省卫生厅基金项目.docx

省卫生厅基金项目 项目类别 申报学科代码 1 卫生厅编号 自由申请项目省卫生厅科研项目申请书 项目名称：TIMPs 质粒 DNA 肌肉内注射治疗慢性排斥反应的试验探讨 申 请 者： 所在单位： 邮政编码：通讯地址： 电话：传真：申请日期：年 月 日 省 卫 生 厅 二 00 二年制 填 报 说 明一、填写申请书前，请先查阅有关项目申请方法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条仔细填写。表达要明确、严谨，字迹要清楚易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。 二、申请书为十六开本，复印时用 B5 复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式七份（至少一份为原件），由所在单位审查签署看法后，按申报程序报科教处。 三、封面右上角编号由填写，项目类别和申报学科代码 1 由申请者填写。 四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参与探讨： 在读（含在职）探讨生 已离退休的科研人员 申请单位的兼职科研人员 五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参与）的项目数，连同在研的项目数不得超过两项。 六、同一项目组探讨内容相近的项目，只允许报送一个学科。 研 究 内 容 和 意 义 摘要 慢 性 排 斥 反 应 是 移 植 物 远 期 丢 失 的 主 要 原 因 ， 多 种 因 素 参 与 其 发 生 ， 最 终 的 病 理 改 变 为 中 小 动 脉 平 滑 肌 细 胞 突 破 基 底 膜 向 内 膜 迁 徙 ， 导 致 移 植 物 动 脉 硬 化 ， 器 官 功 能 衰 竭 。本 研 究 旨 在 上 调 TIMP-1 及 TIMP-2 的 表 达 抑 制 血 管 内 膜 基 质 的 降 解 ， 阻 碍 平 滑 肌 细 胞 向 内 膜 的 迁 徙 ， 为 治 疗 CR 探 索 新 途 径 ， 并 寻 找 治 疗 的 最 佳 切 如 时 间 。主题词 1. 主题词数量不多于三个；2. 主题词之间空一格（英文用/分隔）。中文 慢 性 排 斥质 粒 DNA 金 属 蛋 白 酶 组 织 抑 制 因 子 英文 Chronic rejection / Plasmid DNA/ TIMPs 简表填写要求 一、简表内容将输入计算机，必需逐项仔细填写，采纳国家公布的标准简化汉字。二、凡选择性栏目，将相应提示符 A、B 等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应准确反映探讨内容和范围，最多不超过 25 个汉字 (包括标点符号）。申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，留意小数点。起止年月起始时间从申请的次年 1 月算起。终止时间为完成年度的 12 月。所用试验室系指探讨项目将利用的试验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。参与单位数指探讨项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路途的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。探讨内容和意义摘要与主题词均录入软盘。 2 二、立论依据（包括项目的探讨意义、国内外探讨现状分析，并附主要参考文献及出处） 器官移植已成为二十一世纪医学领域的重要内容，其移植术后的急、慢性排斥反应是目前移植领域特别关注的课题。慢性排斥反应（ChronicRejectionCR）是移植物远期丢失的主要缘由，其发生是由诸如主要组织相容性抗原（MHCA）不匹配、冷热缺血时间、感染、急性排斥等多种因素造成的。CR 最基本的病理特点为移植物的小动脉的硬化，即移植物血管病变（GraftVasculopathy）。来源于小动脉中膜的平滑肌细胞突破内膜基底层向内膜迁徙、过度生长、 坏死、纤维化而使血管渐渐闭塞、消逝 ，最终使移植物丢失。Ross 等 及 Isik 等 的 探讨认为，血管内皮细胞由于多种因素的损伤而启动血管硬化的形成，即早期的单核巨噬细胞的增生，后期平滑肌细胞在生长因子如 PDGF 的刺激下，由血管中膜突破基质向内膜迁徙，而平滑肌细胞的迁徙，过度增生，最终导致了移植血管不行逆转的硬化进程。由此我们推想抑制血管内膜基底层基质的降解，阻碍平滑肌细胞的迁徙，从而阻挡 CR 的生长、减缓其发展，是一种值得探究的新的尝试。