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课题制作泡菜并检测亚硝酸盐含量本讲稿第一页，共三十页一、基础知识一、基础知识（一）、乳酸菌（一）、乳酸菌 1、生物类别：细菌（原核细胞）。、生物类别：细菌（原核细胞）。2、代谢类别：异养厌氧型。、代谢类别：异养厌氧型。3、生长方式：分裂生长。生长方式：分裂生长。4、分布：空气、土壤、植物体表、人或动物肠、分布：空气、土壤、植物体表、人或动物肠 道内部都有。道内部都有。5、适宜条件：耐盐，最适、适宜条件：耐盐，最适pH=5C6H12O6 2C3H6O3+能量能量酶酶本讲稿第二页，共三十页乳酸链球菌（球状）乳酸链球菌（球状）乳酸杆菌（杆状）乳酸杆菌（杆状）为什么含有抗生素为什么含有抗生素的牛奶不能发酵为的牛奶不能发酵为酸奶？酸奶？本讲稿第三页，共三十页（二）、亚硝酸盐（二）、亚硝酸盐 自然界中，亚硝酸盐自然界中，亚硝酸盐分布广泛分布广泛，蔬菜、咸，蔬菜、咸菜、豆粉中均含有。菜、豆粉中均含有。亚硝酸盐为亚硝酸盐为白色粉末白色粉末，外观与食盐相似，有，外观与食盐相似，有咸味，易溶于水，可作咸味，易溶于水，可作食品添加剂食品添加剂。亚硝酸盐为亚硝酸盐为强氧化剂强氧化剂，能够把血液中携，能够把血液中携带氧的低铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白，带氧的低铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而导致缺氧性中毒症状。从而导致缺氧性中毒症状。本讲稿第四页，共三十页 膳食中的亚硝酸盐膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康一般不会危害人体健康，但是，但是，当人体摄入的亚硝酸盐总量达到当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.30.5g时，会时，会引引起中毒起中毒，当摄入总量达到，当摄入总量达到3g时，会时，会引起死亡引起死亡。膳食中的膳食中的绝大部分绝大部分亚硝酸盐亚硝酸盐随尿排出随尿排出，只有在特，只有在特定的条件下才会转变成致癌物定的条件下才会转变成致癌物亚硝胺亚硝胺，亚硝胺对动，亚硝胺对动物还具有致畸和致突变作用（亚硝酸盐本身不是致物还具有致畸和致突变作用（亚硝酸盐本身不是致癌物质）。癌物质）。亚硝酸盐在亚硝酸盐在pH=3，温度适宜和一定微生物的作用下与，温度适宜和一定微生物的作用下与蛋白质水解的胺转变成致癌物质亚硝胺，因此，在胃中极蛋白质水解的胺转变成致癌物质亚硝胺，因此，在胃中极易生成亚硝胺。易生成亚硝胺。本讲稿第五页，共三十页 我国卫生标准规定：亚硝酸盐的残留量我国卫生标准规定：亚硝酸盐的残留量 在在肉制品肉制品中不得超过中不得超过30mg/kg，酱菜酱菜中不超过中不超过20mg/kg，而而婴儿奶粉婴儿奶粉中不得超过中不得超过2mg/kg。本讲稿第六页，共三十页选泡菜坛选泡菜坛预处理新鲜蔬菜预处理新鲜蔬菜配置盐水配置盐水装坛发酵装坛发酵成品泡菜成品泡菜测定亚硝酸盐含量测定亚硝酸盐含量二、实验设计流程图二、实验设计流程图本讲稿第七页，共三十页检查方法：坛口向上，压检查方法：坛口向上，压入水中，看坛内壁有无渗入水中，看坛内壁有无渗水现象。水现象。无裂纹、无砂眼无裂纹、无砂眼坛沿深、盖子坛沿深、盖子吻合好吻合好火火候候好好三、泡菜制作三、泡菜制作1、泡菜坛的选择、泡菜坛的选择本讲稿第八页，共三十页2、蔬菜处理、蔬菜处理 将鲜菜将鲜菜修整、洗涤、阳光下晾晒修整、洗涤、阳光下晾晒，到菜表皮，到菜表皮萎焉时收下，切分成条状或片状。萎焉时收下，切分成条状或片状。本讲稿第九页，共三十页3、配制盐水、配制盐水清水与盐按4:1的比例配制好后煮沸冷却煮沸冷却。盐的作用：调味，抑制微生物生长，所以盐含量过盐的作用：调味，抑制微生物生长，所以盐含量过低会造成细菌污染。