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酶分子定向进化本讲稿第一页，共三十四页天然酶的应用及局限性天然酶的应用及局限性酶的定向进化的思想酶的定向进化的思想酶的定向进化的策略和方法酶的定向进化的策略和方法酶的定向进化技术的展望酶的定向进化技术的展望 本讲稿第二页，共三十四页生物体系之所以能够相对独立地存在于自生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中然界中,并维持其独立性和生命的延续性并维持其独立性和生命的延续性,都都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用.酶保证了生物体内组成生命活动的大量生酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序化反应得以按照预定的方向有序,精确而顺精确而顺利地进行利地进行,几乎所有生物的生理现象都与酶几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关的作用紧密相关,可以这样说可以这样说,没有酶的存在没有酶的存在,就没有生物体的一切生命活动就没有生物体的一切生命活动.本讲稿第三页，共三十四页天然酶的局限性天然酶的局限性随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入逐步深入,研究者发现研究者发现,酶催化的精确性和有酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求化应用的要求,而且天然酶的稳定性差而且天然酶的稳定性差,活性活性低使催化效率很低低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催还缺乏有商业价值的催化功能化功能天然酶的局限性源于酶的自然进化过程天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.本讲稿第四页，共三十四页现代生物工程对酶的要求现代生物工程对酶的要求 能具备长期稳定性和活性能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物合成底物进一步增强酶对多种底物的分解能力进一步增强酶对多种底物的分解能力如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景.本讲稿第五页，共三十四页1993年年,美国科学家美国科学家Arnold F H首先提出酶首先提出酶分子的定向进化的概念分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶造或构建新的非天然酶.本讲稿第六页，共三十四页定向进化定向进化是模拟自然进化的过程，进行人定向进化是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。的技术过程。分为分子定向进化和细胞定向进化分为分子定向进化和细胞定向进化本讲稿第七页，共三十四页细胞定向进化细胞定向进化细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，目的化的过程，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种特征，主要包括微生物是改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。植物细胞的定向进化等。随机突变方法有全基因组重排技术。随机突变方法有全基因组重排技术。基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合，对细胞进行基因组重排，从而术相结合，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的正突变频率。大幅度增加细胞的正突变频率。本讲稿第八页，共三十四页分子定向进化分子定向进化分子定向进化是在分子水平上进行定向进分子定向进化是在分子水平上进行定向进化的过程。化的过程。分子定向进化首先要通过从细胞内提取或分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者通过者通过PCRPCR等方法获得目标分子的基因，在等方法获得目标分子的基因，在体外采用易错体外采用易错PCR PCR、重排、基因家、重排、基因家族重排等技术进行人工突变，然后进行定族重排等技术进行人工突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。向选择而获得所需突变体。本讲稿第九页，共三十四页酶分子定向进化酶分子定向进化简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。本讲稿第十页，共三十四页酶定向进化的基本过程随机突变、构建突变基因文库、定向选择酶定向进化的基本过程：酶基因酶基因随机突变随机突变构建突变基因文库构建突变基因文库筛选筛选负突变基因负突变基因正突变基因正突变基因进化酶进化酶反复进行反复进行本讲稿第十一页，共三十四页随机突变的策略随机突变的策略易错易错PCRPCR技术技术(error-prone PCR)(error-prone PCR)DNADNA改组改组(DNA shuflling):(DNA shuflling):由美国由美国Stemmer Stemmer 于于1994 1994 年年首次提出首次提出 一项体外重组技术一项体外重组技术 随机引发重组随机引发重组(RPR)1998(RPR)1998 年年,Arnold,Arnold 提出了一种提出了一种有效的新方法有效的新方法 交错延伸技术交错延伸技术(StEP):(StEP):由由Zhao Zhao 等等 提出提出,是一种简化是一种简化的的DNA shuffling DNA shuffling 技术技术 基因家族重排技术基因家族重排技术本讲稿第十二页，共三十四页酶定向进化的特点酶定向进化的特点1 1 适应面广适应面广2 2 目的性强目的性强3 3 效果显著效果显著本讲稿第十三页，共三十四页第二节第二节 酶基因的随机突变酶基因的随机突变体外随机突变的方法：体外随机突变的方法：PCRPCR技术、技术、DNADNA重重排技术、基因家族重排技术排技术、基因家族重排技术基因随机突变方法的特点基因随机突变方法的特点P207P207表表8 81 1随机突变方法可以联合使用，交叉进行，随机突变方法可以联合使用，交叉进行，通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的定向进化。