甘精-地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响 地特胰岛素和甘精胰岛素的区别.docx

甘精地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响 地特胰岛素和甘精胰岛素的区别 摘要:目的视察甘精、地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法用甘精、地特和人胰岛素干预3T3-L1前脂肪细胞,并用MTT和油红O染色法测定其增殖和分化水平。结果甘精胰岛素(1.013±0.007)可促进前脂肪细胞增殖,地特胰岛素(0.990±0.009)可抑制前脂肪细胞增殖；胰岛素为前脂肪细胞分化的必需成分,促分化作用人胰岛素(0.638±0.006)最强,甘精胰岛素(纯品0.623±0.007，液体0.445±0.006)次之,地特胰岛素(0.412±0.006)最弱。结论不同胰岛素对前脂肪细胞增殖分化的影响不同。 关键词：胰岛素 前脂肪细胞 增殖 分化 中图分类号：R255.4R587.1文献标识码：B文章编号：1672-1349(2011)05-0545-02 糖尿病的发病率呈现快速增长,胰岛素是糖尿病治疗中不行替代的药物。胰岛素的发展经验了动物胰岛素、基因工程人胰岛素和胰岛素类似物三个阶段。甘精胰岛素和地特胰岛素作为胰岛素类似物出现,已广泛应用于临床1。脂肪组织是胰岛素的重要靶器官之一,前脂肪细胞具增殖实力,且能分化为脂肪细胞,作用持续于人的一生,其增殖和分化实力影响脂肪组织的构建。本文拟比较甘精、地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响,从而指导临床选择不同的胰岛素对糖尿病患者进行个体化治疗。 1资料与方法 1.1主要试验用品及化学试剂DMEM-F12培育基、胰蛋白酶购自Gibco-BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；青霉素、链霉素购自华北制药厂；噻唑兰、二甲基亚砜、人胰岛素、甲状腺素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤均购自Sigma公司；油红O染料购自Amersco公司；地特胰岛素由诺和诺德公司供应；甘精胰岛素液体和纯品由甘李药业有限公司供应。 1.2试验方法 1.2.13T3-L1前脂肪细胞的复苏打算37 的温水,从液氮罐中取出冻存管,快速投入温水中。在水中来回晃冻存管1 min左右,视察到冻存液基本溶化。将冻存管中液体吸入离心管中,1 000/min离心5 min,吸弃上清,加入新的培育基,吹打匀称,使得细胞分散,以104/mL密度接种,放入CO2培育箱中培育。 1.2.2MTT法视察前脂肪细胞增殖前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,37、5%CO2培育24 h后,设比照组(含10%胎牛血清的D-MEM/F-12配制的完全培育液)和四组干预组(含10 nmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘精液体胰岛素、地特液体胰岛素的完全培育液)孵育细胞,隔日一次倒置显微镜下视察细胞并作MTT比色法测增殖。 1.2.3前脂肪细胞分化过程视察前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,D-MEM/F-12(11)基础培育基中添加0.25 mol/L胰岛素、0.25 mol/L地塞米松、0.2 nmol/L甲状腺素以及0.5 mmol/L IBMX作分化培育基诱导分化,设比照组(不含胰岛素)和四组干预组(含0.25 mol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘精液体胰岛素、地特液体胰岛素的分化培育液),3 d后改用不含IBMX的分化培育基诱导直至14 d,隔日一次显微镜视察。用油红O染色和异丙醇抽提的方法进行细胞内脂质含量定量(以OD值表示)。 1.3统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 13.0统计学软件处理。多组间应用单因素方差分析,两两之间比较采纳LSD-t检验。 2结果 2.1不同胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响3T3-L1前脂肪细胞在接种16 h左右基本完全贴壁,显微镜下视察形态类似于成纤维细胞,呈棱形、梭形或多角形,细胞核圆形,位于细胞质中心,运用油红O染色完全不能着色。接种后的第4天进入对数增长期,第10天进入增殖平台期。8 d时地特液体胰岛素抑制细胞的增殖(P0.05)。6 d起先,甘精液体胰岛素与地特液体胰岛素对前脂肪细胞分化影响的差别有统计学意义(P2。地特胰岛素是一种中性的、可溶的、长效胰岛素类似物,它是通过去掉胰岛素肽链上B30位的苏氨酸并通过酰化作用在B29位的赖氨酸上结合了一个14碳的脂肪酸(肉豆蔻酸)而形成3。 在增殖试验中,到第8天时地特液体胰岛素起先抑制细胞的增殖直到第12天,第10天时甘精胰岛素促进细胞的增殖。