实验紫外可见与分子荧光光谱幻灯片.ppt

实验 紫外可见与分子荧光光谱第1页，共26页，编辑于2022年，星期五目目 录录一一 实验目的实验目的二二实验原理实验原理 1 紫外紫外-可见光谱基本原理可见光谱基本原理 2 分子荧光光谱基本原理分子荧光光谱基本原理 3 仪器结构仪器结构三三 仪器和试剂仪器和试剂 四四实验内容实验内容 1 有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应 2 硫酸奎宁激发、发射光谱测定及标准曲线法定量分析硫酸奎宁激发、发射光谱测定及标准曲线法定量分析五五数据记录与结果分析数据记录与结果分析 六六思考题思考题 第2页，共26页，编辑于2022年，星期五一一实验目的实验目的1 1 掌握紫外可见分光光度法和分子荧光的掌握紫外可见分光光度法和分子荧光的分析原理分析原理，了解两，了解两者的区别与联系者的区别与联系2 2熟悉紫外可见分光光度计和分子荧光的熟悉紫外可见分光光度计和分子荧光的结构及特点结构及特点，掌握其操作，掌握其操作使用方法。使用方法。3 3掌握苯及其衍生物的紫外吸收光谱及其鉴定方法，以及溶剂掌握苯及其衍生物的紫外吸收光谱及其鉴定方法，以及溶剂极性对紫外吸收光谱的影响。极性对紫外吸收光谱的影响。4.4.掌握分子荧光激发光谱和发射光谱的概念和测定方法，及标准掌握分子荧光激发光谱和发射光谱的概念和测定方法，及标准曲线法定量测定硫酸奎宁含量的方法。曲线法定量测定硫酸奎宁含量的方法。5.5.掌握掌握OriginOrigin软件进行数据画图及图谱处理软件进行数据画图及图谱处理第3页，共26页，编辑于2022年，星期五1 紫外-可见光谱基本原理 电子电子从低能级跃迁跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应波长的光，这样产生的吸收光谱叫紫外光谱紫外光谱。分子中分子中电子能级跃迁电子能级跃迁的光波波长范的光波波长范围为围为10800nm 其中其中:10190nm：远紫外区远紫外区-真空紫外区；真空紫外区；190400nm：近紫外区，又称紫外光区；：近紫外区，又称紫外光区；400800nm：可见光区。：可见光区。第4页，共26页，编辑于2022年，星期五 *n*n*n第5页，共26页，编辑于2022年，星期五nn远紫外远紫外近紫外近紫外可见光可见光 *远紫外远紫外 10-200nm n*紫外紫外-可见可见 200-250nm n*紫外紫外-可见可见 200-400nm *远紫外远紫外-紫外紫外 150-700nm饱和烃键电子跃迁，它需要的能量较高，一般发生在真空紫外光区，饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可见分光光度计的测量范围。例如甲烷的max为 135nm。不饱和烃类和共轭体系，它需要的能量低于-*的跃迁，吸收峰一般处于近紫外光区，在200nm左右。其特征是摩尔吸光系数大，一般max104 为强吸收带。如乙烯(蒸气)的最大吸收波长max 为 162nm。在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长，*跃迁的吸收带将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。在共轭体系中，*跃迁产生的吸收带又称为K带。杂原子不饱和基团，这类跃迁发生在近紫外光区和可见光区，其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100，属于禁阻跃迁。有机化合物中的H被杂原子取代后，实现这类跃迁所需要的能量较高，比*跃迁所需的能量少，吸收光谱的波长一般在150250nm处。其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区，例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n*跃迁分别出现在173、204和258nm处。这些数据说明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的吸收波长发生了红移，显示了助色团的助色作用第6页，共26页，编辑于2022年，星期五 直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大。但是它们是测定紫外和可见吸收光谱的良好溶剂。紫外光谱只能观察-*和 n-*跃迁。也就是说紫外光谱只适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。能测试不饱和共轭双键的化合物、芳香族化合物和过度金属离子。根据吸收的波长，推断是什么价电子跃迁，从而判定分子结构骨架、配合红外光谱法、核磁共振波谱法和质谱法等进行定性和结构分析，它是一种有用的辅助手段。紫外吸收光谱虽然不能对一种化合物作出准确鉴定，但对化合物中官能团和共轭体系的推测与确定却非常有效。结构完全相同的化合物应有相同紫外谱图，但谱图相同的却不一定是同种化合物。将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。