植物基因工程.docx

编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第15页 共15页第六章 植物基因工程课程基因工程原理与技术班级生物科学05生物技术05教师詹亚光范桂枝学期第二学期课时6学时上课日期课的类型理论授课章节第六章 植物基因工程（1）植物基因转化受体系统的条件（2）植物基因转化受体系统的类型和特性。（3）植物基因工程载体的种类和特性（4）根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能：T-DNA、Vir区操纵子的基因结构与功能。（5）农杆菌Ti质粒基因转化机理（6）农杆菌Ti质粒的改造及载体构建（7）载体构建中常用的选择标记及报告基因（8）根癌农杆菌的转化程序及操作原理（9）外源基因在植物中的表达教学目的和要求了解植物基因转化受体系统的类型、特性掌握Ti质粒的结构与功能，植物载体构建原理，植物基因工程常用的载体类型。教材分析重点根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的原理和方法难点植物载体构建原理关键点转基因植物的获取和检测主要教具和设备材料投影仪、电脑、常规教学设备 教法板书与多媒体授课相结合思考题1. 植物基因工程载体种类？2. 根癌农杆菌转化程序？心得 在自然界的许多双子叶植物中，常常发生一种严重危害植物生长的病害冠瘿。已知90多科，600多种双子叶植物都能感染这种病。一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。70年代中期，世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducing plasmid),且证实了肿瘤的形成正是由于pTi中的特定片段T-DNA转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果；由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达，因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。农杆菌将自身的DNA插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的，重要原因之一是因为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。植物自身不能利用这种物质，只能为它的合成付出代价，别的细菌也不能利用它，在自然条件下，只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶，将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。肿瘤的产生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激细胞生长而产生肿瘤，这是T-DNA转入的一个副产品。Ti质粒给自己设计出一套为其自身存活的非常优秀的进化格局：它感染植物细胞，使之出现愈伤组织增生，后者便产生出供带有Ti质粒的细菌用作能源、碳源和氮源的冠瘿碱；而冠瘿碱的产生又可激发Ti质粒转移到原先没有存在这种质粒的土壤农杆菌中去，如此周而复始得到不断发展。Ti质粒是一类理想的植物基因工程载体，通过它们可以将外源DNA转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物。Ti质粒还具有若干其他载体所不具备的优点：（1）T-DNA能够进行高频的转移，而且这种转移的DNA通常是以未发生变化的完整形式整合到植物的核基因组上。（2）Ti质粒不存在包装限制问题，大到50kb的外源DNA也能顺利地包装与转移。一、植物基因工程载体种类据载体的功能和构建过程，可把有关载体分为四大类型（九种载体）。克隆载体、中间载体、卸甲载体、转化载体据载体的功能和构建过程，可把有关载体分为四大类型，九种载体。1、克隆载体（目的基因的克隆载体）通常由多拷贝的E.coli小质粒为载体功能：保存和克隆目的基因。2、中间载体又分为中间克隆载体和中间表达载体。 中间克隆载体：由大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。功能：构建中间表达载体的基础。分为：中间粘粒载体、质粒粘粒愈合载体、基因标记载体。 中间表达载体：含有植物特异启动子的中间载体功能：作为构建转化载体的质粒。3、卸甲载体解除武装的Ti质粒或Ri质粒。（onc+ - onc-）功能：作为转化载体的受体质粒4、转化载体最后用于目的基因导入植物细胞的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。