黄连内生真菌分离培养条件筛选.doc

,黄连内生真菌分离培养条件筛选摘要：本试验采用压贴法通过对黄连根、茎、叶在不同次氯酸钠浓度及不同表面消毒时间的PDA培养基上的培养，选出黄连内生真菌的适宜培养条件；在获得适宜培养条件后重新培养所有部位，待其长菌后挑选菌落边缘菌丝再培养，如此反复，直到获得纯培养物为止。通过培养筛选在主根、须根、叶柄、叶片四个部位共获得了60多种菌株，并对分离出的菌株进行保种，为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。关键词：黄连，内生真菌，分离条件，培养条件Endophytic fungi of Coptis separation and culture conditions screeningAbstract: The test select the suitable cultivation condition of endophytic fungi ,using pressure stick method cultivate roots, stems and leaves on PDA medium at different concentrations of sodium hypochlorite and different surface sterilization time.Recultivate all parts after acquising suitable cultivation,then select ege colonies and recultivate when they grow fungi,then circulate the procedure,until get pure culture.By cultivating and selecting the roots,fibrous roots,petiole and leaves, more than 60 kinds of fungi are found ,and isolated strains are breed,which is preparation for subsequent strains of identification, the determination of strains antimicrobial activity.Keywords: Coptis, Endophytic fungi, Separation conditions, Culture conditions黄连（Coptis chinensis Franch）是我国名贵中药材之一，含有大量的异喹啉类生物碱1（小蘖碱、黄连碱、甲基黄连碱、小蘖红碱、药根碱、阿魏酸等）。尤其是小蘖碱对人体病原细菌和皮肤真菌2具有广谱的抗菌活性，在医药中被广泛应用；同样，小蘖碱对许多植物病原真菌和细菌也有显著的抑制作用。Hirano, H.等用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦条纹花叶病毒病（BBMV）的发生3。黄连的药理研究主要以小蘖碱和黄连解毒汤为重点，主要包括抗微生物作用（抗菌、抗病毒）4、镇静作用、止泻作用、健胃作用5、对心脏心率6和心律作用等7。黄连及复方临床应用常用于治疗痢疾、急性肠胃炎、慢性腹泻、呼吸道感染、白喉、百日咳、结核性胞膜炎、萎缩性鼻炎、流行性结膜炎、化脓性中耳炎、口疮、牙周炎、萎缩性胃炎、胃炎、胃及十二指肠溃疡、慢性胆囊炎等，近年来还研究发现黄莲具有较强的抗癌和降血糖功效。黄连药效作用广泛，历来为医家常用药材，而无节制的开放，野生资源已经枯竭，黄连栽培条件苛刻，生长周期长，难以满足医药生产的需要8。因此迫切需要寻找开发新的资源。大量的研究发现9, 10，内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物，是新化合物、新药物的潜在资源。开发和利用植物内生真菌在保护植物物种资源、探索新的产物和新的活性以及提高活性成分的生产效率等方面都具有重要的价值。从目前已经研究过的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，因此可以推断出内生真菌在植物内是普遍存在的。内生真菌-植物共生体11能产生多种次生代谢产物，用来抵御自然界的虫害，吸引有益微生物和传粉者，竞争阳光和营养等。内生真菌在植物体与外界环境的交流中发挥着重要的作用，为了增加对病原微生物的抵抗，他们产生新的抗菌素12，这些抗菌素具有环保，高效的特征，是新抗菌素的主要来源，也是生物控制的一个重要手段。将有益的内生真菌接种于药用植物无菌苗的体内，能够缩短组织培养周期，对植株的生长发育和生理代谢进行综合调节，促进宿主药用植物活性成分的合成和积累，提高有效成分的含量。此外，还可以将有益的内生真菌进行合理的优化组合，获得相应的“内生真菌集群”13。目前，国内外未见对黄连内生真菌研究的报道，故笔者预研究我国黄连主产区重庆石柱的黄连的内生真菌分离培养条件及菌株保存，为寻找含有与黄连相似或相同化合物的菌株打下基础。1 材料与方法1.1 试验材料新鲜无可见病斑的石柱黄连（C. chinensis Franch）的主根、须根、叶柄、叶片。1.2 试验试剂青霉素；硫酸链霉素；75%乙醇；次氯酸钠溶液（9%、4.5%、2.25%）（浓度以有效氯含量计）；1.3 培养基的配置PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂；不同浓度PDA双抗培养基：以马铃薯20%、葡萄糖2%为基础，分别稀释为12.5%、25%、50%、75%、100%后，再加入琼脂2%，灭菌后稍加冷却，然后加入120ug/mL青霉素和100ug/mL硫黄霉素。