第7页，共26页，编辑于2022年，星期五 紫外光谱图及表示方法紫外光谱图及表示方法 或或lg nm横坐标：波长横坐标：波长（nm）纵坐标：纵坐标：A,T,1-T,log,核心三要素：核心三要素：吸收峰位置吸收峰位置 吸收强度吸收强度 形状形状第8页，共26页，编辑于2022年，星期五 苯：苯：E E1 1带带:180180 184nm184nm =4700047000E E2 2带带:200200 204 nm 204 nm =70007000E E带：带：苯环上三个苯环上三个共扼双键共扼双键 *跃迁特征吸收带跃迁特征吸收带B带带:*与与苯环振动引起苯环振动引起 230-270 nm =200 含取代基时，含取代基时，B带简化，红移。带简化，红移。苯及苯环上不同取代基对紫外光谱的影响苯及苯环上不同取代基对紫外光谱的影响第9页，共26页，编辑于2022年，星期五紫外光谱的溶剂效应紫外光谱的溶剂效应溶剂效应溶剂效应：在不同溶剂中谱带产生的位移。受溶剂的极性或酸在不同溶剂中谱带产生的位移。受溶剂的极性或酸碱性的影响，使溶质吸收峰的波长、强度以及形状发生不同程碱性的影响，使溶质吸收峰的波长、强度以及形状发生不同程度的变化度的变化 溶剂选择的原则溶剂选择的原则：1、不与被测组分发生化学反应 2、所选溶剂在测定波长范围内无明显吸收。3、对被测组分有较好的溶解能力 4、被测组分在所选的溶剂中有较好的峰形第10页，共26页，编辑于2022年，星期五极性溶剂极性溶剂中紫外吸收光谱的精细结构完全消失中紫外吸收光谱的精细结构完全消失 第11页，共26页，编辑于2022年，星期五EnEpEnEp *n *n*跃迁跃迁n*跃迁跃迁非极性溶剂非极性溶剂 极性溶剂极性溶剂 非极性溶剂非极性溶剂 极性溶剂极性溶剂-*:基态的极性小于激发态的极性，极性溶剂与激发态间相互作用基态的极性小于激发态的极性，极性溶剂与激发态间相互作用(稳定稳定作用作用)大于基态大于基态,导致极性溶剂中导致极性溶剂中Ep 降低降低,max向长波方向移动。向长波方向移动。n-*:非成键非成键n电子与极性溶剂相互作用形成氢键电子与极性溶剂相互作用形成氢键,极性溶剂与基态间相互作用极性溶剂与基态间相互作用(稳定作用稳定作用)大于激发态态降低了基态的大于激发态态降低了基态的,导致极性溶剂中导致极性溶剂中EpEn,max向短波向短波方向移动方向移动*跃迁，溶剂极性增加，吸收红移。跃迁，溶剂极性增加，吸收红移。n*跃迁，溶剂极性增加，吸收蓝移。跃迁，溶剂极性增加，吸收蓝移。第12页，共26页，编辑于2022年，星期五溶剂效应对丙酮紫外吸收的影响溶剂效应对丙酮紫外吸收的影响1-1-己烷己烷 2-95%2-95%乙醇乙醇 3-3-水水 第13页，共26页，编辑于2022年，星期五2 分子荧光光谱基本原理分子荧光光谱基本原理 除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光等射线荧光等荧光荧光:电子从被激发到单基态S1跃迁到基态S0所发出的光 第14页，共26页，编辑于2022年，星期五激发谱和发射谱激发谱和发射谱 激发谱激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关正相关关系吸收谱与发射谱呈镜象对称镜象对称关系。基态上的各振动能级分布基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动与第一激发态上的各振动能级分布类似能级分布类似第15页，共26页，编辑于2022年，星期五荧光的定量分析荧光的定量分析在稀溶液中，荧光强度F 与物质浓度c有以下关系：F2.3Kb cI02.3KAI0，当激发光强度一定，且浓度很小时，荧光强度与荧光物质浓度成正比，即F=Kc。这是荧光光谱法定量分析的依据。此关系只限于极稀溶液。保证荧光分析线性的关键:溶液尽量稀释(吸光度小于0.05)对于较浓的溶液，其吸光度超过0.05时，使荧光物质分子之间以及荧光物质分子同溶剂分子之间的碰撞增加，导致无辐射去活增加而发生自熄灭。第16页，共26页，编辑于2022年，星期五1412108642161412108642ConcentrationFLRIntensityActualIdeal第17页，共26页，编辑于2022年，星期五荧光的浓度效应荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。原因可能是：原因可能是：原因可能是：原因可能是：a 浓度增加，分子浓度增加，分子碰撞机会增加碰撞机会增加碰撞机会增加碰撞机会增加，增加了，增加了，增加了，增加了非辐射损耗非辐射损耗。b b 溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光内滤光内滤光内滤光）c c 吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收自吸收自吸收自吸收）d d 仪器原因仪器原因仪器原因仪器原因第18页，共26页，编辑于2022年，星期五3 仪器结构 紫外分光光度计;荧光分光光度计第19页，共26页，编辑于2022年，星期五荧光光谱法与紫外可见分光光度法的比较荧光光谱法与紫外可见分光光度法的比较n n仪器结构仪器结构仪器结构仪器结构n n分析方法分析方法分析方法分析方法 n n荧光光谱法荧光光谱法灵敏度高，信息大灵敏度高，信息大n n紫外可见分光光度法应用广泛紫外可见分光光度法应用广泛第20页，共26页，编辑于2022年，星期五 三三.