第六章酶与细胞固定化精选文档.ppt

第六章酶与细胞固定化本讲稿第一页，共一百一十六页 第一节第一节 酶的固定化酶的固定化 第二节第二节 微生物、植物和动物细胞固定化微生物、植物和动物细胞固定化 第三节第三节 原生质体固定化原生质体固定化 本讲稿第二页，共一百一十六页 第一节第一节 酶的固定化酶的固定化一、固定化酶的优缺点一、固定化酶的优缺点二、酶的二、酶的固定化方法固定化方法三、固定化酶性质三、固定化酶性质四、固定化酶的四、固定化酶的应用应用本讲稿第三页，共一百一十六页酶酶的的固固定定化化：借借助助各各种种物物理理或或化化学学方方法法，将将酶酶固固定于定于水不溶性载体水不溶性载体上的过程。上的过程。固固定定化化酶酶(immobilized(immobilized enzyme)enzyme)：固固定定在在载载体体上上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。并在一定空间范围内进行催化反应的酶。（固定化酶又叫（固定化酶又叫水不溶性酶水不溶性酶）本讲稿第四页，共一百一十六页什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术本讲稿第五页，共一百一十六页 固定化酶的优点固定化酶的优点可以反复使用，有利于工艺的连续化。可以反复使用，有利于工艺的连续化。反应后易于分离，简化了提纯工艺，反应后易于分离，简化了提纯工艺，产物得率高，利于提高产品质量。产物得率高，利于提高产品质量。可提高稳定性可提高稳定性反应过程可以严格控制，有利于工艺反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化。自动化。适应于多酶反应体系。适应于多酶反应体系。一一、固固定定化化酶酶的的优优缺缺点点本讲稿第六页，共一百一十六页固定化酶缺点固定化酶缺点缺缺 点点比较适应水溶性底物和小分比较适应水溶性底物和小分子底物。子底物。固定化成本高。固定化成本高。酶固定化时酶的活力有酶固定化时酶的活力有所损失。所损失。本讲稿第七页，共一百一十六页二、酶的固定化方法二、酶的固定化方法1.吸附法吸附法2.包埋法包埋法3.共价偶联法共价偶联法 4.交联法交联法固定化方法固定化方法吸附法吸附法结合法结合法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型微囊型微囊型离子键结离子键结合法合法物理物理吸附法吸附法 共价键共价键结合法结合法本讲稿第八页，共一百一十六页1 1、吸附法、吸附法 （1 1）定义：利用各种固体吸附剂将酶或含）定义：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。酶菌体吸附在其表面上。物理吸附法（物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion）作用力：氢键、疏水键作用力：氢键、疏水键常用载体：常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、大孔合成树脂纤维素、大孔合成树脂等。等。本讲稿第九页，共一百一十六页优点：优点：酶的活性中心不易被破坏，酶酶的活性中心不易被破坏，酶活力损失小。活力损失小。缺点：缺点：结合力弱，易解吸附。结合力弱，易解吸附。本讲稿第十页，共一百一十六页（3 3）制备方法：）制备方法：a.a.静态法静态法 (statia procedure)(statia procedure)：没没有有搅搅拌拌、振振摇摇情情况况下下，将将载载体体直直接接加加入入酶酶溶溶液液，通通过过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。b.b.电沉积法电沉积法 (electrodeposition procedure)(electrodeposition procedure)：在在酶酶溶溶液液中中放放置置两两个个电电极极，在在电电极极邻邻近近加加入入载载体体，接接通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。该该法法可可提提高高吸吸附附时时局局部部浓浓度度，增增加加吸吸附附量量，但但要要注注意意酶酶在在电电场中的稳定性。场中的稳定性。本讲稿第十一页，共一百一十六页c.c.混混和和振振摇摇装装载载法法 (mixing(mixing or or shaking shaking bath bath loading)loading)：是是实实验验室室常常用用方方法法，载载体体与与酶酶液液混混和和后后，要要在在搅搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。拌下或摇床连续振摇下完成固定化。