分为一元载体系统（顺式载体）和双元转化载体系统（反式载体）。一元载体系统包括共整合载体和拼接末端载体（SEV）。二、根癌农杆菌Ti质粒1、Ti质粒的类型、结构与功能（1）类型Ti质粒是根癌农杆菌染色体以外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，分子量为95156 x 106D，约150 200 Kb长。根据其诱导的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可分为三类：章鱼碱型（octopine）：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162胭脂碱型（nopaline）：pTiT37, pTiT38, pTiC58农杆碱型（agropine）和农杆碱素型（agrocinopine）或琥珀碱型（succinamopine）（2）结构和功能各种Ti质粒都可分为四个区：T-DNA区（transferred-DNA regions）：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。Vir区（Virulence region）：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的1/3。Con区（region of replication）：质粒结合转移位点编码区，该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此，称之为接合转移编码区。Ori区（origin of replication）：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，称之为复制起始区。3种成分与Ti质粒肿瘤诱导有关:T-DNA：它可转移至宿主细胞，是一种可移动因子。毒性区：vir基因可产生转移活动蛋白，对增强植物细胞的转化是必须的。土壤农癌杆菌染色体基因:间接参与转化，负责将细菌细胞接合于植物上。2、T-DNA的基因结构和功能（1）T-DNA的结构特点长约23Kb在T-DNA的5和3端都有真核表达信号，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。 T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列，分别称之为左边界（BL或TL）和右边界（BR或TR）。该25bp边界序列属保守序列（TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC）。通常右边界序列更为保守，左边界在某些情况下有所变化。左边界的缺失突变仍能致瘤，但右边界缺失则不致瘤，这时几乎完全没有T-DNA的转移，这说明右边界在T-DNA的转移中的重要性。胭脂碱型肿瘤，为一连续的一段序列，长约23.4Kb，有肿瘤系，仅一个拷贝，有的T-DNA是多拷贝的。章鱼碱型肿瘤：T-DNA分左右两部分（TL-DNA和TR-DNA），各自带有左右边界序列。左区的顺序变化不大，长度约13Kb，通常一个拷贝，但也有几个拷贝首尾相连排列。含章鱼碱合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA较短，长约6-7Kb，拷贝数达数个 或数十个，有的肿瘤系中没有TR-DNA。TR-DNA编码5个基因，如甘露碱和冠瘿碱合成酶基因。（2）T-DNA上的编码基因及功能 章鱼碱型和胭脂碱型T-DNA的转录有下述共同特点：T-DNA的两条链都是有意义链；T-DNA上每个基因都有各自的启动子；基因的转录由植物细胞RNA聚合酶II完成；T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，在其5端转录起始处有TATA和CAAT盒。另外，至少在5个T-DNA基因中发现有一个8bp的相同顺序（TTTCAA GA），同时AATAAA加尾信号也在同一条链上发现。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。3、Vir区操纵子的基因结构与功能毒性区的大多数基因产物都控制T-DNA的转移，这个区域的突变往往导致农杆菌感染植物能力的下降。（1）Vir区操纵子的基因结构章鱼碱型Ti质粒：Vir区大小为40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H（PinF）等8个操纵子，共24个基因。大多数操纵子含有多个基因VirA（1）、VirB（11）、VirC（2）、VirD（4）VirE（2）、VirF（1）、VirH（2）。