低会造成细菌污染。煮沸的目的：杀菌煮沸的目的：杀菌冷却是为了不影响乳酸菌的生命活动冷却是为了不影响乳酸菌的生命活动。本讲稿第十页，共三十页4、装坛发酵、装坛发酵 将将将将泡菜坛洗净泡菜坛洗净泡菜坛洗净泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。，并用热水洗坛内壁两次。，并用热水洗坛内壁两次。，并用热水洗坛内壁两次。将经过处理的蔬菜将经过处理的蔬菜将经过处理的蔬菜将经过处理的蔬菜混合混合混合混合均匀，装入泡菜坛内，装至均匀，装入泡菜坛内，装至均匀，装入泡菜坛内，装至均匀，装入泡菜坛内，装至半半半半坛时坛时坛时坛时放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满八成满八成满八成满，再徐徐注入配好的盐水，使盐水没过再徐徐注入配好的盐水，使盐水没过再徐徐注入配好的盐水，使盐水没过再徐徐注入配好的盐水，使盐水没过全部菜料全部菜料，盖，盖，盖，盖好坛盖。向坛盖边缘的水槽中好坛盖。向坛盖边缘的水槽中好坛盖。向坛盖边缘的水槽中好坛盖。向坛盖边缘的水槽中注满水注满水注满水注满水。并注意发酵过。并注意发酵过。并注意发酵过。并注意发酵过程中补充水。程中补充水。程中补充水。程中补充水。坛沿注满水是为了保证坛内乳酸菌的发酵所需的坛沿注满水是为了保证坛内乳酸菌的发酵所需的无氧环境。无氧环境。本讲稿第十一页，共三十页装装装装压压压压封封封封本讲稿第十二页，共三十页本讲稿第十三页，共三十页5、腌制条件、腌制条件温度不能过高：常温温度不能过高：常温食盐含量不能过低：食盐含量不能过低：4:1腌制时间不能过短腌制时间不能过短:15天天细菌污染大量繁殖后，细菌污染大量繁殖后，亚硝酸盐含量增加亚硝酸盐含量增加腌制过程中，亚硝酸盐含量先增多，后减少。腌制过程中，亚硝酸盐含量先增多，后减少。本讲稿第十四页，共三十页四、泡菜发酵的阶段四、泡菜发酵的阶段泡菜在发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，发泡菜在发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，发酵产物乳酸不断累积，因此可以根据微生物的酵产物乳酸不断累积，因此可以根据微生物的活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为三个阶段。三个阶段。本讲稿第十五页，共三十页 蔬菜蔬菜蔬菜蔬菜刚入坛刚入坛刚入坛刚入坛时，时，时，时，蔬菜表面带入的微生物蔬菜表面带入的微生物蔬菜表面带入的微生物蔬菜表面带入的微生物，主要是以不抗酸，主要是以不抗酸，主要是以不抗酸，主要是以不抗酸的的的的大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌和和和和酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌等较为活跃，它们产生较多的乳酸、酒精、等较为活跃，它们产生较多的乳酸、酒精、等较为活跃，它们产生较多的乳酸、酒精、等较为活跃，它们产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。形成嫌气状态。形成嫌气状态。形成嫌气状态。发发发发酵酵酵酵产产产产物物物物中中中中除除除除乳乳乳乳酸酸酸酸外外外外，还还还还有有有有其其其其他他他他，如如如如乙乙乙乙醇醇醇醇、COCOCOCO2 2 2 2等等等等称称称称异异异异型型型型乳酸发酵乳酸发酵乳酸发酵乳酸发酵1 1、发酵前期、发酵前期特点：还有一点点氧气，微生物（大肠杆菌，酵母菌）发特点：还有一点点氧气，微生物（大肠杆菌，酵母菌）发酵，产生代谢产物，酵，产生代谢产物，二氧化碳排出，形成无氧环境，为后二氧化碳排出，形成无氧环境，为后二氧化碳排出，形成无氧环境，为后二氧化碳排出，形成无氧环境，为后面乳酸菌发酵提供条件，乳酸含量逐渐增加，抑制微生面乳酸菌发酵提供条件，乳酸含量逐渐增加，抑制微生面乳酸菌发酵提供条件，乳酸含量逐渐增加，抑制微生面乳酸菌发酵提供条件，乳酸含量逐渐增加，抑制微生物生长繁殖。