该该法法固固定定化化较较为为均均匀匀，要要注注意意搅搅拌拌或或振振摇摇速速率率，既既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。d.d.反应器装载法反应器装载法(reactor loading process)(reactor loading process)：这这是是工工业业上上常常用用方方法法，它它将将固固定定化化和和其其后后的的应应用用连连在在一一起起，即即先先将将载载体体装装于于反反应应器器中中，再再加加上上酶酶液液，然然后后通通过过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。本讲稿第十二页，共一百一十六页(1)(1)定定义义：将将酶酶分分子子包包埋埋在在各各种种多多孔孔载载体体中中，制制成成一一定定形形状状的的固固定定化化酶酶的的技技术术，主主要要用用于于水水溶溶性性小小分分子底物子底物转化反应。转化反应。2 2、包埋法：、包埋法：(entrapment)(entrapment)(2)(2)包包埋埋法法的的类类型型：酶酶被被包包埋埋成成网网格格型型称称为为凝凝胶胶包包埋法；酶被包埋成微胶囊型称为埋法；酶被包埋成微胶囊型称为微胶囊微胶囊包埋法。包埋法。包埋过程包埋过程不发生反应不发生反应本讲稿第十三页，共一百一十六页 凝胶包埋法（网格型）：凝胶包埋法（网格型）：将将酶包埋在凝胶内部的微孔中。酶包埋在凝胶内部的微孔中。微胶囊包埋法（微囊型）：微胶囊包埋法（微囊型）：将酶包埋在高分子半透膜将酶包埋在高分子半透膜中。中。本讲稿第十四页，共一百一十六页a.a.凝胶包埋：凝胶包埋：凝胶凝胶包埋条件包埋条件酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应部分失活部分失活 高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点本讲稿第十五页，共一百一十六页海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法：滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法：滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法：过硫酸钾过硫酸钾Acr+Bis+E(or cell)IE(or IC)二甲氨基丙腈二甲氨基丙腈 本讲稿第十六页，共一百一十六页b.b.微微囊囊型型包包埋埋(microencapsulation)(microencapsulation)：又又称半透膜包埋法：称半透膜包埋法：将将酶酶包包埋埋于于由由各各种种高高分分子子聚聚合合物物（直直径径几几十十微微米米几几百百微微米米，厚厚约约25mm25mm的的半半透透膜膜）制制成成的的小小球球内内，制制成固定化酶。成固定化酶。常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜 制制备备方方式式：界界面面沉沉降降法法、界界面面聚聚合合法法、表表面面活活性性剂剂乳乳化液包埋法。化液包埋法。分述如下：分述如下：本讲稿第十七页，共一百一十六页界面沉降法：界面沉降法：利利用用高高聚聚物物在在水水相相和和有有机机相相的的界界面面上上溶溶解解度度降降低低而而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。例例：以以火火棉棉胶胶（硝硝酸酸纤纤维维素素）包包埋埋酶酶时时，先先将将酶酶的的水水溶溶液液在在含含有有硝硝酸酸纤纤维维素素的的乙乙醚醚溶溶液液中中乳乳化化、分分散散，然然后后再再加加入入苯苯甲甲酸酸丁丁酯酯，促促使使硝硝酸酸纤纤维维素素在在酶酶液液液液滴滴周周围围凝凝聚聚，最最后后用用Tween20Tween20破破乳乳化化后后，就就可可得得到到含含酶酶的的火火棉胶囊。棉胶囊。本讲稿第十八页，共一百一十六页 界面聚合法：界面聚合法：将将将将疏疏疏疏水水水水性性性性和和和和亲亲亲亲水水水水性性性性单单单单体体体体在在在在界界界界面面面面进进进进行行行行聚聚聚聚合合合合，形形形形成成成成半半半半透透透透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。膜，使酶包埋于半透膜微囊中。膜，使酶包埋于半透膜微囊中。膜，使酶包埋于半透膜微囊中。例例：以以以以尼尼尼尼龙龙龙龙膜膜膜膜包包包包埋埋埋埋酶酶酶酶时时时时，将将将将酶酶酶酶液液液液及及及及亲亲亲亲水水水水性性性性单单单单体体体体（如如如如己己己己二二二二胺胺胺胺）溶溶溶溶于于于于水水水水制制制制成成成成水水水水溶溶溶溶液液液液。另另另另外外外外，将将将将疏疏疏疏水水水水性性性性单单单单体体体体（癸癸癸癸二二二二酰酰酰酰氯氯氯氯等等等等）溶溶溶溶于于于于氯氯氯氯仿仿仿仿或或或或甲甲甲甲苯苯苯苯等等等等与与与与水水水水混混混混溶溶溶溶的的的的有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂。然然然然后后后后，将将将将这这这这两两两两种种种种互互互互不不不不相相相相溶溶溶溶的的的的液液液液体体体体混混混混和和和和在在在在一一一一起起起起。加加加加入入入入乳乳乳乳化化化化剂剂剂剂乳乳乳乳化化化化，使使使使酶酶酶酶液液液液分分分分散散散散成成成成小小小小液液液液滴滴滴滴。此此此此时时时时，亲亲亲亲水水水水性性性性的的的的已已已已二二二二胺胺胺胺与与与与疏疏疏疏水水水水性性性性的的的的癸癸癸癸二二二二酰酰酰酰氯氯氯氯就就就就在在在在二二二二相相相相界界界界面面面面聚聚聚聚合合合合成成成成半半半半透透透透膜膜膜膜，将将将将酶酶酶酶包包包包埋埋埋埋在在在在小小小小球球球球内内内内。再再再再加加加加TweenTweenTweenTween20202020，使使使使乳乳乳乳化化化化破破破破坏坏坏坏，用用用用离离离离心心心心分分分分离离离离即即即即可可可可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。本讲稿第十九页，共一百一十六页 表面活性剂乳化液膜法：表面活性剂乳化液膜法：在在酶酶的的水水溶溶液液中中添添加加表表面面活活性性剂剂，使使之之乳乳化化形形成成液液膜膜达达到到包包埋埋的的目目的的。该该法法不不含含化化学学反反应应，简简便便，而而且且固固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。定化是可逆的，但有渗漏的可能性。本讲稿第二十页，共一百一十六页脂质体包埋：脂质体包埋：将将酶酶包包埋埋于于脂脂质质体体(Liposome)(Liposome)中中的的方方法法。脂脂质质体体是是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。脂质体包埋的特点：脂质体包埋的特点：具具有有一一定定的的机机械械性性能能，能能定定向向将将酶酶等等被被包包裹裹物物携携带带到到体体内内特特定定部部位位，然然后后将将被被包包裹裹物物质质释释放放。因因此此，其其在在药物应用方面受到重视药物应用方面受到重视。本讲稿第二十一页，共一百一十六页与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点：与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1 1）固定化酶颗粒小。）固定化酶颗粒小。2 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：缺点：反应条件要求高反应条件要求高,制备成本也较高。制备成本也较高。本讲稿第二十二页，共一百一十六页 包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：与其它固定化方法相比：l优点：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。的高级结构，酶活回收率高。l缺点：缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。只适合作用于小分子底物和产物的酶。本讲稿第二十三页，共一百一十六页1 1）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding）作用力：离子键作用力：离子键常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡葡聚糖凝胶、聚糖凝胶、CM-CM-纤维素纤维素3.3.结合法结合法载体通过载体通过共价键共价键或或离子键离子键与酶结合的固定化方法。与酶结合的固定化方法。本讲稿第二十四页，共一百一十六页1 1）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding）作用力：离子键作用力：离子键常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡葡聚糖凝胶、聚糖凝胶、CM-CM-纤维素纤维素优缺点：优缺点：催化效率损失小；催化效率损失小；结合力弱，改变结合力弱，改变pHpH和离子强度可和离子强度可使酶脱落。使酶脱落。本讲稿第二十五页，共一百一十六页 借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非非必需侧链基团必需侧链基团和载体的功能和载体的功能基团进行偶联。基团进行偶联。2 2）共价结合法）共价结合法本讲稿第二十六页，共一百一十六页 A.A.