胭脂碱型Ti：有7个操纵子，少一个VirF，它们的第一个操纵子也不同，章鱼碱型Ti是VirH，而胭脂碱型Ti是Tzs，其功能也不同。Vir区基因的表达有两种方式：组成型表达；在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平，virA，virG、virH诱导型表达：这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物时，在植物受伤组织分泌的信号分子作用下才能启动表达，如virB、C、D、EvirG虽属于组成型表达，但有植物信号分子存在下表达量提高10倍，也具诱导表达特性。（2）Vir区操纵子的基因的功能Vir A 单个基因，2.4kb，仅编码一条多肽。Vir A编码一种结合在膜上的化学受体蛋白（92KD），可直接对植物产生的酚类化合物感应，是一种感应蛋白。Vir A的活化：当AS与Vir A的受体部分结合后，会使整个Vir A蛋白构象发生变化，其C端活化。Vir A蛋白的胞质区有自激酶的功能，可在保守的组氨酸残基上磷酸化，从而Vir A蛋白被激活。激活后的Vir A具有转移其磷酸基至Vir G蛋白的一个宿存的天冬氨酸残基的能力，使Vir G蛋白激活。Vir G Vir G ，只有1Kb，单基因，编码DNA结合蛋白,其C端有DNA结合活性，N端具有磷酸化的酸性结构。从总体效应讲，Vir G基因是属于组成型表达的，这对于细菌迅速地将外部环境信号传递到细胞内十分有利。当磷酸化的A蛋白将其磷酸基转到Vir G保守的天冬氨酸残基上时，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二体或多体形式结合到Vir启动子的特定区，从而成为其它Vir 基因转录的激活因 子，打开Vir B、C、D、E、H等几个基因。Vir A或G突变后会减弱或完全失去对其他Vir 位点活化的诱导，VirA及 Vir G 的这种调控作用被称为双因子调控体系。ÂVir H、Vir F及Tzs这些基因对质粒是特异的，在章鱼碱型中有Vir F、Vir H，在胭脂碱型中有Tzs。 Vir H：对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒作用，从而使自身生不受抑制，可增强致瘤能力。Vir F：编码一个23KD蛋白，通过Vir 系统传递到植物细胞中，对T-DNA起运输作用。Tzs：大部分胭脂碱型菌株的Ti质粒上均有Tzs基因，转运玉米素合成酶基因，在细菌中表达后将玉米素分泌到细胞外。该细胞分裂素被植物吸收后，能促进农杆菌感染部位的植物组织脱分化和细胞分裂，提高植物对农杆菌转化的感受性。三、农杆菌Ti质粒基因转化机理1. T-DNA的加工及转移首先在下链25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间剪切，从缺口的3端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22bp处。置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。VirD蛋白的功能：VirD1及 VirD2分别编码16KD和47KD蛋白，与T-DNA的加工有关，决定在边界重复序列的特定位点上形成切口，产生T链断裂。 VirD2蛋白的功能：特异剪切，并与T链的5端共价结合。导向功能；2.T链蛋白复合体的形成及VirE的功能T链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜才能整合进植物基因组。T链以一种DNA-蛋白复合体（T复合体）的形式存在。目前已知至少两种Vir特异蛋白即VirE2和VirD2与T链蛋白复合体的形成有关。VirE2的功能：编码ssDNA结合蛋白，该蛋白可非特异地一与任何ssDNA结合，通过与T链非共价结合，VirE2可包被T链形成细长的核-蛋白丝，使ssDNA抗3和5外切核酸酶和内切核酸酶。3、T链复合体通过细菌细胞膜的转运及VirB的功能（1）VirB的功能VirB启动子有11个基因，大多数编码跨膜蛋白或膜结合蛋白，能在膜上形成一种类似细菌接合转移时从供体菌转至受体菌所必须的结构接合孔或性毛。T-DNA通过这种孔由细菌进入植物细胞。同时，VirB也可能起运输和提供能量的作用。按功能，可将VirB蛋白分成五类：R：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T复合体的受体；A：此类蛋白可能作为能源，作为一种ATP酶促进T复合体被泵出细菌细胞，VirB11可能是这种A类蛋白。