小鼠胚胎成纤维细胞_异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞TGF-β受体影响的实验研究.docx
小鼠胚胎成纤维细胞_异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞TGF-受体影响的实验研究 摘 要：目的:探讨经不同浓度异补骨脂素干预对小鼠胚胎前成骨细胞（MC3T3-E1）增殖、型骨胶原的表达、TGF-、型受体的影响以及与原发性骨质疏松症的关系。方法：细胞分为正常比照组与不同浓度异补骨脂素组。各组细胞采纳MTT方法检测MC3T3-E1细胞增殖状况,天狼星红染色法测定型骨胶原的表达，荧光素酶报告基因检测TGF-1通路活性以及Western-Blot法检测TGF-、型受体的表达。结果：经不同浓度异补骨脂素刺激，可明显促进MC3T3-E1细胞增殖（P 试验细胞： MC3T3-E1、293T细胞购自协和医科高校细胞中心。 1.2 主要试剂与药品 异补骨脂素 中国生物药品检定所。DMEM培育基购自中国医学科学院细胞中心，胎牛血清购自Hyclone公司，硫酸链霉素、青霉素（Hyclone 公司）。MTT购自Sigma公司，DMSO，0.25%胰蛋白酶溶液，天狼星红染液购自Electronic Microscopy Sciences,一抗TGF-I、TGF-II（sc-398，sc-400）及二抗购自Santa公司，转染试剂LipofectAMINETM 2000；双荧光素酶报告基因（购自Invitrogen公司）。 2 试验方法 2.1 MTT法检测正常比照组及不同浓度异补骨脂素组MC3T3-E1细胞增殖状况 采纳MTT法，以1×104/孔将细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，应用无血清培育液培育24h，分别加入经含无水乙醇培育液配制的不同浓度异补骨脂素溶液（102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6M）每组设6个复孔，并设相应正常比照组进行比较，并在培育72时，每组加入MTT至终度为0.5mg/ml；接着培育4h，去除培育液，加入200lDMSO溶解镇静的色素染料10分钟，上酶标仪检测490nm光汲取值。 2.2 天狼星红染色测定细胞层的胶原含量 去除96孔板中的培育液，20甲醇固定细胞过夜，PBS洗1遍；0.1%天狼星红室温染色1h，去除染液，用0.1%冰醋酸洗3遍，每次5min；每孔加入0.1mol/L氢氧化钠200L，室温作用1h，振荡混匀，于540nm测光汲取值检测胶原4。 2.3 细胞分组 传代细胞分传为5盘细胞（60mm dish细胞培育皿），细胞融合达60%时，吸出每瓶废液；4mL无血清 DMEM，接着置孵箱孵育，同步24h，使细胞静止于Go；每盘为一组，分为五组：正常组、不同浓度异补骨脂素组。正常组，正常培育；不同浓度异补骨脂素组，含有不同浓度异补骨脂素的培育基培育。各组细胞置37、5%CO2孵育箱培育，72h后提取总蛋白。 2.4 荧光素酶报告基因 荧光素酶报告基因（12×CAGA）5；根据LipofectAMINETM 2000 供应的方法分别转染293T细胞。转染24 h后，同时分别赐予不同浓度的异补骨脂素刺激12h后收获细胞，在荧光酶报告分析仪（Top Count）专用的检测板（一种96 孔板）每个孔中依次加入荧光酶催化底物I，以及上述细胞裂解物，并混匀。利用相应软件程序进行荧光酶活性测定，统计分析，绘图。 2.5 Western bloting检测 2.5.1 细胞浆蛋白提取 小鼠胚胎前成骨细胞（MC3T3-E1）在10%小牛血清DMEM培育传代。于试验前采纳无血清DMEM同步24 h,然后以终浓度分别为0、10-1、10-2、10-3、10-4M含药培育基孵育72h,正常比照组不加异补骨脂素。于试验终点分别提取胞浆蛋白,每瓶加入200L胞浆裂解液冰上裂解30min,用细胞刮刮下细胞移入一预冷EP管中,4下离心20000 r/min×5min马上将上清液移入一预冷EP管中与等体积上样缓冲液混匀后100煮沸10min，-20备用。 2.5.2 步骤 取等体积上述变性蛋白液，于SDS-PAGE凝胶上进行电泳分别,其中分别胶与浓缩胶浓度分别为10%、4%。然后将胶进行电转膜,取出膜后4封闭过夜加入抗人TGF-1I,型一抗（sc-398，sc-400）,4过夜。