外源基因在真核细胞中表达及调控幻灯片.ppt

外源基因在真核细胞中表达及调控第1页，共44页，编辑于2022年，星期五第一节真核细胞基因表达的调控一、真核生物基因表达的特点及优势二、真核细胞表达及调控元件第2页，共44页，编辑于2022年，星期五第二节哺乳动物细胞表达系统的选择标记基因一、胸苷激酶基因选择标记（定义）二、二氢叶酸还原酶基因选择标记三、新霉素抗性基因选择标记四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因第3页，共44页，编辑于2022年，星期五第三节真核细胞表达系统的载体种类一、载体的类型二、几种常用的真核表达载体第4页，共44页，编辑于2022年，星期五一、一、真核生物基因表达的特点真核生物基因表达的特点及优势及优势1.细胞的全能性2.转录和翻译分开进行3.有相当大的非编码区（调控序列）4.有三种不同RNA聚合酶参与转录5.初级转录产物能进行剪接加工修饰6.不存在操纵子结构7.基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分别转录第5页，共44页，编辑于2022年，星期五二、真核细胞表达及调控元件二、真核细胞表达及调控元件（一）真核生物基因转录水平的调控（一）真核生物基因转录水平的调控（二）转录后水平的调控（二）转录后水平的调控（三）翻译水平的调控（三）翻译水平的调控第6页，共44页，编辑于2022年，星期五胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核细胞中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP,继续磷酸化生成dTTP,参与DNA的生物合成。第7页，共44页，编辑于2022年，星期五一、载体的类型1.质粒型载体2.病毒载体3.整合型表达载体4.游离型表达载体5.瞬时表达载体6.稳定性表达载体7.非复制性HSV-病毒（单纯疱疹病毒HSV-型）载体8.裂解性HSV-病毒载体第8页，共44页，编辑于2022年，星期五二、几种常用的真核表达载体逆转录病毒载体1.卸甲载体2.穿梭载体痘类病毒载体HSV-单纯疱疹病毒载体1.重组病毒型载体2.重组质粒型载体3.裂解型病毒载体第9页，共44页，编辑于2022年，星期五（一）真核生物基因转录水平（一）真核生物基因转录水平的调控的调控1.基因调控的顺式作用元件1)启动子2)增强子3)RNA剪接信号4)负调控元件5)终止子和polyA信号2.基因调控的反式作用因子1)概念2)反式作用因子主要作用规律第10页，共44页，编辑于2022年，星期五（二）转录后水平的调控（二）转录后水平的调控1.mRNA前体加工：转录的mRNA前体经5加帽，3酶切加尾去除内含子后，产生成熟mRNA，通过核孔进入胞质中。2.RNA编辑（RNAediting）第11页，共44页，编辑于2022年，星期五（三）翻译水平的调控（三）翻译水平的调控1.翻译起始序列2.eIF-2的磷酸化反应3.由模板来源的遗传信息，进而可编码产生不同氨基酸序列的多种蛋白质，这是生物适应性的保护措施。第12页，共44页，编辑于2022年，星期五顺式作用元件顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录按效应和功能可分为启动子、增强子、RNA间接信号、负调控元件、终止子等调控元件。第13页，共44页，编辑于2022年，星期五反式作用因子主要作用规律1.同一DNA序列可被不同蛋白质识别2.同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系，多数是通过蛋白质-蛋白质先相互作用后，再与DNA结合，发挥调节作用。3.反式作用因子的自身生物合成有相当大的可变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元件相互作用的特定结构域，有两种类型：1)通用转录因子的结构域为识别特异DNA的DNA结合结构域，如：锌指结构。2)转录调节因子的结构域又称转录活化结构域，如：酸性-螺旋结构域。不同结构域各自的特征第14页，共44页，编辑于2022年，星期五不同结构域各自的特征1.通用转录因子的DNA结合结构域1)锌指结构2)亮氨酸拉链3)螺旋-转角-螺旋（HTH）4)螺旋-环-螺旋2.转录调节因子的转录活化结构域第15页，共44页，编辑于2022年，星期五RNA编辑（RNAediting）RNA编辑是在转录时或转录后，能够改变RNA分子编码特性，是与剪切形式不同的一种修饰形式，如可使mRNA某位点密码子CAA转变为UAA，使C变U，编辑的结果形成了UAA终止密码子，在编码酶的作用下，除使C变U，还可在RNA上添加多个U或呈单个C的添加，使前体mRNA变成成熟mRNA时，通过插入或替换方式，可改变和扩大原遗传信息，编码多种蛋白,是生物的适应性保护。第16页，共44页，编辑于2022年，星期五翻译起始序列在ATG起始密码子周围要有5-CCACCA-TGG-3保守序列，以利mRNA翻译起始，若发生突变，其翻译水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比较多的二级结构序列，也会影响翻译，建议外源基因的5端AUG上游序列不宜过长。