C：形成通道的作用，如：VirB4是一种富集蛋白，无疏水区，无信号肽，可能在T链转运中起一种结构作用，形成至少一部分特殊的通道结构。S：载体蛋白，起运载T 复合体穿过通道的作用，这类蛋白可能与所有膜成分（内膜、外膜及周膜）有关。P：位于外膜上，可能作为结合植物细胞膜的一种受体。（2）T复合体向植物细胞核的转运VirD2可能以一种极性方向，将T复合体定向至核孔，而VirE2则作为一种促进因子，保证很长的T复合体在进入核孔时不受干扰。在T-DNA转移过程中，VirD2具有火车头的作用，牵制T复合体以5端到3端的方向向核迁移，而VirE2则只助推器的角色，帮助未折叠的长形T复合物不被打断，并方便其向核运动。已知VirE2-ssDNA可以抗拒内切酶的作用，如核酸外切酶VII对VirE2-ssDNA降解能力将相当于对ssDNA的6%，对S1核酸酶的效果也相似。4、细菌染色体上与T-DNA转移有关的基因目前已知农杆菌染色体上有10个基因与T-DNA转移有关，它们主要涉及细菌与植物细胞的接触和细菌向植物伤口的趋化性。chvE编码一个葡萄糖和半乳糖结合蛋白，主要结合组成植物细胞壁的单糖；可能由于识别植物受伤产生的糖单体，导致细菌向植物伤口的趋化性；在低pH值、磷酸饥饿条件下启动VirG表达。chvD编码一种细菌ATP结合蛋白，在低pH值、磷酸饥饿条件下诱导VirG蛋白含量升高，然后VirA接受AS信号，刺激VirG转化成活性形式，启动其他VirG 基因表达。chvA 、chvB、 chvC与环状a-1，2-葡聚糖的合成和运输有关； chvB产物催化合成葡聚糖， chvA产物将多糖从胞质运到胞外，影响农杆菌对植物细胞的附着能力。pscA和Exoc与多糖的合成有关，并影响农杆菌对植物细胞的附着能力。四、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建1、野生型Ti质粒直接作为基因工程载体的障碍：（1）分子量大，160240Kb；（2）有各种限制性内切酶的多个切点；（3）T-DNA区中含有许多编码基因与基因转移无关，如致瘤基因，其存在还会导致植物体丧失形态发生能力；（4）Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。2、Ti质粒构建的几个重要因素（1）右边界序列；（2）完整的Vir基因群；（3）有独特的酶切点；（4）有在植物中可表达的选择性基因；（5）有在细菌中可表达的选择性基因；（6）章鱼碱型农杆菌品系需要独特的增强子。3、载体构建先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒中，并插入外源基因，最后通过三亲交配或接合转移把外源基因引入农杆菌Ti质粒上。Ti质粒的载体系统分两类：一元载体和双元载体例：双元载体的构建双元载体系统由两个分别含T-DNA和Vir区的相容质粒构成。（1）构建原理Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的转移，T-DNA和Vir区处于不同的Ti质粒上同样能起到转移T-DNA的作用。双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起点（oriv），从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区，它们能在任何农杆菌寄主里自发复制。所以寄主仅需一套完整的vir质粒就可。主要的转移区载在小重组Ti质粒上。（2）微型Ti质粒（mini-Ti plasmid）含有T-DNA边界，缺失Vir基因的质粒；含广谱质粒的复制位点OriV及选择标记基因。（3）辅助质粒含Vir区段的Ti质粒，helper Ti,是T-DNA缺失的突变型Ti（卸甲Ti），提供Vir基因功能，反式激活T-DNA的转移。LBA4404中含有pAL4404(pTiAch5的衍生质粒)，野生型Ti也可做Helper Ti,有更强的毒性。五、根癌农杆菌侵染植物细胞的机理1、根癌农杆菌的生物学特性分类农杆菌属，也称土壤杆菌属和根瘤菌属，是同属于根瘤科的革兰氏阴性菌。 土壤杆菌属有4 个种：根癌农杆菌、放射形农杆菌、毛根农杆菌和悬钩子农杆菌。 根癌农杆菌，根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类不同可分为三种类型即章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型。 生活习性土壤杆菌属都是土壤习居菌，主要生活在曾被多种植物生活过的土壤中，好氧，但也能在低氧压的植物组织中生长，最适温2530，pH4.012.0,最适pH6.09.0。形态结构农杆菌细胞呈杆形，0.8x1.53.0m,以14根周生鞭毛运动，不形成芽孢，菌落无色，随菌龄增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多菌株生成的菌落呈粗糙型。