物生长繁殖。物生长繁殖。物生长繁殖。本讲稿第十六页，共三十页 由于由于由于由于前期前期前期前期乳酸的积累乳酸的积累乳酸的积累乳酸的积累，pHpHpHpH下降下降下降下降，嫌气状态嫌气状态嫌气状态嫌气状态的形成，的形成，的形成，的形成，乳酸杆乳酸杆乳酸杆乳酸杆菌菌菌菌进行活跃的进行活跃的进行活跃的进行活跃的同型乳酸发酵同型乳酸发酵同型乳酸发酵同型乳酸发酵，乳酸的积累量可达到，乳酸的积累量可达到，乳酸的积累量可达到，乳酸的积累量可达到0.6%0.6%0.6%0.6%0.8%0.8%0.8%0.8%；乳酸积累乳酸积累乳酸积累乳酸积累pHpHpHpH达达达达3.53.53.53.5 3.8.3.8.3.8.3.8.大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为到抑制。这一期为到抑制。这一期为到抑制。这一期为完全成熟阶段完全成熟阶段完全成熟阶段完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香，泡菜有酸味且清香，泡菜有酸味且清香，泡菜有酸味且清香品质最品质最品质最品质最好好好好。发酵产物发酵产物发酵产物发酵产物中中中中只有乳酸只有乳酸只有乳酸只有乳酸，称为同型乳酸发酵，称为同型乳酸发酵，称为同型乳酸发酵，称为同型乳酸发酵2 2、发酵中期、发酵中期特点特点:乳酸菌逐渐占据优势，其他发酵微生物受到抑制，乳酸积累乳酸菌逐渐占据优势，其他发酵微生物受到抑制，乳酸积累增多增多本讲稿第十七页，共三十页 在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继续增加，可达含量继续增加，可达含量继续增加，可达含量继续增加，可达1.0%1.0%1.0%1.0%以上。当以上。当以上。当以上。当乳酸积累乳酸积累乳酸积累乳酸积累达达达达1.21.21.21.2以上以上以上以上时，时，乳酸杆菌的活性受到抑制乳酸杆菌的活性受到抑制乳酸杆菌的活性受到抑制乳酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐，发酵速度逐，发酵速度逐，发酵速度逐渐变缓甚至停止。渐变缓甚至停止。渐变缓甚至停止。渐变缓甚至停止。3 3、发酵后期、发酵后期此阶段泡菜酸度过高、风味不协调。此阶段泡菜酸度过高、风味不协调。特点：乳酸含量过高，抑制乳酸菌活动，乳酸菌特点：乳酸含量过高，抑制乳酸菌活动，乳酸菌减少。减少。本讲稿第十八页，共三十页 泡菜制作中亚硝酸盐生成：泡菜制作中亚硝酸盐生成：发酵初期，泡菜中微生物生长很快，将蔬菜中硝酸发酵初期，泡菜中微生物生长很快，将蔬菜中硝酸盐还原成亚硝酸盐，蔬菜中酚类物质和维生素盐还原成亚硝酸盐，蔬菜中酚类物质和维生素C C等等将亚硝酸盐氧化，总体来说，生成的亚硝酸盐大于将亚硝酸盐氧化，总体来说，生成的亚硝酸盐大于被氧化的，亚硝酸盐的含量逐步上升。被氧化的，亚硝酸盐的含量逐步上升。微生物代谢活动将氧气消耗殆尽，泡菜坛中的微生物代谢活动将氧气消耗殆尽，泡菜坛中的环境不利于乳酸菌以外的其他微生物生长，生成的环境不利于乳酸菌以外的其他微生物生长，生成的亚硝酸盐减少。同时，蔬菜中硝酸盐含量由于被氧亚硝酸盐减少。同时，蔬菜中硝酸盐含量由于被氧化而减少，因此，亚硝酸盐的含量会逐渐下降并趋化而减少，因此，亚硝酸盐的含量会逐渐下降并趋于一个相对稳定的数值。于一个相对稳定的数值。