第17页，共44页，编辑于2022年，星期五eIF-2的磷酸化反应eIF-2为转译起始因子-2是蛋白质合成起始阶段13种起始因子中最为关注的因子。若转入动物细胞中的质粒DNA的两条链一旦都发生转录，就会形成双链互补mRNA，而激活胞内的双链RNA激活的蛋白激酶（DAIPK）该激酶可使eIF-2的-亚基磷酸化，转译受抑，为防止该激酶活化，常在载体上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶合成的小分子RNA，能阻止双链RNA对DAI激酶的激活作用，使转译得以正常进行。第18页，共44页，编辑于2022年，星期五一、胸苷激酶基因选择标记外源基因+载体(TK+)的重组体导入TK-细胞中，在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）选择培养基中筛选，TK-细胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+细胞可存活，以此进行筛选。（HSV-1的TK基因转染细胞加GCV后被杀死，如小鼠LMTK-细胞。）注：TK+BrUdR因掺入后对紫外线敏感而死亡，TK-+BrUdR因不掺入，对紫外线不敏感而存活。第19页，共44页，编辑于2022年，星期五二、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）选择标记DHFR是合成dATP和dGTP的关键酶。常用DHFR的CHO细胞因不能合成四氢叶酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基中生长。在不含该培养基中导入该标记基因重组子，则可筛选出阳性克隆，也可将DHFR基因置在强启动子下高表达或通过DHFR基因突变以提高抵抗高浓度氨甲喋呤（抗MTX的抗性）的能力，从而筛选阳性克隆。第20页，共44页，编辑于2022年，星期五三、新霉素抗性基因选择标记新霉素类似物G418抗生素，可影响80s核糖体RNA功能，对细胞有毒性。新霉素抗性基因neo的载体可在真核细胞中表达产生新霉素磷酸转移酶能使G418失活，可在含G418培养基中筛选重组体转化的阳性克隆细胞。阳性克隆存活，阴性者死亡。第21页，共44页，编辑于2022年，星期五五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化细胞中就能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA合成正常进行，加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞。第22页，共44页，编辑于2022年，星期五1.质粒型载体质粒型载体（穿梭载体）：实际上是病毒质粒型载体，共有两套复制元件和选择标记，在原核中复制，真核中表达。第23页，共44页，编辑于2022年，星期五2.病毒载体病毒载体种类多，SV40、Adv、RV、HSV-1、痘苗V。可在敏感细胞中复制，表达外源基因，有的还可通过整合后表达。第24页，共44页，编辑于2022年，星期五3.整合型表达载体RV、SV40可携带外源基因整合到宿主细胞的基因组中进行表达。第25页，共44页，编辑于2022年，星期五4.游离型表达载体该病毒载体是以完整的或缺陷病毒形式携带外源基因导入宿主细胞后不发生整合，可在胞浆中游离复制，表达外源基因，如痘苗V、Adv。第26页，共44页，编辑于2022年，星期五5.瞬时表达载体瞬时表达载体（转染后70-90h左右）：含病毒复制子的病毒载体，可携带外源基因导入宿主细胞，不整合到染色体上，只在细胞内进行暂时性表达，不能随细胞传代，随后逐渐降低或消失。常用SV40复制子载体，在COS细胞中表达，由于载体复制，若超过104个/细胞，细胞不能承受而死亡。第27页，共44页，编辑于2022年，星期五6.稳定性表达载体将外源基因与具标记基因（DHFR）病毒载体转染动物细胞（CHO），可将基因整合到细胞染色体上，可随细胞转录表达和传代。（CHO、DUKX-B11因加入氨甲喋呤而死亡，依此筛选阳性克隆。）第28页，共44页，编辑于2022年，星期五7.非复制性HSV-病毒（单纯疱疹病毒HSV-型）载体HSV-1病毒去除极早期基因，失去复制能力，但携带外源基因转染细胞后高效表达，毒性小，转染和表达能力强。第29页，共44页，编辑于2022年，星期五8.裂解性HSV-病毒载体HSV-1病毒去除了早期基因，而不能产生DNA合成所需的酶，该病毒在静止细胞中不能复制和裂解细胞，但在高度分裂活跃的细胞中（如肿瘤）可复制并裂解感染的细胞，因分裂活跃细胞可提供病毒复制所需的DNA合成酶，复制时只杀死肿瘤细胞，对正常细胞无损害。第30页，共44页，编辑于2022年，星期五逆转录病毒载体逆转录病毒载体是RNA单链，pol基因产生逆转录酶，使单链生成双链。有5、3的U3RU5的长末端重复序列，有TATA强启动子和加尾功能，经体外包装，可整合表达。穿梭质粒载体组装基因后，可由辅助病毒协助或经体外细胞包装，形成具感染性假病毒颗粒，再感染宿主细胞进行表达。