寄主范围根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，根据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。裸子植物对该菌同样具敏感性，能诱发肿瘤，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。2、根癌农杆菌侵染的诱导信号及作用机理（1）酚类化合物酚类物质农杆菌浸染植物细胞所必需的诱导物，同时将其作为趋化物来识别。实验证明，一些植物中常见的酚类化合物的混合物都可激活Vir区基因。如：儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、-羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草醛。Stachel等在烟草叶片的伤口诱出液中确认了两种主要的Vir区基因诱导物：乙酰丁香酮AS和羟基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.51.0mol/L即可诱导Vir活化。（2）中性糖和酸性糖中性糖在Vir基因诱导和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS诱导条件下，发现许多中性糖（L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、2-脱氧-D-葡萄糖）都可增强一些Vir区基因的诱导。这些中性糖是通过chvE和VirA起作用，chvE编码葡萄糖和半乳糖结合蛋白，识别伤口产生的糖单体，导致农杆菌的趋化作用。酸性多糖是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分。最近的实验证明，酸性糖（胡萝卜根提取物中蒸馏出来）可改变农杆菌基因的表达。蛋白质标记实验表明，至少有10种蛋白质合成被其诱导，一种被阻遏。（3）pH值5.05.5的低pH值。诱导物对pH的要求是<.6.0, 在农杆菌培养在含有酚类化合物（AS）的培养基中时，pH5.0 5.8Vir的诱导达到一个最高水平3、根癌农杆菌的侵染能力及其特异性（1）常用的根癌农杆菌胭脂碱型（Nop）菌株：染色体背景为C58，生长快，不结球，转化中容易操作，常用的菌株有C58、pGV3850、A208SE等。章鱼碱型（Oct）菌株：染色体背景为Ach5，生长慢，结球，转化中难操作，培养后不易洗掉，常用的菌株有LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61等。农杆碱型（Agr）菌株，也称琥珀碱型（Suc）：染色体背景为A281或A136，具有胭脂碱型菌株的特点，以A136为染色体背景的常用菌株是EHA101，生长快，不结球，侵染能力强，常用的菌株有A281、EHA101、EHA105等。（2）、根癌农杆菌的侵染能力差异根据侵染能力大小将农杆菌分为：广宿主菌株：大多数双子叶、若干裸子植物、少量单子叶植物；如：pTiB0542、pTiA6；窄宿主菌株：有限的几种植物上诱发肿瘤，如pTiAg162,仅能在葡萄的几个品种上诱发肿瘤。不同植物对农杆菌侵染的敏感性不同，在转化中，二者的选配十分重要，要选农杆菌与植物之间有高侵染力的配合。如：杨树茎，用C58优于LBA4404；苹果，6种基因型比较，叶：EHA101（pEHA101）优于LBA4404，C58；茎：A281优于C58，ACH5，A348。农杆菌的染色体背景对宿主范围同样有着重要作用。因为除Vir区功能外，农杆菌对植物表面识别与结合有关的功能还取决于农杆菌染色体上基因位点。农杆菌所展示出不同的生长速率、多糖产生和对植物细胞的毒力都会影响转化率和宿主范围。六、根癌农杆菌转化程序及操作原理1、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序（1） 选择适宜的培养基，使创伤部位能产生尽可能多的再生植株。（2） 确定供体植物最适的培养条件。（3） 确定最佳外植体类型、大小、部位等：再生途径，愈伤组织起源（细胞类型、层次），保证转化愈伤组织和芽原基由创伤部位的浅层细胞发育而来。（4） 确定适宜的抗生素水平：抑菌抗生素Cef ，Cb ，能抑制细菌生长，还能保证愈伤组织正常生长和分化。（5） 确定选择压力的最低水平。（6） 优化农杆菌接种和共培养条件改进筛选条件，促进抗性细胞恢复再生能力：采用无毒的生化物质。2、根癌农杆菌的培养、纯化、保存及工程菌液的制备（1）农杆菌的培养 常用的农杆菌培养基有 LB、 YEM、 YEB、 TY、 523、PA及 MinA等培养基。 