载体：亲水载体优于疏水载体载体：亲水载体优于疏水载体 如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙亲水性好，亲水性好，有一定机械强度有一定机械强度本讲稿第二十七页，共一百一十六页2 2）偶联方法：）偶联方法：芳香氨基芳香氨基羟基羟基羟甲基羟甲基氨基氨基载载体体上上的的功功能能基基团团酶酶分分子子上上的的非非必必需需侧侧链链基基团团游离氨基游离氨基胍基胍基酚羟基酚羟基巯基巯基咪唑基咪唑基羟基羟基重氮法重氮法叠氮法叠氮法卤化氢法卤化氢法烷化法烷化法缩合法缩合法常常用用的的偶偶联联反反应应本讲稿第二十八页，共一百一十六页 重氮法：重氮法：重氮法：重氮法：这这是是带带芳芳香香氨氨基基载载载载体体体体的的的的主主主主要要要要反反反反应应应应，即即即即载载载载体体体体先先先先用用用用亚亚亚亚硝硝硝硝酸酸酸酸处处处处理理理理成成成成重重重重氮氮氮氮盐盐盐盐衍衍衍衍生生生生物物物物，然然然然后后后后再再再再在在在在温温温温和和和和的的的的条条条条件件件件下下下下和和和和酶酶酶酶分分分分子子子子上上上上相相相相应应应应的的的的基基基基团团团团如如如如酚酚酚酚羟羟羟羟基基基基、咪咪咪咪唑唑唑唑基基基基或或或或氨氨氨氨基基基基直直直直接接接接进进进进行行行行偶偶偶偶联。（见示意图）联。（见示意图）联。（见示意图）联。（见示意图）例如对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应例如对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应ROCH2C6H4NH2+HNO2 ROCH2C6H4N+N+H2O载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基酚基或咪唑基发生偶联反应值得固定发生偶联反应值得固定化酶。化酶。ROCH2C6H4N+=N+E ROCH2C6H4N NE亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成：亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成：NaNO2+HCl HNO2+NaCl本讲稿第二十九页，共一百一十六页 叠氮法：叠氮法：含含有有酰酰肼肼基基团团的的载载体体可可用用亚亚硝硝酸酸活活化化，生生成成叠叠氮氮化化合合物物。以以羧羧甲甲基基纤纤维维素素为为例例，先先将将羧羧甲甲基基纤纤维维素素甲甲酯酯化化，再再与与肼肼反反应应生生成成羧羧甲甲基基纤纤维维素素的的酰酰肼肼衍衍生生物物，然然后后再再与与亚亚硝硝酸酸反反应应得得到到叠叠氮氮化化合合物物，这这种种产产物物能能在在低低温温、pH pH 7.57.58.58.5的的情情况况下下和和酶酶的的氨氨基基直直接接偶偶联联。叠叠氮氮衍衍生生物物也也能和能和羟基羟基、酚羟基酚羟基或或巯基巯基反应。反应。ROCH2COOH+CH3OH ROCH2COOCH2+H2O CMC CMC甲酯甲酯R-O-CH2-COO-CH2+NH2-NH2 R-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OH CMC甲酯甲酯 肼肼 CMC酰肼衍生物酰肼衍生物ROCH2CONHNH2+HNO2 ROCH2CON3+2H2OROCH2CON3+H2NE ROCH2CONHEROCH2CON3+HOE ROCH2COOEROCH2CON3+SHE ROCH2COSE 本讲稿第三十页，共一百一十六页 溴化氰法溴化氰法(常用常用)：带带羟羟基基的的载载体体如如纤纤维维素素、葡葡聚聚糖糖和和琼琼脂脂糖糖等等常常用用的的反反应应。在在碱碱性性条条件件下下载载体体羟羟基基和和溴溴化化氰氰反反应应生生成成极极活活泼泼的的亚亚氨氨碳碳酸酸基基，它它在在弱弱碱碱中中可直接和酶的可直接和酶的氨基氨基进行共价偶联反应。进行共价偶联反应。本讲稿第三十一页，共一百一十六页 烷基化法：烷基化法：含含羟羟基基的的载载体体也也可可在在碱碱性性条条件件下下和和均均三三氯氯三三嗪嗪(triazinyl)(triazinyl)等等反反应应，在在引引入入活活泼泼的的卤卤素素后后能能直直接接与酶的与酶的氨基氨基、酚羟基酚羟基或或巯基巯基等偶联。等偶联。本讲稿第三十二页，共一百一十六页 缩合法：缩合法：利利用用羰羰二二亚亚胺胺的的活活化化作作用用，使使氨氨基基与与羧羧基基直直接接偶偶联联缩缩合合成成肽肽键键的的反反应应，适适用用于于带羧基或氨基的载体带羧基或氨基的载体。本讲稿第三十三页，共一百一十六页l优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。落，可连续使用。l缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶的反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。