课题2,月季花药培养.docx

课题2,月季花药培养题 课题 2 月季的花药培育课题背景 1964 年，印度科学家在培育毛叶曼陀罗的花药时，首次获得了由花药中的花粉粒发育而来的单倍体植株。这个试验说明生殖细胞和体细胞一样，在离体条件下也具有发育成完整植株的潜能。自 20 世纪 60年头以来，花药培育的探讨发展快速。据记载，世界上已有 250 多种高等植物的花药培育获得胜利，其中小麦、玉米、大豆、甘蔗和橡胶等近 50 种植物的花粉再生植株已由我国科技人员首先培育胜利。植物的花药培育在育种上有特别的意义。育种工作者可以采纳花药培育的方法，使花粉粒发育为单倍体植株，再经过人工诱导使染色体数目加倍，重新复原到正常植株的染色体数目。这样的植株不仅能够正常生殖，而且每对染色体上的成对的基因都是纯合的，自交产生的后代不会产生性状分别。单倍体育种不仅缩短了育种周期，也为新品种的培育开拓了新途径。在本课题中，我们将尝试月季的花药培育。基础学问 （一）被子植物的花粉发育 被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有很多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经验小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段（图 3-6）。在小孢子四分体时期，4 个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的 4 个单倍体细胞彼此分别，形成 4 个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含深厚的原生质，核位于细胞的中心（单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中心移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成 1 个生殖细胞核和 1 个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是养分细胞。生殖细胞将再分裂一次，形成两个精子。（二）产生花粉植株的两种途径通过花药培育产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径（图 3-7），一种是花粉通过胚状体阶段发育为植株，另一种是花粉在诱导培育基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有肯定的界限，主要取决于培育基中激素的种类及其浓度配比。人们始终以为，植物细胞的离体培育只能通过分别诱导芽和根等器官再发育成植株。20 世纪 50 年头末，科学家在胡萝卜根组织的单细胞悬浮培育液中发觉，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚特别相像的结构，它的发育过程也与合子胚类似，胚芽、胚根、胚轴等结构完整，就像一颗种子。科学家将这种结构称做体细胞胚（somaticembryo）或胚状体（embryoid）。除了植物的体细胞外，由单倍体性细胞产生的花粉胚，也可发育成为单倍体植株。（三）影响花药培育 的因素 诱导花粉植株能否胜利及诱导胜利率的凹凸，受多种因素影响，其中材料的选择与培育基的组成是主要的影响因素。不同植物的诱导胜利率很不相同。就同一种植物来说，亲本植株的生理状况对诱导胜利率也有干脆影响。花期早期时的花药比后期的更简单产生花粉植株。一般月季的花药培育时间选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。选择合适的花粉发育时期也是提高诱导胜利率的重要因素。这是因为并不是任何时期的花粉都可以经过培育产生愈伤组织或胚状体，在花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。一般来说，在单核期，细胞核由中心移向细胞一侧的时期，花药培育胜利率最高。选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破裂；选择单核期以后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难。为了选择到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾（图 3-8）。盛开的或略微开放的花（图 3-9），都不宜选作试验材料。此外，亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导胜利率都有肯定影响。v 花期一般指在一个生长季内植株开花的时间段。比如某些种类的月季，从 5 月初始终到 11 月都连续开花。那么 5 月初就叫做该种月季的初花期或花期早期。花期早期的花蕾养分状态及生理状态会比较好，能提高花粉诱导胜利率。为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？ 试验操作 （一）材料的选取 选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于相宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采纳焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。醋酸洋红法将花药放在载玻片上，加一滴质量分数为 1%的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片后在显微镜下检查。醋酸洋红的配制方法是：将体积分数为 45%的醋酸 100mL 煮沸，缓缓加入 1g 洋红，再加热回流（回流装置参见专题 6 课题 2）8h，冷却至 50，过滤即可。焙花青- 铬矾法花药应先在卡诺氏固定液中固定 20min，然后取出放在载玻片上，加焙花青-铬矾溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜下检查。卡诺氏固定液的配制方法是：将无水酒精与冰醋酸按体积比为3:1 的比例混匀。焙花青-铬矾溶液的配制方法是：将 5g 铬钾矾K 2 SO 4 Cr 2 （SO 4 ）3 24H 2 O加入 90mL 蒸馏水中，溶解后加入 0.1g 焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸 5min 后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至100mL。（二）材料的消毒 通常先将花蕾用体积分数为 70%的酒精浸泡大约 30s，马上取出，在无菌水中清洗。取出后再用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分，放入质量分数为 0.1%的氯化汞溶液中 24min（也可用质量分数为 1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液），取出后再用无菌水冲洗 35 次。（三）接种和培育 消毒后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并马上将花药接种到培育基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后简单从受伤部位产生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。通常每瓶接种花药 710 个，培育温度限制在 25左右，不须要光照。幼小植株形成后才须要光照。一般经过 2030d 培育后，会发觉花药开裂，长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织刚好转移到分化培育基上，以便进一步分化出再生植株。假如花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必需在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培育基上，否则这些植株将很难分开。在花药培育中，特殊是通过愈伤组织形成的花粉植株，染色体组的数目经常会发生改变。因此还须要对培育出来的植株作进一步的鉴定和筛选。v 月季花药培育基配方 在 1000mLMS 培育基配方中添加 2，4-D0.4mg KT0.2mg IAA 4mg 调整 pH 至 5.8。v 诱导丛芽或胚状体的培育基配方 MS 培育基中添加 GA、IBA 和 BA，质量浓度分别为 0.1mg/L、0.5mg/L 和 1mg/L。v 诱导生根的培育基配方 MS 培育基各成分用量减半，添加 IAA，质量浓度为 1.5mg/L。结果分析与评价 1.你能够通过镜检找到处于相宜的发育期的花粉吗？ 2.你的花药培育出现了被污染的现象吗？假如有，请分析产生污染的缘由。3.你接种的花药是否长出了花粉愈伤组织或胚状体？练习 1.紫色、不甜的玉米（基因型为 AASuSu）和白色、甜玉米（基因型为 aasusu）杂交（Su 和 su 代表一对等位基因），得到的 F 1 （AaSusu）再进行自交，F 2 会有紫色甜玉米的表现型产生。假如运用常规育种方法，应当如何筛选出纯合的紫色甜玉米？假如利用花药培育的技术，又应当怎样做呢？ 2.学完这个专题后，你能说出植物组织培育技术与花药培育技术的异同吗？你能举例说明组织培育技术在生产中的实际应用吗？