定向进化。本讲稿第十四页，共三十四页一 易错PCR技术在在PCRPCR技术的基础上，通过改变反应条件，技术的基础上，通过改变反应条件，增加碱基配对错误的出现频率，就成为易增加碱基配对错误的出现频率，就成为易错错PCRPCR技术。技术。可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变的锰离子、改变4 4种底物（种底物（dAMPdAMP、dTMPdTMP、dCMPdCMP、dGMPdGMP）的浓度比等反应条件，使）的浓度比等反应条件，使DNADNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。配对错误的出现频率，而引起基因突变。本讲稿第十五页，共三十四页特点正突变的概率低，突变基因文库较大，文正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。的定向进化。本讲稿第十六页，共三十四页二二 DNADNA重排技术重排技术概念：又称为概念：又称为DNADNA改组技术，是从正突变改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源基因文库中分离得到的同源DNADNA，用酶切，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次割成随机片断，经过不加引物的多次PCRPCR循循环，使环，使DNADNA的碱基序列重新排布而引起基的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。因突变的技术过程。本讲稿第十七页，共三十四页DNA重排技术的基本过程重排技术的基本过程两条以上正突变基因两条以上正突变基因DNA随机片断随机片断突变基因突变基因构建突变基因文库构建突变基因文库筛选筛选负突变基因负突变基因正突变基因正突变基因进化酶进化酶酶切酶切（反复进行）（反复进行）无引物无引物PCR基因重组基因重组酶切酶切本讲稿第十八页，共三十四页DNADNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧核糖重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧核糖核算酶核算酶（DNase)DNase)等酶的作用，随机切割成若干等酶的作用，随机切割成若干DNADNA片断，然后将这些随机片断在不加引物的条件下经片断，然后将这些随机片断在不加引物的条件下经过多次过多次PCRPCR循环，使这些循环，使这些DNADNA随机片断互为模板和引随机片断互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适宜的引物进行物进行扩增、延伸，再加入适宜的引物进行PCRPCR反反应，获得全长基因。应，获得全长基因。这些全长基因由于是在不加引物的条件下由这些全长基因由于是在不加引物的条件下由DNADNA随机随机片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序列经过片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序列经过重新排布而形成众多的突变基因。重新排布而形成众多的突变基因。本讲稿第十九页，共三十四页1 1）交错延伸）交错延伸PCRPCR技术：在同一个反应体系中以两个或多技术：在同一个反应体系中以两个或多个相关的个相关的DNADNA片断为模板进行片断为模板进行PCRPCR反应，把反应，把PCRPCR反应反应中常规的退火和延伸合并为一步，并且大大缩短了反应中常规的退火和延伸合并为一步，并且大大缩短了反应时间（时间（5555，5s)5s)。在反应过程中，引物先与一个模。在反应过程中，引物先与一个模板结合，进行延伸，随之进行多次变性和短时的退板结合，进行延伸，随之进行多次变性和短时的退火延伸反应循环，在每个循环中，不同长度的火延伸反应循环，在每个循环中，不同长度的延伸片断在变性时与原先的模板分开，退火时与另延伸片断在变性时与原先的模板分开，退火时与另一个模板结合，再进行延伸。通过在不同的模板上一个模板结合，再进行延伸。通过在不同的模板上交替延伸，所合成的交替延伸，所合成的DNADNA片断中包含有不同模板上片断中包含有不同模板上的信息，直到获得全长的突变基因为止。的信息，直到获得全长的突变基因为止。本讲稿第二十页，共三十四页2 2）随机引物体外重组技术）随机引物体外重组技术采用单链采用单链DNADNA为模板，配合若干条随机序为模板，配合若干条随机序列的引物进行列的引物进行PCRPCR反应，产生若干个与模板反应，产生若干个与模板不同部分的序列互补不同部分的序列互补DNADNA小片断，然后除小片断，然后除去模板，这些去模板，这些DNADNA小片断互为模板和引物小片断互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。得全长突变基因。本讲稿第二十一页，共三十四页三基因家族重排技术三基因家族重排技术概念概念又称为基因家族改组技术，是从基因家族又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶的若干同源基因出发，用酶(DNase)(DNase)切割切割成随机片断，经过不加引物的多次成随机片断，经过不加引物的多次PCRPCR循环，循环，使使DNADNA的碱基序列发生重新排布而引起基的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。因突变的技术过程。本讲稿第二十二页，共三十四页基因家族重排技术的基本过程基因家族重排技术的基本过程基因家族若干同源基因基因家族若干同源基因酶切酶切DNA随机片断随机片断突变基因突变基因突变基因文库突变基因文库基因重组基因重组筛选筛选负突变基因负突变基因正突变基因正突变基因进化酶进化酶无引物无引物PCR酶切酶切反复进行反复进行本讲稿第二十三页，共三十四页DNADNA家族重排技术与家族重排技术与DNADNA重排技术的异同点重排技术的异同点相同点：相同点：DNADNA家族重排技术与家族重排技术与DNADNA重排技术的过程大重排技术的过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCRPCR等步骤等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。