空间构象而影响酶的催化活性。本讲稿第三十四页，共一百一十六页4.4.交联法（交联法（crosslinkingcrosslinking）借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子与借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子与惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形成共惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形成共价键连接来制备固定化酶的方法。价键连接来制备固定化酶的方法。双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛本讲稿第三十五页，共一百一十六页 戊二醛有两个戊二醛有两个醛基，均可与酶或醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基蛋白质的游离氨基反应反应,使酶蛋白交使酶蛋白交联。联。此法与共价偶联法利用的均是共价键。此法与共价偶联法利用的均是共价键。本讲稿第三十六页，共一百一十六页 在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形成的在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服这一固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定化酶微囊内，然后再交联制成固定化酶“网网”膜或膜或“网网”颗颗粒。这种方法又称为粒。这种方法又称为双重固定化法。双重固定化法。本讲稿第三十七页，共一百一十六页 交联反应既能发生在分子间，也可发生在交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。分子内。l 酶酶浓浓度度低低时时，交交联联发发生生在在分分子子内内，酶酶仍仍保保持持溶解状态（修饰）。溶解状态（修饰）。l 酶酶浓浓度度高高时时，交交联联发发生生在在分分子子间间，酶酶变变为为不不溶态（固定化）。溶态（固定化）。本讲稿第三十八页，共一百一十六页缺点：缺点：(1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。不便。优点：优点：制备简单、结合牢固、可以长时间使用。制备简单、结合牢固、可以长时间使用。本讲稿第三十九页，共一百一十六页酶和细胞固定化示意图酶和细胞固定化示意图本讲稿第四十页，共一百一十六页固定化方法固定化方法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法离子结离子结合法合法共价结共价结合法合法交联法交联法制备难易制备难易易易较难较难易易难难较难较难结合程度结合程度弱弱强强中等中等强强强强活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等再生再生可能可能不能不能可能可能不能不能不能不能费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较本讲稿第四十一页，共一百一十六页固定化方法固定化方法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法离子结离子结合法合法共价结共价结合法合法交联法交联法制备难易制备难易易易较难较难易易难难较难较难结合程度结合程度弱弱强强中等中等强强强强活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等再生再生可能可能不能不能可能可能不能不能不能不能费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较本讲稿第四十二页，共一百一十六页三、固定化酶的性质三、固定化酶的性质 酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。影响酶原有的性质。影响酶原有的性质。影响酶原有的性质。本讲稿第四十三页，共一百一十六页1.1.活力：活力：大多数酶固定化后，酶活性下降。大多数酶固定化后，酶活性下降。原因：（原因：（1 1）构象改变；（）构象改变；（2 2）空间位阻）空间位阻 （3 3）活性中心与载体结合）活性中心与载体结合评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：相相对对活活力力低低于于75%75%，没有实际应用价值。没有实际应用价值。本讲稿第四十四页，共一百一十六页2.2.稳定性：稳定性：(4)对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。