基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinass ，MMPs）及其抑制物-金属蛋白酶组织抑制因子（TissueinhibitorofmetalloporteinassTIMPs）参加细胞外基质（ExtracellularmatrixECM）的更新和组织改型 (3) ，中小动脉中膜的平滑肌细胞突破内膜基底层向内膜迁徙浸润是慢性排斥反应发生的必备条件，据Hayry等探讨平滑肌细胞向内膜浸润时，MMPs对血管基底膜的降解起着相当重要的作用，有关探讨(4) 及我们的初步试验表明 MMP-2、MMP-9 及 TIMP-1、TIMP-2 不仅存在于正常移植共体中。更存在于急、慢性排斥反应的组织标本中。ECM 的降解过程包括 MMPs/TIMP 之间的平衡，血管内膜基低层的主要成分为四型胶原，为基质金属蛋白酶（MMP2，9）作用的主要底物，而 MMP2，9 与 TIMP1，2 以 1 ：1 非共价结合的形式使基质金属蛋白酶失活。MMP-2（分子量为 72000）和 MMP-9（分子量为 92000）及其移植物 TIMP 可来源于不同的细胞(5) 。有理由推想，上调 TIMP 的表达，可抑制激活状态的 MMPs，从而抑制基质的降解，阻碍平衡觉细胞（Smooth Muscular Cell，SMC）由中膜突破内膜基底层向内膜突破基底层向内膜迁徙、生长。Hayry 等(6) 指出，以单一基因抑制基质金属蛋白酶的方式最大效率仅达 30-50%。本探讨拟上调 TIMP-1 及 TIMP-2 的表达，提高其抑制平滑肌细胞内膜迁徙的效率。CR 病理变更的发生是一个相对缓慢的过程，出现明显的慢排临床表现的移植物已属难以逆转的病理阶段。预防及治疗 CR 的时间切如点目前尚无定论，我们推想，在急性排斥发生后即启动了慢性排斥的病理进程，此阶段内，相对较高的 MMPs 占主导地位而便于SMC 向内膜的迁徙，而此时上调 TIMP 表达，干预 MMPs/TIMP 间的平衡，抑制 MMPs 对基质的降解，阻碍 SMC 的迁徙，而达到削减 CR 的发生的目的。本探讨旨在证明上述推想并探究防治 CR 的最佳时机及有效途径。目前导入基因的方式有多种。应用逆转录病毒载体有缺陷病毒与野生型联合产生致病因子的危急。另有探讨表明，重复治疗后，受体可产生阻断抗体。Horton 等在利用含干扰素目的基因的 pcDNA 3.1 载体肌肉内注射治疗原发和转移的黑色素瘤、胶质瘤的试验探讨中，证明其目的基因编码的目标蛋白干扰素可在受体全身表达其生物活性，并达到治疗作用。因而本探讨拟以质粒 DNA 肌肉注射的方式导入目的基因，此方法便利，平安，可行。国内已胜利地建立了大鼠腹主动脉 CR 加快模型，已克隆大鼠 TIMP-1 及 TIMP-2 的cDNA，为完成这一探讨供应了基础条件。 本院在四周血管的基础探讨方面进行了大量的探讨，信任从血管移植模型上进行探究，将会为器官移植的顺当开展供应理论基础。参考文献 1. Demetris AJ, Zerbe T, Banner B. Morphology of solid organ allograft arteriopathy: identification of proliferating intimal cell populations. Transplant Proc, 1989; 21:3667-9. 2. RossR. The pathogenesis of atherosclerosis. N Engl J Med, 1986; 314:488. 3. Barro C; Zaoui P; Benhamou PY. Matrix metalloproteinase expression in rat pancreatic islets. Pancreas, 1998; 17(4):378-82. 4. Chen J, Myllarniemi M, Akyurek LM, Hayry P, Marsden PA, Paul LC. Identification of differentially expressed genes in rat aortic allograft vasculopathy. Am Jpathol, 1996; 149:597-611. 5. Steler-Stevenson WG, Liotta LA, Kleiner DE. Extracellu LRole of matrix metalloproteinase in tumor invasion and metastasis. FASESJ, 1993, 7:1434. 6. Hayry P. Chronic rejection: risk factors, regulation, and possible sites of therapeutic intervention. Transplant Proc.1998; 30(5): 2407-10.3三、探讨方案（一）探讨目标、探讨内容和拟解决的关键问题探讨目标：通过视察，比较大鼠腹主动脉移植硬化模型与基因干预后 TIMP-1，TIMP-2 的动态改变对移植血管硬化进程的影响，验证我们的推想，为临床防治 CR 探究新的治疗途径及最佳切入时间。探讨内容：1动物模型：建立移植大鼠腹主动脉硬化加快模型（慢性排斥动物模型）。