这些培养基中，LB、YEB、YEM及523属富集培养基，其营养成分丰富，包括有各种有机成分。在这些培养基中农杆菌生长快，分裂旺盛，它们是常用 制备工程菌液的培养基。 PA和 TY培养基是属营养较好的培养基，氨基酸及碳源、氮源都很丰富。农杆菌在这些培养基上生长也很快，是常用的农杆菌选择培养时的培养基。 MinA培养基与前几种培养基有明显差异：只提供必要的无机盐，并用葡萄糖和（NH4）2SO4 提供碳源和氮源。 Minimal只用相应的冠瘿碱如 NOpaline、 Octopine等取代蔗糖、氨基酸和无机氮作为农杆菌的碳源和氮源。 农杆菌在MinA和Minimal培养基上生长较慢。在进行三亲杂交时通常用这两种培养基，并加相应的抗生素选择转化的农杆菌。含重组质粒的大肠杆菌及含辅助质粒 pRK20 13的HB101因不能利用冠瘿碱作为碳源和氮源而不能生长，同时还存在抗生素的选择，因此有利于选择转化的农杆菌的生长。农杆菌的生长周期l 农杆菌培养方式：分为固体平板培养和液体振荡培养，l 固体培养一般需23d，液体培养生长更快，一般需12d。l 农杆菌接种在培养液后，并不立即开始增殖。一般在2530时，需12 h细菌才开始分裂。l 当生长开始后，细菌数目以一恒定的指数速率倍增，直至培养基成分改变和供氧缺乏时才停止增殖。当细菌增长速率达到对数指数时称之为对数生长状态。l 当细菌密度达到 177ml时，空气中的氧气便难以很快地扩散到细胞内。在振荡或通气条件下培养，细菌浓度也很少超过 23 X 109ml。l 测定农杆菌浓度的方法：最简单的方法是光密度测定法。将菌液装入比色杯汽在分光光度计上选用600nm波长测定其OD值。光密度与浓度换算公式是1OD约等于 8 X 108ml。（2）工程菌的纯化纯化菌种的方法主要采用常规的微生物纯化方法，即划线法。用接种针划线，然后用石蜡膜封口，将平皿倒置放恒温箱内，在2528条件下培养过夜，次日或即日看到分离的单菌落。挑取单菌落接种在液体培养基内进行液体振荡培养。（3）工程菌侵染悬浮液的制备 液体振荡培养的工程菌，通常培养 1224 h后即可达到对数生长期。用离心管取一定数量的菌液进行4000rmin离心，倒掉上清液，再加入植物外值体诱导愈伤组织或分芽的液体培养基，使其光密度OD值达到05，即可用作接种外植体的工程菌液。 注意：因为农杆菌培养基中通常含有抗生素，它对外植体的生长、脱分化或分化有不良影响，放需通过离心除去细菌培养基，加入植物培养基。也有的做法是，将农杆菌加入植物培养基后再振荡培养 12 h，当细菌生长达到对数生长期后再离心，倒掉上清液，用新的植物液体培养基稀释至一定OD值，再作为工程菌液使用。 （4）工程菌的保存菌种的保存的目的是创造一个适合细菌休眠的环境（低温、干燥、缺氧），使其得以长期保存。其功能在于尽量减少菌株的传代次数；使菌种经保存后不死亡、不污染杂菌，并保持其原有性状，降低菌种的变异率；最终目的是的基因不能丢失。菌种保存的方法根据其保存时间长短可分为三种方法：短期保存数月）：采用斜面或平板保存法。斜面菌种置于4可保存数月，平板用石蜡膜密封后也可在低温04下放置数月。中长期保存（数年）：中长期保存采用穿刺法，这是一种菌种接入柱状培养基的方法。经常应用的是半固体柱状培养基，用接种针沾取少量问后直接插入柱状培养基中。需注意的是，要从培养基中间插入，直插到接近管底，但不要穿透培养基，再慢慢按原途径拔出接种针，切勿搅动，以免使接种线不整齐而影响观察，甚至会因用力搅动造成空隙太大进入空气，而影响保存效果。穿刺培养的菌种用蜡封口，在室温下可保存数年。长期保存菌种：主要采用甘油保存法。在7二甲基亚（DMSO）或 15甘油中，菌种可于- 70冰箱或液氮中长期保存。当甘油含量增加40 50%时，细菌可在- 20或- 70条件下，保存若干年而不失活。将冰冻菌种从冰柜中取出时，应当放在冰浴上慢慢融化，不可直接将其放室温下，否则会导致菌体失活，更不能直接接种至液体培养基内28振荡培养。3、Vir基因活化诱导物的使用（1）诱导物：常用诱导物是乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OHAS），其中效果优是AS。但最近又有新的发现，有两种特殊化合物比AS的诱导活性高10100倍。（2）诱导物的使用方法在农杆菌液体培养时加 AS，加入时间般在制备工程菌浸染液使用前46 h加入。使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因高度活化状态，从而提高侵染能力。也有的在农杆菌悬浮液离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入。AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基中。