留较高的酶活力等。(1)对热的稳定性提高，可以耐受较对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。对酸碱耐受力增强。高的温度。对酸碱耐受力增强。(2)固定化后半衰期增长，保存稳定性固定化后半衰期增长，保存稳定性好。好。(3)对蛋白酶的抵抗性增强，不易被对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。蛋白酶水解。本讲稿第四十五页，共一百一十六页影响原因：影响原因：固固定定化化增增加加了了酶酶活活性性构构象象的的牢牢固固程程度度，并并且且固固定定化化后后酶酶分分子子与与载载体体多多点点连连接接，可可防防止止酶酶分分子子伸伸展变形。展变形。抑抑制制酶酶自自身身降降解解，酶酶与与载载体体固固定定化化后后失失去去了了分分子子间间相互作用的机会相互作用的机会，从而抑制了其自身的降解过程。，从而抑制了其自身的降解过程。固固定定化化部部分分阻阻挡挡了了外外界界不不利利因因素素对对酶酶的的侵侵袭袭，但但是是如如果果固固定定化化触触及及到到酶酶的的活活性性部部位位或或调调节节部部位位，也也可能导致酶稳定性下降。可能导致酶稳定性下降。本讲稿第四十六页，共一百一十六页3.3.最适反应最适反应pHpH：酶酶酶酶经经经经固固固固定定定定化化化化后后后后，其其其其作作作作用用用用的的的的最最最最适适适适pHpHpHpH常常常常会会会会发发发发生生生生偏偏偏偏移移移移，影影影影响固定化酶最适响固定化酶最适响固定化酶最适响固定化酶最适pHpHpHpH的因素：的因素：(1)(1)载体性质对最适载体性质对最适pHpHpHpH影响：影响：影响：影响：带带负电负电荷载体荷载体 ：最适：最适pH pH 向向碱性碱性偏移。偏移。带带正电正电荷载体荷载体 ：最适：最适pH pH 向向酸性酸性偏移。偏移。不带电不带电荷载体荷载体 :最适最适pHpH一般一般不改变不改变。(2)(2)产物性质对最适产物性质对最适pHpH影响；影响；酶催化反应产物为酶催化反应产物为酸性酸性：最适：最适pHpH向向碱性碱性偏移。偏移。酶催化反应产物为酶催化反应产物为碱性碱性：最适：最适pH pH 向向酸性酸性偏移。偏移。酶催化反应产物为酶催化反应产物为中性中性：最适：最适pHpH不改变不改变。本讲稿第四十七页，共一百一十六页影响原因：影响原因：固固相相酶酶颗颗粒粒在在水水溶溶液液中中，是是被被一一层层几几乎乎不不流流动动的的液液体体包包围围着着，这这层层不不流流动动液液体体叫叫做做扩扩散散层层。载载体体的的带带电电性性质质之之所所以以会会影影响响固固定定化化酶酶的的最最适适pHpH值值，是是由由于于在在使使用用带带负负电电荷荷的的载载体体时时，载载体体会会吸吸引引反反应应液液中中的的氢氢离离子子(H+)(H+)到到其其附附近近，致致使使固固定定化化酶酶所所处处反反应应区区域域的的pHpH值值比比周周围围反反应应液液的的pHpH值值低低一一些些，这这样样就就必必须须把把反反应应液液的的pHpH值值提提高高一一些些，才才能能使使酶酶充充分分发发挥挥其其催催化化功功能能。故故此此，固固定定化化酶酶的的最最适适pHpH显显得得比比游游离离酶酶的的最最适适pHpH值值高高一一些些。反反之之，带带正正电电荷荷的的载载体体对对氢氢氧氧根根负负离离子子有有吸吸引引作作用用，由由它它制制备备的的固固定定化化酶的最适酶的最适pHpH值要比游离酶的最适值要比游离酶的最适pHpH值低一些。值低一些。本讲稿第四十八页，共一百一十六页影响原因：影响原因：固固定定化化载载体体成成为为扩扩散散阻阻碍碍，使使反反应应产产物物向向外外扩扩散散受受到到一一定定的的限限制制所所造造成成的的。当当反反应应产产物物为为酸酸性性时时，由由于于扩扩散散受受到到限限制制而而积积累累在在固固定定化化酶酶所所处处的的催催化化区区域域内内，使使此此区区域域内内的的pHpH值值降降低低，必必需需提提高高周周围围反反应应液液的的pHpH值值，才才能能达达到到酶酶所所要要求求的的pHpH值值。为为此此，固固定定化化酶酶的的最最适适pHpH值值比比游游离离酶酶要要高高一一些些。反反之之，反反应应产产物物为为碱碱性性时时，由由于于它它的的积积累累使使固固定定化化酶酶催催化化区区域域的的pHpH值值升升高高，故故此此使使固固定定化化酶酶的最适的最适pHpH值比游离酶的最适值比游离酶的最适pHpH值要低一些。值要低一些。本讲稿第四十九页，共一百一十六页4.4.最适反应温度：最适反应温度：最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。多多数数酶酶固固定定化化后后热热稳稳定定性性上上升升，最最适适温温度也上升（有例外）。度也上升（有例外）。同同同同种种种种酶酶酶酶，采采采采用用用用不不不不同同同同的的的的方方方方法法法法或或或或不不不不同同同同载载载载体体体体固固固固定定定定化后，其最适温度可能不同。