同位素标记方法蛋白质组学幻灯片.ppt

同位素标记方法蛋白质组学第1页，共15页，编辑于2022年，星期五稳定同位素标记代谢标记法：代谢标记法：在培养基中添加15N或其他同位素氨基酸（15C或2H)的氨基酸，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。化学标记法：化学标记法：在收集蛋白质样品后，利用化学反应在蛋白质或肽段的特殊位点引入同位素标签，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。第2页，共15页，编辑于2022年，星期五常见的同位素标记技术代谢标记法：代谢标记法：（1）15N标记法 （2）细胞培养中含有稳定同位素的氨基酸标记法（SILAC)化学标记法：化学标记法：（1）ICAT法 （2）iTRAQ法 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 辉骏生物：辉骏生物：http:/ Labelin corporation随着细胞培养的传代，细胞种原有的”轻“型蛋白质逐渐被”重“型蛋白质蛋白质代替 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 技术优势技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%；（2）定量精确：）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；（3）高通量、灵敏度高：）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平；（4）相容性：）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记；（5）灵活性：）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。辉骏生物：辉骏生物：http:/ （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化，（4）ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。（6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生-消除反应使部分标签断裂。辉骏生物：辉骏生物：http:/ iTRAQ 结构结构 iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8组样品。2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同。辉骏生物：辉骏生物：http:/ 缺点：缺点：（1）iTRAQ几乎可以标记所有的蛋白质，因此样本的污染对结果有影响。（2）iTRAQ标记反应体系中有机体积高达60%以上，蛋白质非常容易发生沉淀而损失。化学标记法iTRAQ 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 辉骏生物：辉骏生物：http:/