通量筛选技术筛选获得正突变基因。不同点：不同点：DNADNA家族重排技术从基因家族的若干同源基因家族重排技术从基因家族的若干同源基因出发进行出发进行DNADNA序列的重新排布，而后者则从采用易错序列的重新排布，而后者则从采用易错PCRPCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNADNA序列的重新排布。序列的重新排布。本讲稿第二十四页，共三十四页第三节 酶突变基因的定向选择突变基因的定向选择基本过程突变基因的定向选择基本过程突变基因突变基因基因载体基因载体突变基因文库突变基因文库基因重组基因重组筛选筛选目的基因目的基因本讲稿第二十五页，共三十四页一 酶突变基因文库的构建（一）构建基因文库的质量要求（一）构建基因文库的质量要求1 1 文库的包容性文库的包容性:指构建的文库必须尽可能地指构建的文库必须尽可能地包含基因的任何一种可能的突变信息。包含基因的任何一种可能的突变信息。2 2 文库的完整性：指文库中包含的文库的完整性：指文库中包含的DNADNA片片断必须尽可能完整地反应基因的结构和功断必须尽可能完整地反应基因的结构和功能信息，以便通过筛选得到的突变基因能能信息，以便通过筛选得到的突变基因能够通过表达获得完整的具有催化功能的进够通过表达获得完整的具有催化功能的进化酶。化酶。本讲稿第二十六页，共三十四页（二）构建突变基因文库的主要过程（二）构建突变基因文库的主要过程载体的选择载体的选择1 1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链DNADNA分子。分子。2 2）噬菌体）噬菌体DNADNA载体：由噬菌体载体：由噬菌体DNADNA改造而成的具有改造而成的具有自我复制能力的载体。自我复制能力的载体。3 3）黏粒载体：是一类人工构建的含有）黏粒载体：是一类人工构建的含有DNADNA黏性末端和黏性末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。4 4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13M13噬菌体单链噬菌体单链DNADNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。本讲稿第二十七页，共三十四页基因重组基因重组在体外通过在体外通过DNADNA连接酶的作用，将基因与载连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组体连接在一起形成重组DNADNA的技术过程。的技术过程。黏性末端连接黏性末端连接平头末端连接平头末端连接修饰末端连接修饰末端连接本讲稿第二十八页，共三十四页形成基因文库形成基因文库将重组将重组DNADNA转入受体细胞或包装成有感染活转入受体细胞或包装成有感染活性的噬菌体的过程。性的噬菌体的过程。重组质粒载体：转化重组质粒载体：转化重组噬菌体重组噬菌体DNADNA载体：需要用噬菌体外壳蛋载体：需要用噬菌体外壳蛋白将重组白将重组DNADNA进行包装，称为有感染活性进行包装，称为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。的重组噬菌体，而形成基因文库。本讲稿第二十九页，共三十四页二突变基因的筛选二突变基因的筛选（一）定向选择环境条件的设定定向选择环境条件的设定（1 1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。突变筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。（2 2）如果定向进化的目的是提高）如果定向进化的目的是提高内酰胺酶的活内酰胺酶的活性，从而提高对性，从而提高对内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的通过在含有一定浓度的内酰胺酶类抗生素的培养基内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变筛选循环中逐步提高中培养重组细胞，并在每一次突变筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。抗生素的浓度。（二）高通量筛选技术（二）高通量筛选技术P217P217表表8 82 2本讲稿第三十页，共三十四页一一 平板筛选法平板筛选法平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。况。1 1）依据细胞生长情况筛选突变基因）依据细胞生长情况筛选突变基因在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pHpH稳稳定性和对其他极端环境条件的耐受能力等定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方面有广泛应用。方面有广泛应用。本讲稿第三十一页，共三十四页2 2）依据颜色变化筛选突变基因）依据颜色变化筛选突变基因（1 1）在采用噬菌体）在采用噬菌体DNADNA载体构建突变基因文库时，可以用载体构建突变基因文库时，可以用大肠杆菌大肠杆菌半乳糖苷酶的基因片断（半乳糖苷酶的基因片断（lacZlacZ）插入到噬）插入到噬菌体菌体DNADNA的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有细胞时，在含有IPTGIPTG和底物和底物X Xgalgal的平板培养基上可以形的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。成蓝色噬菌斑。（2 2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。本讲稿第三十二页，共三十四页3）依据透明圈情况筛选突变基因）依据透明圈情况筛选突变基因依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。出现较大的透明圈。本讲稿第三十三页，共三十四页第四节第四节 酶定向进化的应用酶定向进化的应用一、提高酶的催化效率一、提高酶的催化效率二、增加酶的稳定性二、增加酶的稳定性三、改变酶的底物特异性三、改变酶的底物特异性本讲稿第三十四页，共三十四页