1.4 仪器设备托盘天平、烧杯、量筒、剪刀、培养皿、注射器、酒精灯、镊子电热蒸馏水器：WS2-226-77 HSZ11-5型，北京长安科学仪器厂电子万用炉：220VAC 1000W 天津泰斯特仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9108A型，上海精宏试验设备有限公司立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40SAI型，上海申安医疗器械厂超净工作台：SW-CJ-2F，苏净集团安泰公司制造电热恒温培养箱：DNP-9082，上海三发科学仪器有限公司光照培养箱：MGC-250，上海一恒公司1.4 试验方法1.4.1 表面灭菌方法筛选自来水将整株黄连彻底冲洗干净晾干后，分别取下主根、须根、叶柄、叶片，切割成较大的块，再按下面的方法对试验组及对照组进行处理：CK1：无菌操作的全过程中将5皿打开盖子的PDA的培养皿放于超净工作台。在试验组处理完后以相同方式培养。CK2：取适量最后一次漂洗液涂布于PDA培养基中，涂布2皿CK3：取材料压入PDA培养基中，待0.5h后取出材料，重复10次。主根：在75%乙醇中处理40 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；叶柄：在75%乙醇中处理30 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；叶片：在75%乙醇中处理20 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理1 min、3 min、5 min；须根：在75%乙醇中处理10 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理0.5 min、1 min、3 min； 将经过以上消毒处理的材料材料接种于PDA培养基中，重复10次。置于25中培养，未接种材料的皿培养7天后观察是否有菌长出。接种材料的皿观察菌长出的时间，生长速度、长出菌量。1.4.2 分离培养条件筛选将黄连的主根、须根、叶柄、叶片以前面筛选出的表面消毒时间处理后，接种于不同浓度PDA培养基中，分别于15、25的培养条件下倒置培养。各材料接种20皿，每变量放置2皿。观察生长出真菌的时间、生长出的数量、生长速度。1.4.3 内生真菌的分离纯化培养7天后取各个菌落边缘的菌块接种于PDA培养基上，培养4天后再次取菌落边缘菌丝接种，如此反复多次，直到获得纯培养物为止。1.4.4 保种用水浴保种的方法对纯化所得的菌株进行保种。用灭菌的大头针挑取纯化的菌落的一部分，放入1.5mL的无菌EP管中，加入无菌水至淹没菌种，密封保存。2 结果与分析2.1 表面消毒条件筛选2.1.1 主根表面消毒的筛选表1 主根在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率Table 1 The percentage of growing fungi on root at different times of the surface concentration in sodium hypochlorite disinfecting次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间（min）第4日长菌率（%）第7日长菌率（%）第10日长菌率（%）对照是否长菌96175083-8000-10000-4.520100100-402090-603383-8408080-1001717-2.25220100100+4060100+6173367+8336783+1033100100+注：“-”表示未长菌，“+”表示长菌，下同。通过表1数据可以发现在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组有菌长出，说明浓度过低；在浓度为9%时，对照组未长菌，但试验组几乎无菌长出，表明浓度过高；在浓度为4.45时，比较发现4min、6min的消毒时间为最佳时间，故选择次氯酸钠浓度为4.5%和消毒时间4min作为最佳筛选条件，既达到消毒水平也最节约时间。2.1.2 须根表面消毒的筛选表2 须根在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率Table 2 The percentage of growing fungi on fibrous root at different times of the surface concentration in sodium hypochlorite disinfecting次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间（min）第4日长菌率（%）第7日长菌率（%）第10日长菌率（%）对照是否长菌90.5132550-1132550-3132525-4.50.55075100-1387588-30013-2.250.5387588+1387563-3388863+对表2数据分析发现：在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组不仅有真菌长出还有细菌长出，说明浓度太低；在浓度为9%时，对照组未长菌，但试验组的长菌率只有50%，偏小不适合；在浓度为4.5%时，0.5min、1min的消毒时间较好，考虑试验过程的方便性，选择消毒时间1min为最佳时间，故须根的表面消毒筛选条件为：在4.5%的次氯酸钠中1min。