十五页本讲稿第六十一页，共七十五页五、基因工程育种五、基因工程育种本讲稿第六十二页，共七十五页第三节第三节 菌种的退化和菌种的保藏菌种的退化和菌种的保藏菌种退化菌种退化1微生物菌种保藏微生物菌种保藏2本讲稿第六十三页，共七十五页一、菌种退化一、菌种退化是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。本讲稿第六十四页，共七十五页（一）引起菌种退化的原因（一）引起菌种退化的原因基因突变连续传代其他因素本讲稿第六十五页，共七十五页（二）菌种的复壮（二）菌种的复壮使衰退的菌种恢复原来优良性状。使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮狭义的复壮狭义的复壮狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮广义的复壮广义的复壮广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。逐步提高。本讲稿第六十六页，共七十五页菌种的复壮措施菌种的复壮措施纯种分离：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。）。通过寄主体内生长进行复壮（通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）；淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。采用有效的菌种保藏方法。本讲稿第六十七页，共七十五页1）合理的育种；2）控制传代次数（一般在（一般在DNA的复制过程中，碱基的错的复制过程中，碱基的错 配率是配率是5x10-4，自发突变的频率为，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）种和传代的数）；3）选择合适的培养条件；4）采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）通常采用稳定的单核孢子进行接种）；5）采用有效的菌种保藏方法。（三）防止菌种衰退的方法本讲稿第六十八页，共七十五页1.目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种2.原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）。二、菌种保藏本讲稿第六十九页，共七十五页 菌菌 连续在培养基上（内）移种连续在培养基上（内）移种 种种 生活态生活态 传代培养保藏法传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种连续在活宿主上（内）移种 保保 固体斜面固体斜面 藏藏 湿法湿法 半固体琼脂柱半固体琼脂柱 方方 休眠态休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法法 干法干法 藏在玻璃管内藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上吸附在合适的载体上3.菌种保藏的方法本讲稿第七十页，共七十五页低温保藏法低温保藏法方法：菌种管置方法：菌种管置44冰箱保藏，定时传代冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。石蜡油低温保藏法：石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。干燥保藏法干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。保藏时间几至几十年。本讲稿第七十一页，共七十五页真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）。）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。本讲稿第七十二页，共七十五页v v菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。和使用的目的。v v菌种保藏机构菌种保藏机构菌种保藏机构菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（法国里昂巴斯德研究所（IPL）国内外菌种保藏机构：国内外菌种保藏机构：本讲稿第七十三页，共七十五页几种常用菌种保藏方法的比较几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类*产孢子微生物各大类36月612月12年110年515年以上简便简便简便简便有效简便有效本讲稿第七十四页，共七十五页本讲稿第七十五页，共七十五页