2视察指标及方法：（1）HE 染色、光镜视察腹主动脉组织学变更。（2）计算机图象分析系统，计算内膜厚度。（3）免疫组化染色，DNA 探针原位杂交，Northern blot 以及 Western blot，视察整 体环境下不同内膜厚度所对应的 TIMP 定位、定量。3重组真核表达载体的构建，将扩增的 TIMP-1 及 TIMP-2，CDNA 构建入真核表达 载体 PCDNA3.1 内。4体外转染血管内皮细胞平滑肌细胞，确定目的基因表达，Northern blot 及 Western blot 确定体外状态下 TIMP-1 及 TIMP-2 的 mRNA 及蛋白短暂表达。5TIMP 基因转染试验鼠，cDNA 探针视察其定位表达，免疫组化方法、Northern blot 及 Western blot 定量分析整体环境下 TIMP 的动态改变及视察血管内膜组织学及平滑肌细胞形态及位置的变更。拟解决的关键问题：1表达 TIMP-1 及 TIMP-2 的真核表达载体构建。2检测 TIMP-1 及 TIMP-2 基因导入大鼠体内（转染局部）肌肉组织后体内相关 mRNA及蛋白的产生，确定对大鼠移植血管硬化进程的影响。42.拟实行的探讨方法、技术路途、试验方案即可性行分析 探讨方法：1）重组真核表达载体及相关蛋白的表达 通过 RT-PCR 从大鼠的组织中克隆 TIMP-1 及 TIMP-2 并通过测序。将基因构建入真核表达载体-psDNA3.1 中。通过脂质体法或磷酸钙-DNA 法将质粒 DNA 导入血管内皮细胞，验证相关蛋白质在真核细胞中表达。2）大鼠模型的确定。3）TIMP-1 及 TIMP-2 基因治疗模型大鼠 采纳的基因治疗方案为：非病毒载体-质粒 DNA 通过肌肉注射方式导入体内；确定 体内导入 TIMP-1 及 TIMP-2 基因的表达。4）盲法评定各项指标的改变 5）探讨最佳切入点技术路途：见附页可行性分析：1）建立 SD-WISTAR 大鼠移植腹主动脉 CR 加快模型。2）本院肝病治疗探讨中心和肿瘤治疗探讨中心具备进行基因克隆、重组及基因治疗探讨的技术及设备，完全能克隆大鼠 TIMP-1 及 IMP-2 cDNA。3）本探讨小组长期从事肝、血管等器官及组织移植的临床和基础探讨。4）国外已有利用含干扰素目的基因的 PCDNA3.1 载体肌肉注射，能产生干扰素使其 分泌，发挥全身抗肿瘤作用，本探讨通过肌肉注射质粒 DNA，表达 TIMP-1 及 IMP-2 cDNA使其分泌发挥远处生物活性，是可行的。现有设备见后3本项目的创新之处 1）通过抑制血管内膜基质的降解，探究预防和治疗 CR 的新途径。国内外尚未见报道。2）用较为平安或简便的质粒 DNA 技术治疗 CR。3）探究更为合理的 CR 治疗切入时机。54. 年度探讨安排及预料进展20027 至 200212建立 SD-Wister 大鼠移植腹主动脉 CR 加快模型。20031 至 200312TIMPs 基因治疗抑制大鼠主动脉移植硬化的探讨，20041 至 20045TIMPs cDNA 真核表达载体的构建及体外表达。20046 至 200412进一步探究基因治疗的最佳切如点, 整理资料，撰写论文、申报成果。 5. 预期探讨成果1）基因治疗慢性排斥反应标准的方法的建立。2）申报 2-3 项专利。3）获省部级科研成果奖一项。6 五、经费预算 支 出 科 目 金额 （万元）计 算 根 据 及 理 由 1. 合 计 300 科研业务费 03 资料搜集，发表论文，参与学术会议，成果申报等试验材料费 19购买消耗试剂 0.3细胞培育基及小牛血清 0.1QIACEN 抽提质粒试剂盒 0.3RNA 抽提及逆转录试剂盒 0.1探针、引物、抗体 0.3内切酶、Tag 酶、Rnase0.1DNA 序列分析 0.1一般试验材料消耗 0.2动物及饲养费 0.4 仪器设备费02试验室改装费 0协作费 03样品的分析测定 项目组织实施费 03按 10%提取 注: 预算支出科目按下列依次填写: 1. 科研业务费2. 试验材料费3. 仪器设备费4. 试验室改装费5. 协作费6. 项目组织实施费。 八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。假如获得资助，我与本项目组成员将严格遵守重庆市卫生局医学科学探讨项目管理方法的有关规定，切实保证探讨工作时间，按安排仔细开展探讨工作，按时报送有关材料。 申请者（签章） 2001 年 5 月 1 日 11 九、举荐看法 （不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家举荐。举荐时，请仔细负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、探讨实力、科研看法及探讨条件等。项目组成员不能做举荐者）举荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位：1.申请者所在单位学术委员会的审查看法（包括：对项目的意义、特色和创新之处及申请者的探讨.