共培养的过程是Ti质粒实现 T-DNA转化时期。一般农杆菌附着 16 h后才能进行转化，这时需要vir基因的高度活化。因此，许多科学家赞成这种使用方法。在农杆菌液体培养基中及共培养基中都加入AS。这种方法似乎最牢靠，只不过是使用的AS诱导剂太多了。（3）诱导物使用的pH值pH值对vir区的活化有着明显的影响，从理论上讲含AS的培养基pH值为5056时， Vir区基因的诱导达到最高水平。 pH值改变 03，即对多种植物的转化率有明显影响。章鱼碱型和农杆碱型菌系比胭脂碱型和琥珀碱型需要更低的pH值。通常农杆菌培养时pH值为72。这种生长旺盛的菌株的vir基因均处于不活化状态。而组织培养基中的pH值常为58，有利于vir基因的活化。在vir基因活化诱导中应调整培养基的pH值。4、外植体的选择Mayer等指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内，可能只有处于细胞分裂周期的S期才具有外源基因的转化能力，因为核基因组DNA正在复制时才能使外源DNA整合。因此细胞具有分裂能力是转化的基本条件。（1）外植体的种类叶片、叶柄、子叶、子叶柄、下胚轴、茎、花茎、匍匐茎、块；茎尖分生组织、芽、根、合子胚或体细胞胚，以至成熟的种子等都可作为外植体转化。但各种外植体材料的转化率有明显差异。贾士荣等（1992）对不同外植体转化成功的例进行分析统计结果表明，叶片（叶柄）、子叶（子叶柄）、胚轴、茎等外值体转化成功的事例最多，它们分别占 35、 9。 10和 17。但是，不同植物的最佳外植体种类不同，要根据具体植物进行选择。（2）转化外植体的选择原则以叶片、子叶、胚轴为首选外植体材料。选择幼年的外植体，同时要考虑其最佳感受态。转化外植体易于组织培养，并有较强的再生能力。应考虑感受态细胞在外植体的部位。一些复杂器官的外植体如胚轴、茎段、子叶、幼叶等，其性质未定细胞的部位及数量分布是不同的，如叶尖部分生细胞少，叶基分生细胞多，子叶基部有大量的分生细胞，胚轴的极端也有大量的分生细胞，有的外植体的分生细胞埋藏于深层，尽管这些细胞具有强的再生能力，但是农杆菌难以深入到附着于这些细胞壁上实现转化。5、外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养（1）外植体的预培养预培养的作用：（1）促进细胞分裂，分裂状态的细胞更容易整合外源DNA因而提高外源基因的瞬时表达和转化率。（2）田间取材的外植体通过预培养起到驯化作用，使外植体适应于试管离体培养条件，并保持活跃的生长代谢状态。（3）减少外植体转化过程中的杂菌污染率；如果外植体上带污染源时，在预培养被筛选掉。 （4）有利于侵染接种的外植体能与培养基平整接触。因为外植体在开始培养过程中，由于其迅速生长而出现上翘或卷曲，使农杆菌的接种切面离开培养基致使农杆菌不能生长实现转化。外植体的预培养时间：每一种外植体均有其最佳预培养时间。预培养时间太长降低外植体的转化率，甚至农杆菌侵染后外植体死亡。一般以23 d为直，例如矮牵牛、番茄、拟南芥菜叶片转化均需2d预培养。否需要预培养，预培养多长时间，要根据不同植物、不同外植体而确定。（2）外植体的农杆菌接种外植体接种就是把工程菌接种到外植体的损伤切面。方法是将切割成小块的外植体浸泡在制备好的工程菌液中，浸泡一定时间后，尚需用无激素植物培养基或无菌水漂洗，再用无菌吸水纸吸干。但目前外值体用菌液浸泡后常不经漂洗，直接放在无菌吸水纸上吸干外植体非伤口面的菌液，即可进行共培养。在接种过程中应注意以下几点：掌握外植体在菌液中浸泡的时间：有助于减少后继培养中可能造成的污染，并可减轻细菌对植物细胞的毒害作用，一般控制在数秒钟至数分钟内，以叶盘边缘充分湿润为度。浸泡时间太短农杆菌尚未接种到伤口面，在其培养时无农杆菌生长，不能转化。如果外植体在菌液中浸泡时间太长，常因农杆菌毒害缺氧而软腐，一般不要超过30mln。菌液浓度：对不同植物的外植体而言有一定差异，一般浓度范围是 OD600=00507之间。对农杆菌敏感的植物，因其易产生过敏反应而导致外植体切口处褐化，故常采用较低的OD值和较短的浸泡时间。浸泡后的外植体在滤纸上吸干要适度，如果暴露时间太长造成外植体失水萎回；吸得太干在共培养时切口面无农杆菌生长。因此要明确滤纸吸干的原则是除去过量的菌体。（3）农杆菌与外植体共培养接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽分化的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养过程称之共培养。最佳共培养的时间： 农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把TDNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间必须长于 16h。