本讲稿第十九页，共三十页本讲稿第二十页，共三十页五、亚硝酸盐含量的检测五、亚硝酸盐含量的检测(比色法）比色法）1 1、测定亚硝酸盐含量的原理、测定亚硝酸盐含量的原理 在在在在盐酸酸化条件下盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与，亚硝酸盐与，亚硝酸盐与，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸发发发发生生生生重氮化重氮化重氮化重氮化反应后，再与反应后，再与反应后，再与反应后，再与N-1N-1N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐结合结合生成生成玫瑰红玫瑰红玫瑰红玫瑰红溶液。溶液。溶液。溶液。将经过反应显色后的将经过反应显色后的将经过反应显色后的将经过反应显色后的泡菜待测样品泡菜待测样品泡菜待测样品泡菜待测样品与与与与标准液标准液比色比色比色比色，即可即可即可即可估算估算估算估算出样品中的亚硝酸盐含量。出样品中的亚硝酸盐含量。出样品中的亚硝酸盐含量。出样品中的亚硝酸盐含量。本讲稿第二十一页，共三十页2、材料与器具、材料与器具材料：泡菜材料：泡菜器具：榨汁机、移液管、容量瓶、比色管等器具：榨汁机、移液管、容量瓶、比色管等试剂：对氨基苯磺酸、试剂：对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺盐酸萘基乙二胺盐酸盐、盐酸、亚硝酸钠、氯化镉、氯化钡、蒸馏盐、盐酸、亚硝酸钠、氯化镉、氯化钡、蒸馏水、氢氧化钠、氢氧化铝。水、氢氧化钠、氢氧化铝。本讲稿第二十二页，共三十页3、步骤、步骤（1 1）配置溶液）配置溶液（2）配制标准液显色液配制标准液显色液（3）制备泡菜样品处理液制备泡菜样品处理液（4）比色）比色本讲稿第二十三页，共三十页（1 1）配置溶液）配置溶液对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液:配制成配制成配制成配制成(4mg/mL)(4mg/mL)溶液（对氨基苯磺酸溶液（对氨基苯磺酸溶液（对氨基苯磺酸溶液（对氨基苯磺酸0.4g0.4g体积分数体积分数体积分数体积分数2020的于盐酸的于盐酸的于盐酸的于盐酸100mL100mL）N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液：配制成萘基乙二胺盐酸盐溶液：配制成萘基乙二胺盐酸盐溶液：配制成萘基乙二胺盐酸盐溶液：配制成(2mg/mL)(2mg/mL)溶液（N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐溶萘基乙二胺盐酸盐溶萘基乙二胺盐酸盐溶萘基乙二胺盐酸盐溶0.2g0.2g100ml100ml蒸馏水）蒸馏水）蒸馏水）蒸馏水）亚硝酸钠溶液：配制成亚硝酸钠溶液：配制成亚硝酸钠溶液：配制成亚硝酸钠溶液：配制成(5ug/mL)(5ug/mL)(5ug/mL)(5ug/mL)溶液（亚硝酸钠溶液（亚硝酸钠溶液（亚硝酸钠溶液（亚硝酸钠0.1g0.1g0.1g0.1g溶液溶液溶液溶液500mL500mL500mL500mL蒸馏水中蒸馏水中蒸馏水中蒸馏水中转转转转5mL5mL于于于于200mL200mL的蒸馏水中。的蒸馏水中。的蒸馏水中。的蒸馏水中。提取剂：氯化镉提取剂：氯化镉提取剂：氯化镉提取剂：氯化镉5050克、氯化钡克、氯化钡克、氯化钡克、氯化钡5050克溶克溶克溶克溶1000mL1000mL蒸馏水中，盐酸调至蒸馏水中，盐酸调至蒸馏水中，盐酸调至蒸馏水中，盐酸调至pH=1pH=1。