TBST洗10min×3加二抗37孵育1h。再次洗膜后ECL（Thermo）显色, x光胶片曝光后，图片结果进行统计分析。 2.6 统计学方法 利用ImageJ分析软件对结果进行图像分析。各组图像分析结果采纳（±s）表示,全部试验数据均采纳统计软件SPSS 11.0进行单因素方差分析,P 异补骨脂素是中药补骨脂中提取的香豆素类化合物,具有雌激素样活性,但无雌激素样不良反应10。近年来关于植物雌激素类药物对成骨细胞及细胞外基质和TGF-信号通路方面的探讨鲜见报道，这方面的探讨可为合理采纳中医药防治骨质疏松供应理论基础。原发性骨质疏松症涉及细胞信号通路以及成骨细胞和细胞外基质（ECM）成分的改变。骨组织中TGF-可由成骨细胞分泌，TGF-参加组织修复与其他病理生理过程，是一种组织内存在广泛的信号传导路径。其中TGF-1为具有多种生物学功能的活性肽，在骨质疏松症发病过程中的作用越来越受到关注。 我们的试验发觉，异补骨脂素可明显促进体外培育小鼠胚胎前成骨细胞增殖、型骨胶原的分泌以及刺激TGF-1活性并有TGF-、型受体蛋白表达增加，推想植物雌激素异补骨脂素可通过TGF-信号通路来促进成骨细胞增殖及胶原基质的合成，从而发挥抗骨质疏松作用。但是对其作用机制仍须要进行深化探讨，从而为临床更好地采纳中医药防治绝经后骨质疏松症供应理论支持。 参考文献 1 中国健康促进基金会.骨质疏松症中国白皮书S.骨质疏松症白皮书（中国部分）,2008:8. 2 郭世绂,罗先正,邱贵兴.骨质疏松基础与临床M.天津:天津科学技术出版社,2001:473. 3 P G Robey, M F Young, K C Flanders, et al. Osteoblasts synthesize and respond to transforming growth factor-type beta（TGF-beta）in vitroJ.JCB,1987,105（1）:457-463. 4 Marotta M and Martino G. Sensitive spectrophotometric method for the quantitative estimation of collagenJ. Anal Biochem, 1985, 150 （1）: 86-90. 5 Dennler S, Itoh S, Vivien D. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 geneJ. EMBO,1998,17:3091-3100. 6 Richard B and Mazess. Fracture risk: A role for compact bone. Calcified Tissue International,1990,47:191-193. 7 Yamada Y, Miyauchi A, Goto J, et al. Association of a polymorphism of the transforming growth factor-1 gene with genetic susceptibility to osteoporosis in postmenopausal Japanese womenJ.J Bone Miner Res,1998,13（10）:1569-1576. 8 Thirunavukkarasu K, Miles RR, Halladay DL, et al. Stimulation of osteoprotegerin （OPG） gene expression by transforming growth factor-beta （TGF-beta）. Mapping of the OPG promoter region that mediates TGF-beta effectsJ.J Biol Chem,2001,276 （39）:36241-50. 9 G.E Krassas and Ph.Papadopoulou. Oestrogen action on bone cellsJ.J Musculoskel Neuron Interact,2001,2（2）:143-151. 10 张军芳,郭敏,王建华.异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响J.自然产物探讨与开发,2009,21（3）:409-412.