第31页，共44页，编辑于2022年，星期五痘类病毒载体已用于构建多价活疫苗载体（HBsAg、HA、狂犬、HAV、麻疹V、HSV-、EBV等。该载体的双链DNA的大病毒载体，组装量大，安全，可在细胞独立复制，表达。第32页，共44页，编辑于2022年，星期五1.重组病毒型载体在HSV-1非必需区插入外源基因的重组体DNA与野毒株共转染细胞，可发生同源重组，通过LacZ筛选，转染效率高，无需辅助病毒，但有毒性作用。第33页，共44页，编辑于2022年，星期五启动子大多位于基因5端上游区，是一种与基因转录起始有关的5端DNA序列，在-30bp区有TATAbox，可引导RNA聚合酶转录起始，在-70-80bp区还有GCbox，可协同调节转录起始频率和提高转录效率。常用的启动子有RSV启动子、CMV启动子、SV40早期启动子。第34页，共44页，编辑于2022年，星期五增强子增强子是一类可使启动子的基因转录效率显著提高的顺式作用元件，本身无启动子活性，可独立存在与上游区、下游区或基因内部，可进行远距离增强启动作用，而且无方向性。它有特征性序列，常由812bp组成，以单拷贝或多拷贝的形式存在。增强子可使转录效率增强10-100倍，通常来源于SV40、RSV或CMV病毒。一旦增强子的作用使表达产物对细胞有毒性时，最好改用诱导型启动子来表达外源基因，如热休克启动子、金属硫蛋白启动子。第35页，共44页，编辑于2022年，星期五RNA剪接信号虽然cDNA来源的基因转入哺乳类细胞后，其表达不受有或无内含子的影响，但在该细胞中表达最好有一段内含子序列的剪接信号，以提供对cDNA基因表达的需要，常用SV40的小t抗原的内含子序列来作为cDNA中的内含子剪接序列。第36页，共44页，编辑于2022年，星期五负调控元件沉默子和衰减子为转录的负调控元件，它们与反式作用因子相互作用而起作用，不受距离、方向、基因来源的限制。第37页，共44页，编辑于2022年，星期五终止子和polyA信号真核基因转录的确切终止信号和终止机制目前尚不清楚，现发现在模板DNA分子3端有一终止序列，称终止子，产生具有polyA尾的转录序列，在DNA区域内G/T簇。如SV40中的终止子序列为AGGTTTTTT的DNA序列，并有发夹结构的反向重复序列。polyA可使mRNA稳定其多聚腺苷酸化需要两种序列：位于polyA位点下游的GU或U丰富区，位于polyA上游11-30bp处的6bp高度保守序列（5-AAUAAA）与转录后的RNA切割和加尾有关。第38页，共44页，编辑于2022年，星期五反式作用因子的概念反式作用因子是一组能直接或间接地与DNA的顺式作用元件特定序列结合，发挥调节作用的核内非组蛋白，即DNA结合蛋白（DBP），DBP又称转录因子（transcriptionfactor,TF）分通用转录因子及转录调节因子两大类。基因表达的组织特异性及细胞周期特异性受上述元件和因子的相互作用所决定，通用转录因子中识别TATAbox的为TFD，可与RNA聚合酶结合使转录起始，识别GCbox的DBP为SP1，可调控转录效率。第39页，共44页，编辑于2022年，星期五锌指结构锌指（zinefinger）结构：由两个半胱氨酸（Cys）和两个组氨酸（His）残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构，表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关。一个蛋白分子有2-9个锌指重复单位，由指部碱基或极性氨基酸（赖氨酸Lys、精氨酸Arg）结合于DNA双螺旋的深沟内。结构域为以锌辅基螯和形成的环状结构作为活性结构域。第40页，共44页，编辑于2022年，星期五亮氨酸拉链亮氨酸拉链（Leucinezipper，LZ）：为两组走向平行带亮氨酸的-螺旋形成的对称二聚体，每个亚基含4个亮氨酸，每2个Leu之间相隔6个氨基酸。于-螺旋的某一侧面，每2圈（3.6碱基/圈）就出现一个Leu，排成一排，使2个-螺旋蛋白分子间形成一条拉链，只有在形成二聚体拉链后，链上富含的碱性氨基酸区可与DNA结合。结构域为链上碱性区和亮氨酸拉链形成的稳定结构为基础。第41页，共44页，编辑于2022年，星期五螺旋-转角-螺旋（HTH）螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）：此-螺旋中含碱性氨基酸较多，其所带的正电荷基团可与带负电荷的DNA链结合。第42页，共44页，编辑于2022年，星期五螺旋-环-螺旋螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）：HLH与HTH结构相似，不同之处为两个-螺旋之间的肽链为非螺旋的环，在-螺旋附近的氨基酸也有碱性区，为与DNA结合所必需，DNA结合性质与亮氨酸拉链相似。第43页，共44页，编辑于2022年，星期五转录调节因子的转录活化结构域DBP中有一段与非特异性调控转录活性功能有关的结构区域，主要有：酸性-螺旋结构域。此结构域含有较多的带负电荷，并能形成亲脂性-螺旋区域。富含谷氨酰胺结构域，在结构域中含有25%谷氨酰胺。富含脯氨酸结构区域，在此结构中有富含脯氨酸结构区域，约含有20-30%脯氨酸。第44页，共44页，编辑于2022年，星期五