仪器和试剂仪器和试剂仪器：仪器：UV-2450UV-2450紫外可见光谱紫外可见光谱 FluroMax-4 FluroMax-4分子荧光光谱分子荧光光谱试剂：苯、苯酚、苯甲酸、环己烷、丁酮、异丙叉丙酮、无试剂：苯、苯酚、苯甲酸、环己烷、丁酮、异丙叉丙酮、无水乙醇、蒸馏水；水乙醇、蒸馏水；硫酸奎宁硫酸奎宁 (C20H24N2O2)2H2SO42H2O 第21页，共26页，编辑于2022年，星期五四四.实验内容实验内容（一）有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应（一）有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应图谱图谱比色管比色管样样品比色皿品比色皿 参比比色皿参比比色皿图图10.05ml 苯苯/环环己己烷烷 10ml10d/环环己己烷烷 3ml环环己己烷烷 3ml图图20.05g 苯酚苯酚/环环己己烷烷 10ml 2d/环环己己烷烷 3ml环环己己烷烷 3ml图图30.05g 苯甲酸苯甲酸/环环己己烷烷 10ml 3d/环环己己烷烷 3ml环环己己烷烷 3ml图图40.05ml 丁丁酮酮/无水乙醇无水乙醇 10ml3ml无水乙醇无水乙醇 3ml0.05ml 丁丁酮酮/蒸蒸馏馏水水 10ml3ml 蒸蒸馏馏水水 3ml图图50.01ml 异丙叉丙异丙叉丙酮酮/无水乙醇无水乙醇10ml 3d/无水乙醇无水乙醇 3ml无水乙醇无水乙醇 3ml0.01ml 异丙叉丙异丙叉丙酮酮/蒸蒸馏馏水水10ml1d/蒸蒸馏馏水水 3ml 蒸蒸馏馏水水 3ml第22页，共26页，编辑于2022年，星期五（二）硫酸奎宁激发、发射光谱测定及标准曲线法定量分析（二）硫酸奎宁激发、发射光谱测定及标准曲线法定量分析寻找硫酸奎宁的激发光谱（图6）和发射光谱（图7），找到最大激发波长ex和最大发射波长em 标准曲线的绘制：以最大激发波长ex为激发波长，测量系列标准溶液荧光强度。以溶液荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线（图 8）。未知样测定：将未知样与标准系列溶液同样条件，测定荧光强度，在标准曲线上找出对应浓度。第23页，共26页，编辑于2022年，星期五五数据记录与结果分析五数据记录与结果分析 （一）有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应（一）有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应（一）有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应（一）有机化合物紫外吸收光谱及溶剂效应1.1.采用采用OriginOrigin软件绘制图软件绘制图1 1图图5 5，谱图上标注图号。用一张，谱图上标注图号。用一张A4A4纸正反两面纸正反两面打印打印5 5张图谱，附于实验报告中。张图谱，附于实验报告中。2.2.在实验报告中，讨论与图号相对应的以下内容。在实验报告中，讨论与图号相对应的以下内容。图图1 1图图3 3：比较苯环上不同取代基对紫外吸收光谱的影响？试说明原因。：比较苯环上不同取代基对紫外吸收光谱的影响？试说明原因。图图4 4：比较：比较n n *跃迁随溶剂极性增大跃迁随溶剂极性增大maxmax如何改变？试说明原因。如何改变？试说明原因。图图5 5：比较：比较 *跃迁随溶剂极性增大跃迁随溶剂极性增大maxmax如何改变？试说明原因。如何改变？试说明原因。第24页，共26页，编辑于2022年，星期五（二）硫酸奎宁激（二）硫酸奎宁激发发、发发射光射光谱测谱测定及定及标标准曲准曲线线法定量分析法定量分析1.采用Origin软件绘制图6、图7，谱图上标注图号。用一张A4纸打印 2张图谱，附于实验报告中。2.在实验报告中，记录硫酸奎宁系列标准溶液和未知样品的荧光强度如下：溶液名称溶液1溶液2溶液3溶液4溶液5溶液6未知溶液溶液浓度g/mL荧光强度3.在实验报告中，绘制标准曲线（图8），并虚虚线线标出未知样荧光强度及对应的浓度。第25页，共26页，编辑于2022年，星期五六思考题六思考题1.当助色团或生色团与苯环相连时，紫外吸收光谱有那些变化？2 当被测试液浓度太大或太小时，对紫外吸收光谱测量将产生怎样影响，应如何加以调节？3.同紫外吸收光谱法相比，为什么分子荧光光度法的灵敏度通常更高？选择性也更好？4.影响荧光定量分析准确性的因素有哪些？在分析过程中应该注意哪些问题？5结合本实验的目的和要求，请谈谈你对该实验的看法。（如：你觉得该实验还有什么需要改进的地方？或者你觉得该实验哪个部分的设计你最满意？请写出你的建议或意见，我们共同提高！谢谢！）第26页，共26页，编辑于2022年，星期五