共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡。共培养时间对转化率有着很大影响，而且不同物种、外植体种类、农杆菌菌株的最佳共培养时间不同。 确定最佳共培养时间的方法主要采用gus基因瞬时表达测定法，即共培养后定时测定外植体的gus基因颜色反应，统计瞬时表达率及表达面积，以表达率高，表达面积大为优。同时还要考虑外植体的受损害程度，以保证外植体的旺盛生长为直。最后还要以获得的转化愈伤组织频率或转化不定芽频率为最终依据。Á农杆菌的增殖适度在共培养时农杆菌增殖生长不良，外植体切口边缘只有很少的农杆菌生长，则转化的机率很小。反之，农杆菌在外值体四周过度增殖，可引起对外植体的毒害，致使其褐化死亡。控制农杆菌增殖适度的原则是既要使菌株在外植体边缘特别是切口面旺盛增殖生长，又不应过度，一般以覆盖切口面为适度。控制农杆菌增殖的方法有以下几种： 1）调整工程菌液的浓度，生长太快则应降低菌液浓度。 2）控制共培养时间，农杆菌的增殖生长适度也是确定共培养最佳时间的指标，共培养时间太长可造成农杆菌过度生长。 3）使用抗生素调控农杆菌的增殖生长。一种方法是在共培养基中加入适量的抗生素如羧苄青霉素或头孢霉素。另一种方法是共培养23d后的外植体需用含抗生素的液体共培养基充分洗涤，以除去过量的农杆菌，然后转到新鲜的共培养基上继续共培养。共培养结束时若仍存在农杆菌过度增殖，则可再用上述洗涤培养基充分洗涤后进行愈伤组织诱导或不定芽分化培养 。 共培养中激素的影响共培养时培养基中是否加激素，文献报道不一，有的不加激素，有的则认为加激素后促进外植体细胞分裂，保持细胞活力，也有利于转化后细胞的生长，从而提高转化率。如 Mansur等（1993）用 A281菌株与花生叶片外植体共培养时，加激素比不加激素的肿瘤诱导率提高约 30。 目前大多数研究者采用加激素的方法，而且共培养基与愈伤组织诱导或不定芽诱导培养基相同。（4）外植体脱菌及选择培养外植体的脱菌培养脱菌培养，即把共培养外植体转移到含有抗生素的培养基上。常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素（Carb）、 头孢霉素（Cef） 等。这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑菌作用，而且对植物细胞同样有一定的生物效但对不同植物的不同外植体产生的影响不同。 Holford 等（1 992 ）指出，Carb 的分解物为生长素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈伤组织的增殖。Howe 等（ 1994 ）观察到对杨树的愈伤组织诱导有抑制作用。在甘蓝研究中发现，Carb 抑制根分化，Cef 抑制芽分化，因此芽分化阶段需用Carb， 生根阶段则用Cef。抗生素的使用浓度一般为500mgL 左右。其使用原则是在达到抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓度。 脱菌培养的时间：脱菌培养的时间，一般需56次继代培养，但仍然不能把残留的农杆菌杀死，特别是共生在维管束和细胞间隙中的农杆菌。如果停止使用抗生素后的外植体又有农杆菌可再使用抗生素脱菌。也有的植物一直使用抗生素，直到试管苗形成。 （5）转化体的选择培养n 选择压： 选择抗生素如 Km，加入选择培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，称之为选择压。加入的抗生素浓度愈大，选择压也愈大。选择培养基中抗生素的浓度，即选择压的强度，也要根据植物的特性而定，较敏感的植物要用较低的 Km浓度。一般浓度范围是 Km 50 100mgL， hpt 1020mgL， ppt 520mgL。n 选择的方法：前期选择、延迟选择和后期选择。前期选择：就是外植体共培养后，在转入愈伤组织或不定芽诱导的一开始就加入选择压，相当于前面讲到的先选择后再生。延迟选择：当愈伤组织和不定芽诱导培养时开始不加选择压，过一周或一定时间后再加入选择压，这样既有利于转化细胞生长又不会产生更多的嵌合体后期选择：即相当于前面说的先再生后选择，有利于提高转化率。选择培养过程中转化和再生细胞的一致性在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是否一致，关系到能否得到真正的转化，只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有可能分化成转基因植株。因此再生部位和可被转化的细胞部位应该发源一致，反之得到的可能是假转化体。假转化体在继代选择培养基上生长不良而死亡，或