化后，其最适温度可能不同。化后，其最适温度可能不同。化后，其最适温度可能不同。本讲稿第五十页，共一百一十六页5.5.动力学常数：动力学常数：KmKm与与VmVm 固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电性能变随载体的带电性能变化。化。固定化固定化载体载体与与底物电荷相反底物电荷相反,固定化酶的表观固定化酶的表观K Km m值值降低降低。固定化载体与底物电荷固定化载体与底物电荷相同相同,固定化酶的表观固定化酶的表观K Km m值值显著显著增加增加。VmVm固定化前后相同或接近固定化前后相同或接近 （也有例外）。（也有例外）。本讲稿第五十一页，共一百一十六页6.6.底物特异性底物特异性 固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于般为：作用于小分子底物的酶类小分子底物的酶类经固定化后，经固定化后，专一性专一性基基本本不变。不变。而既而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶可作用大分子也可作用小分子底物的酶类类经固定化后经固定化后专一性会发生变化。专一性会发生变化。本讲稿第五十二页，共一百一十六页影响原因：影响原因：固固定定化化酶酶底底物物特特异异性性的的改改变变，是是由由于于载载体体的的空空间间位位阻阻作作用用引引起起的的。酶酶固固定定在在载载体体上上以以后后，使使大大分分子子底底物物难难于于接接近近酶酶分分子子而而使使催催化化速速度度大大大大降降低低，而而分分子子量量较较小小的的底底物物受受空空间间位位阻阻作作用用的的影影响响较较小小或或不不受受影影响响，故与游离酶的作用没有显著不同。故与游离酶的作用没有显著不同。本讲稿第五十三页，共一百一十六页四、固定化酶的应用四、固定化酶的应用1.1.在食品工业中的应用在食品工业中的应用 2.2.在医药领域的应用在医药领域的应用 3.3.生物传感器生物传感器 4.4.环境保护环境保护 本讲稿第五十四页，共一百一十六页（1）乳制品中）乳制品中 乳糖不耐症：有些人体内缺乏乳糖，在饮用牛奶乳糖不耐症：有些人体内缺乏乳糖，在饮用牛奶后会发生腹泻、腹胀（酸奶不会）。这是因为不能消后会发生腹泻、腹胀（酸奶不会）。这是因为不能消化牛奶中的乳糖，化牛奶中的乳糖，-半乳糖苷酶：又称乳糖酶，可用半乳糖苷酶：又称乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。采用固于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。采用固定化乳糖酶可连接生产低乳糖奶，已于定化乳糖酶可连接生产低乳糖奶，已于1977年实现工年实现工业化。业化。本讲稿第五十五页，共一百一十六页（2）在啤酒中）在啤酒中 糖化需要糖化需要-淀粉酶淀粉酶，而麦芽中的，而麦芽中的-淀粉酶不足，需淀粉酶不足，需添加外源性的淀粉酶来补充，因此可将发酵液连续通过添加外源性的淀粉酶来补充，因此可将发酵液连续通过固定化淀粉酶固定化淀粉酶反应器。例如，在制造啤酒时，可以试用反应器。例如，在制造啤酒时，可以试用固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。另外，采用另外，采用固定化蛋白质分解酶固定化蛋白质分解酶类来水解蛋白质或多类来水解蛋白质或多肽也正在研究之中。啤酒经长时间存放后，含有的多酚肽也正在研究之中。啤酒经长时间存放后，含有的多酚类和多肽结合在一起，产生所谓冷浊。现在主要是应用类和多肽结合在一起，产生所谓冷浊。现在主要是应用木瓜酶来防止这种现象的发生，但长期往啤酒中添加这木瓜酶来防止这种现象的发生，但长期往啤酒中添加这类蛋白质分解酶，会对蛋白质分解产生不良影响。为克类蛋白质分解酶，会对蛋白质分解产生不良影响。为克服这一缺点，目前，正在利用固定化木瓜酶和固定化多服这一缺点，目前，正在利用固定化木瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解决啤酒的防浊问题。酚氧化酶研究解决啤酒的防浊问题。本讲稿第五十六页，共一百一十六页（3）固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用）固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种，固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种，它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。自糖糖浆。