氢氧化铝乳液氢氧化铝乳液氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液:配制成配制成2.5mol/L本讲稿第二十四页，共三十页 （2 2）配制标准显色液配制标准显色液 用移液管吸取用移液管吸取用移液管吸取用移液管吸取0.20mL0.20mL0.20mL0.20mL、0.40mL0.40mL0.40mL0.40mL、0.60mL0.60mL0.60mL0.60mL、0.80mL0.80mL0.80mL0.80mL、1.00mL1.00mL1.00mL1.00mL、1.50mL1.50mL1.50mL1.50mL亚硝酸钠亚硝酸钠亚硝酸钠亚硝酸钠溶液溶液溶液溶液(相当于相当于相当于相当于1 1 1 1ugug，2ug2ug，3ug3ug，4ug4ug，5ug5ug和和和和7.5ug7.5ug亚硝酸钠亚硝酸钠亚硝酸钠亚硝酸钠)，分别置于，分别置于，分别置于，分别置于50mL50mL50mL50mL比色管比色管比色管比色管中，再取中，再取中，再取中，再取1 1 1 1支比色支比色支比色支比色管作为管作为管作为管作为空白对照空白对照空白对照空白对照。并分别加入并分别加入并分别加入并分别加入2mL2mL2mL2mL对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置，混匀，静置，混匀，静置，混匀，静置3 3 3 35 5 5 5分钟后；分钟后；分钟后；分钟后；再分别加入再分别加入再分别加入再分别加入1mL 1mL 1mL 1mL N-1N-1N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液萘基乙二胺盐酸盐溶液萘基乙二胺盐酸盐溶液萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至，加蒸馏水至，加蒸馏水至，加蒸馏水至50mL50mL50mL50mL，混匀；，混匀；，混匀；，混匀；观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（玫瑰红色玫瑰红色玫瑰红色玫瑰红色逐渐加深）。逐渐加深）。逐渐加深）。逐渐加深）。本讲稿第二十五页，共三十页本讲稿第二十六页，共三十页（3 3）制备样品）制备样品0.4kg0.4kg泡菜泡菜榨汁榨汁取汁取汁100mL蒸馏水蒸馏水200mL100提取剂提取剂摇床振荡摇床振荡1h 加加40mL氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 60mL蒸馏水蒸馏水过滤过滤60mL滤液滤液40mL氢氧氢氧化铝乳液。化铝乳液。泡菜泡菜 雪菜雪菜榨菜榨菜振荡振荡过滤过滤本讲稿第二十七页，共三十页（4）、比色）、比色样品即滤液样品即滤液40mL加入加入50mL比色管中比色管中显色反应显色反应：先加2mL对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸，后加1mL N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐,定容定容50mL比色比色：显色后与标准显色液对比，找出颜色最：显色后与标准显色液对比，找出颜色最相近的记录对应亚硝酸盐含量相近的记录对应亚硝酸盐含量本讲稿第二十八页，共三十页比色比色泡菜泡菜榨菜榨菜雪菜雪菜本讲稿第二十九页，共三十页果酒果酒果酒果酒果醋果醋果醋果醋腐乳腐乳腐乳腐乳泡菜泡菜泡菜泡菜微生物类型微生物类型微生物类型微生物类型原理原理原理原理反应条件反应条件反应条件反应条件检测方法检测方法检测方法检测方法酵母菌，真酵母菌，真菌，兼性厌菌，兼性厌氧氧醋酸菌，细醋酸菌，细菌，好氧菌菌，好氧菌毛霉，真菌，毛霉，真菌，好氧菌好氧菌乳酸菌，细菌，乳酸菌，细菌，厌氧菌厌氧菌酵母菌的无氧酵母菌的无氧呼吸产生酒精呼吸产生酒精1825 1825，无氧无氧重铬酸钾与其重铬酸钾与其反应呈灰绿色反应呈灰绿色醋酸菌的有氧醋酸菌的有氧呼吸产生醋酸呼吸产生醋酸30353035，通，通入氧气入氧气品尝、品尝、pHpH试试纸检测纸检测毛霉产生蛋毛霉产生蛋白酶和脂肪白酶和脂肪酶酶15151818接种，接种，酒精含量控制酒精含量控制在在1212左右左右乳酸菌无氧乳酸菌无氧呼吸产生乳呼吸产生乳酸酸常温，无氧条常温，无氧条件件pHpH检测，亚硝检测，亚硝酸盐的检测方酸盐的检测方法法本讲稿第三十页，共三十页