2.1.3 叶柄表面消毒时间的筛选表3 叶柄在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率Table 3 The percentage of growing fungi on petiole at different times of the surface concentration in sodium hypochlorite disinfecting次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间（min）第4日长菌率（%）第7日长菌率（%）第10日长菌率（%）对照是否长菌96303060-810200-104030104.565040100-87070100-10101050-2.2566090100-8100100100-10100100100-从表3数据也可看出在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组已没有菌长出，比较分析选择消毒时间6min作为最佳条件，因此叶柄的表面消毒筛选条件为：在2.25%的次氯酸钠中6min。2.1.4 叶片表面消毒的筛选表4 叶柄在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率Table 4 The percentage of growing fungi on leaves at different times of the surface concentration in sodium hypochlorite disinfecting次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间（min）第4日长菌率（%）第7日长菌率（%）第10日长菌率（%）对照是否长菌91205070-304060-502040-4.515070100-33080100-5406080-2.2515080100+35080100+55070100+观察表4数据可发现，在次氯酸钠浓度2.25%时，对照组有菌长出，说明消毒浓度不够；在次氯酸钠浓度4.5%及9%时，对照组都无菌长出，对比发现次氯酸钠浓度4.5%且3min时最适宜叶柄的表面消毒。2.2 培养条件的筛选表5 对培养条件的筛选Table 5 Screening of culture conditions温度（）PDA浓度（%）4天后7天后10天后1512.5无菌长出开始长菌长势缓慢25无菌长出开始长菌长势缓慢50无菌长出开始长菌长势缓慢75无菌长出开始长菌长势缓慢100开始长菌长势缓慢长势缓慢2512.5无菌长出长势缓慢长势良好25无菌长出长势缓慢长势良好50开始长菌长势良好生长旺盛75开始长菌长势良好生长旺盛100开始长菌长势良好生长旺盛注：从得到的试验结果发现4个部位的温度浓度培养结果基本一致，故在此只列出一个表格说明。各部分材料在前面筛选出的表面消毒时间处理后，接种于PDA双抗培养基，试验中选择了15、25两个温度条件进行培养，观察发现它们都在25时长势较好，因此最后的培养条件选择25进行培养。在对不同浓度的PDA培养基选择时发现常规培养基能使黄连内生真菌很好生长，因此培养基还是按照100%配置。2.3 菌株的分离及保种按照上述试验结果获得的最佳表面灭菌、最佳培养条件重新接种一批材料。7天后，用接种环挑取各个菌落边缘的菌丝接种于双抗培养基上，培养4天后再次挑取边缘菌丝接种，经过多次反复的培养最后从主根分离出14种，须根7种，叶柄24种，叶片21种共60多种菌株。在最后一次的培养基上用灭菌的大头针挑取纯化的菌落的一部分，放入1.5mL的EP管中，加入无菌水至淹没菌种，密封保存。3 讨论本试验是首次对黄连的内生真菌进行分离培养，但在禾本科植物中分离内生真菌的应用已经相当广泛11, 14，技术比较成熟，具有借鉴作用。通过试验获得了适宜黄连各部位表面消毒和培养的条件，为今后黄连药物的研究能够提供一些帮助。从表14的结果分析可看出除叶柄外，其他部位消毒浓度都在4.5%达到最佳效果，原因可能是黄连叶柄表面十分光滑且有木质部的存在，使得表面附着的真菌、细菌难以生长，从而在2.25%时就能打到最佳效果。由于都是同一植株的内生真菌，他们对培养的条件要求几乎一致，在常规的PDA培养基和室温条件能很好的生长。植物体内不仅仅含有真菌，同时还含有细菌，因此在最后的分离时选择了加入青霉素和硫酸链霉素的双抗PDA培养基来抑制细菌的生长15，从而更好的分离真菌。分离后保种的菌株能够为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。4 结论主根的最佳表面消毒时间为75%乙醇溶液洗涤40 s，4.5%的次氯酸钠溶液4 min；叶柄的最佳表面消毒时间为75%乙醇溶液洗涤30 s，2.25%的次氯酸钠溶液6 min；叶片的最佳表面消毒时间为75%乙醇溶液洗涤20 s，4.5%的次氯酸钠溶液3 min；须根的最佳表面消毒时间为75%乙醇溶液洗涤10 s，2.25%的次氯酸钠溶液1 min。最佳分离培养条件为25，100%浓度的双抗PDA培养基。参考文献1 邵顺波. 异喹啉类生物碱的生理活性及研究进展J. 安徽医药. 2007, 11(003): 254-255.2 肖平. 黄连的药理作用与临床应用J. 中华综合临床医学杂志 (北京). 2004, 6(006): 142-143.3 Hirano H, Osawa E, Yamaoka Y et al. 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