毛细管电泳基本原理和构造精选文档.ppt

毛细管电泳基本原理和构造本讲稿第一页，共十九页毛细管电泳泛指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳仪的基本结构包括一个高压电源，一根毛细管，一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。本讲稿第二页，共十九页 毛细管电泳的理论基础 v离子迁移速度 e电泳迁移率，单位电场下离子的移动速度电泳电泳 电泳分离是基于组分在电场下的迁移速度不同而进行的。离子在电场下的移动速度为：本讲稿第三页，共十九页在稳定的电泳状态下电场力和摩擦力大小相等、方向相反，即：（2.6）方程（2.6）表明半径小、电荷高的组分具有大的迁移率，而半径大、电荷低的组分具有小的迁移率。在通常的物理参数表中查到的是无限稀释完全电离条件下的电泳迁移率（绝对迁移率），实验中测得的迁移率称为有效迁移率，与缓冲溶液组成、pH值等有关。本讲稿第四页，共十九页2.2电渗及电渗控制 电渗是由于外加电场对管壁溶液双电层的作用而产生的溶液的整体流动，其大小与毛细管壁表面电荷有关。对石英毛细管，管壁表面带负电，溶液中的对离子被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中整体溶液向阴极移动。本讲稿第五页，共十九页在pH大于3时，电渗不可忽视。电渗在各种电泳模式中均存在，但在CE中由于采用了细内径的毛细管，毛细管的表面积比较大，且使用高电场，因此电渗显得特别重要。电渗的大小用电渗速度或电渗迁移率表示：在毛细管中电渗流的一个重要特性是平流型的。电渗速度的径向分布如图：本讲稿第六页，共十九页0 5 10 15 20 0.8 0.6 0.40.20X(nm)veo(X):离管壁距离为X(nm)时的电渗流 电渗的另一个特点可以使几乎所有的组分不管电荷大小，以同样的方向移动。组分在毛细管中流出时间 取决于电渗速度和组分迁移速度的矢量和。一般情况下，电渗方向从阳极到阴极,且电渗速度一般大于电泳速度，所以阴离子也在阴极流出。因此，阳离子、阴离子、中性分子能够同时分析。本讲稿第七页，共十九页图中：阳离子移动速度=电渗流速度+阳离子电泳速率 中性分子移动速度=电渗流速度 阴离子移动速度=电渗流速度阴离子电泳速率所以：移动速率 阳离子中性分子阴离子 但对于小离子（钠、钾、氯）分析，组分电泳速率一般大于电渗速率。另外，毛细管壁电荷的改性会使电渗发生变化，在这些情况下，阳离子和阴离子可能向不同的方向移动。电渗是溶液整体的流动，它不能改变分离的选择性。本讲稿第八页，共十九页电渗的控制 方法结果说明电场强度正比于电渗.电场强度降低分离效率和分辨率的降低.电场强度增加，焦耳热增加缓冲溶液pH值pH降低，电渗降低pH降低，电渗增加.改变电渗最方便有用的方法.可能会引起溶质组分电荷和结构的改变离子强度或缓冲溶液浓度离子强度增加，Zeta电位降低，电渗降低.离子强度增加，电流和焦耳热增加.低离子强度可能存在样品的吸附问题.导电性与样品不同可能引起峰形畸变.离子强度低，样品装载量小温度温度改变1，黏度变化约2%-3%.温度由仪器自动控制，常用方法有机改性剂改变Zeta电位和黏度（降低电渗）.变化复杂，其影响宜通过实验测定.可能改变选择性本讲稿第九页，共十九页表面活性剂改变蔬水性或通过离子相互作用吸附在毛细管壁上.阴离子表面活性剂使电渗流增加.阳离子表面活性剂使电渗降低或逆向会改变选择性中性亲水性聚合物通过蔬水性相互作用吸附在毛细管壁上.通过掩盖表面电荷或增加黏度，降低电渗共价涂覆化学键和到毛细管壁上.可使用多种修饰剂.涂覆物的稳定性 存在问题本讲稿第十页，共十九页CE分离原理毛细管电泳是基于溶质在电场力的作用下，在装有电泳介质的毛细管中的迁移速度不同而进行分离的。电泳迁移：在高压电场下，带电离子向相反的方向移动。电渗迁移：当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的硅羟基发生解离，生成氢离子溶解在溶液中，这样就使毛细管壁带上负电荷与溶液形成双电层，在毛细管的两端加上直流电场后，带正电的溶液就会整体的向负极端移动，这就形成了电渗流。在操作缓冲溶液中，带电粒子的运动速度等于电泳速度和电渗速度的矢量和，电渗速度一般大于电泳速度，因此即使是阴离子也会从阳极端流向阴极端。本讲稿第十一页，共十九页根据分离原理不同，可分为五种分离模式：毛细管电泳模式分离机理自由溶液毛细管电泳(FSCE)根据组分的电泳迁移率不同毛细管胶束电动色谱(MECC)根据组分在胶束相和水相的分配系数不同毛细管凝胶电泳(CGE)根据组分体积和电荷不同毛细管等电聚焦(CIEF)根据组分的等电点不同毛细管等速电泳(CITP)根据组分的迁移率不同，与FSCE不同的是，它使用两种不同电介质本讲稿第十二页，共十九页毛细管区带电泳毛细管区带电泳 将待分析溶液引入毛细管进样将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺 序通过检测器。中性组分彼此不能分离。出峰序通过检测器。中性组分彼此不能分离。出峰时间称为迁移时间，相当于高效液相色谱和气时间称为迁移时间，相当于高效液相色谱和气相色谱中的保留时间。相色谱中的保留时间。本讲稿第十三页，共十九页前三种属于区带电泳，当以缓冲溶液作为载体电解质，即为FSCE;以胶束溶液作为载体电解质，即为MECC;以凝胶作为载体电解质，即为CGE.二.迁移时间和迁移率 组分从进样点迁移到检测点所需要的时间称为迁移时间，等于移动的距离除以速度。在电渗存在时，测得为表观迁移率。V施加电压 l毛细管有效长度L毛细管总长 t迁移时间E电场强度 本讲稿第十四页，共十九页柱效和分辨率 一.扩散与理论板数 两个电泳区带的分辨率与区带宽度有关，而区带宽度在很大程度上取决于扩散过程。溶质组分的区带扩展，是由于溶质在介质中的扩散速度不同而引起的。在理想的条件下，在毛细管电泳中，溶质区带扩展的唯一因素是纵向扩展，因此，柱效只要与分子扩散有关：D溶质的分子扩散系数（2.14）本讲稿第十五页，共十九页（2.16）式（2.16）表明：（1）高电场可使柱效增加 （2）当毛细管总长与有效长度接近时，柱效与柱长几乎无关。（3）大分子由于分子扩散系数小，在同样条件下其柱效 比小分子大。实际理论板数可直接从电泳图测得：本讲稿第十六页，共十九页分辨率：分辨率：毛细管电泳的分离主要是由于高柱效而不是高选择性。毛细管电泳的分离主要是由于高柱效而不是高选择性。本讲稿第十七页，共十九页影响毛细管电泳分离的因素纵向扩散引起峰加宽进样引起焦耳热和温度梯度毛细管壁的吸附作用电风散其它本讲稿第十八页，共十九页CE仪器构造本讲稿第十九页，共十九页