理发用具微生物检测方法金黄色葡萄球菌测定.doc

理发用具微生物检测方法金黄色葡萄球菌测定 GB /T 18204.7-20001 范围本标准规定了理发用具金黄色葡萄球菌的检验方法。本标准适用于公共理发用具的金黄色葡萄球菌的检验，美容用具金黄色葡萄球菌检验可参照使用。2 定义金黄色葡萄球菌：指在Baurd Parker培养基或血平板培养基上生长良好，分解甘露醇产酸，血浆凝固酶阳性的革兰氏阳性葡萄状球菌。3 仪器3.1 显微镜。3.2 培养箱3.3 离心机3.4 灭菌吸管3.5 灭菌试管3.6 载玻片3.7 酒精灯3.8 革兰氏染色用有关器材4 培养基和试剂4.1胰酪胨大豆肉汤成分：胰酪胨(或胰蛋白胨) 17g 植物蛋白胨(或大豆蛋白胨) 3 g 氯化钠 100g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 2.5g 蒸馏水 10 00m L制法：将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2-7.3 ，分装,12120m in高压灭菌。4.2 7.5%的氯化钠肉汤成分：蛋白胨 10g 牛肉膏 3 g 氯化钠 75g 蒸馏水 1000m L制法：将 上述成分加热溶解，调pH为7.4，分装，12115m in高压灭菌。4.3 Baird Parker平板成分：胰蛋白胨 10g 牛肉膏 5 g 酵母浸膏 1 g 丙酮酸钠 10g 甘氨酸 12g 氯化锂 (LiCl6H20) 5g 琼脂 20g 蒸馏水 950m L pH 7 .0 士 0 .2增菌剂的配制：30%卵黄盐水50m L与除菌过滤的1%亚蹄酸钾溶液10m L混合，保存于冰箱内。制法：将 各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25校正pH。分每瓶95m L,121高压灭菌15 min,临用时加热熔化琼脂，每95 mL加入预热至50的卵黄亚砧酸钾增菌剂5 mL，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存，不得超过48 h；4.4 血琼脂培养基成分：营养琼脂100m L 脱纤维羊血(或兔血） 10m L制法：将 营养琼脂加热溶化，待冷至50左右以无菌方法加人脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用4.5 甘露醇发酵培养基成分： 蛋白胨10g 氯化钠 5 g 甘露醇 10g 牛肉膏 5 g 0.2% 磨香草酚蓝溶液 12m l. 蒸馏水 1000m L制法：将 蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调pH7.4 ，加人甘露醇和指示剂，混匀后分装试管中，11520 min高压灭菌备用。4.6 兔(人)血浆制备取3. 8 % 柠檬酸钠溶液，1213 0 min高压灭菌,1份加兔(人)全血4份，混匀静置，2 000-3 000 r/min离心3-5 min，血球下沉，取上面血浆。4.7革兰氏染色液见GB/T 18204. 3-2000中第4章第4节。5 操作步骤5.1 采样方法同GB/T 18204. 6-2000.将大肠菌群检测后剩余的5 mL待检样品，放入45 mL7.5%的氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基中，36士1培养24 h。5.2 从培养液中取1-2接种环，划线接种在Baird Pairker氏培养基(或用血平皿)，于36士1培养24 h。在Baird Parker氏培养基上菌落为圆形，光滑，凸起湿润，颜色呈黑灰色，边缘整齐、周围混浊，外层有一透明带，在血平板上菌落呈圆形、金黄色、凸起、表面光滑、周围有溶血圈。5.3 挑取典型菌落作涂片染色镜检，为革兰氏阳性，成葡萄状排列。5.4 甘露醇发酵试验:取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，置36士1培养24 h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。5.5 血浆凝固酶试验5.5.1 玻片法:取清洁干燥玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取待检菌落，分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌苔混悬液在5 min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象者为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应或盐水滴与血浆均有凝固现象，再进行试管凝固试验。5.5.2 试管法:吸取1:4新鲜血浆0.5 mL放人灭菌小试管中，再加人待检菌24 h肉汤培养物0.5 mL。混匀，放36士1 温箱或水浴中，每30m in观察一次，24h 之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5 mL，分别加人灭菌小试管内与0.5 mLl：4血浆混匀，做为对照。6 结果报告 凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性，可报告检出金黄色葡萄球菌。