自1972年这项技术产生以来，科学家已经固年这项技术产生以来，科学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的葡萄糖异构化酶，定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的葡萄糖异构化酶，并大量应用于工业生产中，今后几十年中它将是应用最并大量应用于工业生产中，今后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固定化酶广，市场份额最大的固定化酶。本讲稿第五十七页，共一百一十六页（4）在油脂改性中的应用）在油脂改性中的应用 脂肪酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应，所以在油脂肪酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应，所以在油脂工业中有广泛应用，脂工业中有广泛应用，1，3-特异性脂肪酶可酶促酯交换特异性脂肪酶可酶促酯交换反应，将棕榈油改性为可可酯。代可可酯是生产巧克反应，将棕榈油改性为可可酯。代可可酯是生产巧克力的原料，价格甚高，而棕榈价廉，因此这一工艺受力的原料，价格甚高，而棕榈价廉，因此这一工艺受到较大重视，已开展了较多工作。到较大重视，已开展了较多工作。本讲稿第五十八页，共一百一十六页（5）用固定化酶酶促生产阿斯巴甜）用固定化酶酶促生产阿斯巴甜 阿斯巴甜是双肽甜味剂，在工业上用化学阿斯巴甜是双肽甜味剂，在工业上用化学法合成。现在，已开始用酶法合成，用固法合成。现在，已开始用酶法合成，用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴甜定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴甜。本讲稿第五十九页，共一百一十六页（6）固定化酶在茶叶加工中的应用。）固定化酶在茶叶加工中的应用。目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，例如，目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，例如，固定化的单宁酶和果胶酶。固定化的单宁酶和果胶酶。单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中的酯单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改善茶饮料键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改善茶饮料的品质。据报道用固定化的单宁酶处理红茶，可提高茶汤的品质。据报道用固定化的单宁酶处理红茶，可提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中使用单宁酶，可中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中使用单宁酶，可以部分消除夏秋茶苦涩味道，可提高茶饮料品质。以部分消除夏秋茶苦涩味道，可提高茶饮料品质。果胶酶是作用于果胶质的果胶酶是作用于果胶质的D-D-半乳糖醛酸残基之间的糖半乳糖醛酸残基之间的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物质。茶苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物质。茶叶中的水溶性果胶与茶叶的品质密切相关。叶中的水溶性果胶与茶叶的品质密切相关。本讲稿第六十页，共一百一十六页（7）在果汁中的应用）在果汁中的应用 柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬苦素要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物（的二萜烯二内酯化合物（A环和环和B环）；另一类为果环）；另一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，而固定化酶法主要法。吸附法是一次去除苦味物质，而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。工业上采用固定化柚皮苷酶减少柑橘含苦味的物质。工业上采用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含量。类果汁中的柚皮苷含量。本讲稿第六十一页，共一百一十六页2、医药领域的应用、医药领域的应用（1）作为治疗药物）作为治疗药物 固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。药物时，较之溶