Slieker 等4试验表明胰岛素B26-B30 分子结构的变更会影响与IGF-IR 的亲和力,最终影响胰岛素促进有丝分裂的实力。甘精胰岛素因为B链分子结构的变更使其促有丝分裂的实力强于其他胰岛素。Ashish等6在视察不同胰岛素对MCF7(乳腺癌细胞)增殖的影响时得出结论,在甘精胰岛素浓度为1.5 nmol/L1.5 mmol/L时能明显促进细胞增殖,而地特胰岛素浓度在15 nmol/L1.5 mmol/L时促增殖作用弱于人胰岛素。Mayer等7试验表明含甘精胰岛素的血清对MCF7促增殖作用是含人胰岛素血清的1.11倍,而含地特胰岛素的血清为含人胰岛素血清的0.99倍,这与本文得出的结论相像。 在视察不同胰岛素对前脂肪细胞分化影响的试验中,可以看到胰岛素为前脂肪细胞分化的必需试剂,在不含胰岛素的培育基中前脂肪细胞基本不分化。此外,人胰岛素促进前脂肪细胞分化的实力最强,甘精胰岛素次之,地特胰岛素最弱。胰岛素促进脂肪细胞分化是通过包含一系列胰岛素受体底物(IRSs)的信号网络实现的。最早发觉体外培育前脂肪细胞的分化须要胰岛素,胰岛素可以提高前脂肪细胞的分化率,胰岛素在前脂肪细胞转化中起相当重要的作用8。Kristensen等9试验表明胰岛素分子结构的变更会影响与胰岛素受体的结合力,从而影响代谢实力。Peter等5也得出结论，人胰岛素与受体结合的实力最强,甘精稍弱,地特的结合实力最差,这可能与其促分化实力不同有关。Staiger 等10做出的试验表明小剂量的人胰岛素即可促进前脂肪细胞分化,这与本文结论相像。Anja 等11得出结论地特胰岛素小剂量和大剂量对前脂肪细胞分化的影响都低于小剂量的人胰岛素,这与本文结论一样；同时,地特胰岛素对前脂肪细胞分化的影响并非由于B29位结合的肉豆蔻酸变更信号转导通路造成的,机制尚不明确。 参考文献: 1Jeffrey SF,DO.Insulin Analog Therapy:Improving the match with physiologic Insulin secretion.J Am Osteopath Assoc,2009,109:26-36. 2Andreas T,Mario T,Philippe D,et al.Mass spectrometric identification of degradation products of insulin and its long-acting analogues in human urine for doping control purposes.Anal Chem,2007,79,2518 -2524. 3YaredND,NaveedY,Handrean S.Therole ofinsulindetemir in overweight type 2 diabetes management.Vascular Health and Risk Management,2009,5：553-560. 4Slieker LJ,Brooke GS,Dimarchi RD,et al.Modifications in the B10 and B26-30 regions of the B chain of human insulin alter affinity for the human IGF-I receptor more than for the insulin receptor.Diabetologia,1997,40:S54-S61. 5Ashish S,Jean G,Volker E,et al.Analysis of signaling pathways related to cell proliferation stimulated by insulin analogs in human mammary epithelial cell lines.Endocrine Related Cancer,2009,16:429-441. 6Mayer D,Chantelau E.Treatment with insulin glargine(Lantus) increases the proliferative potency of the serum of patients with type-1 diabetes:A pilot study on MCF-7 breast cancer cells.Arch Physiol Bioche,2010,116(2):73-78. 7Kristensen C,Kjeldsen T,Wiberg FC,et al.Alanine scanning mutagenesis of insulin.J Biol Chem,1997,1272(20):12978-12983. 8The role of PDGF-dependent suppression of apoptosis in differentiating 3T3-L1 preadipocytes.Eur J Cell Biol，1998,77(3):220-227. 作者简介：卢婷(1986),女,为山西医科高校第一医院内分泌科在读硕士探讨生(邮编：030001)；杨静(通讯作者),工作于山西医科高校第一医院(邮编：030001)。 (收稿日期：2010-11-18) (本文编辑王雅洁)