氨基酸的薄层层析实验报告.doc

,生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称氨基酸的薄层层析实验日期2015-11-09实验地点第四实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1掌握薄层层析法的一般原理。2掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术，包括制板、点样、层析、显色。3掌握如何根据样品的移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（本实验中即氨基酸混合液）。二、实验原理1薄层层析法：本实验将硅胶作为固相支持物，羧甲基纤维素钠作为黏合剂，两者的混合物作为固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相展开溶剂在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样、不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，混合液中的氨基酸可以彼此分开。2硅胶吸附薄层层析的特点：层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（SiOH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关，故涂布操作前必须保证平板足够干燥。硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离，故混合氨基酸样品中的氨基酸组分均为中性或酸性氨基酸。硅胶的活化温度通常为105110，不能过高，故活化过程中的烘干温度控制在70左右。3氨基酸的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。（氨基酸显色反应的化学方程式参见下图）4 Rf值鉴定混合氨基酸中含的氨基酸种类：层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。三、材料与方法1实验材料1.1样品： （1）氨基酸标准溶液：0.01mol/L丙氨酸，0.01mol/L精氨酸，0.01mol/L甘氨酸（2）混合氨基酸溶液：以异丙醇作为溶剂将0.01mol/L丙氨酸，0.01mol/L精氨酸，0.01mol/L甘氨酸按等体积制成混合溶液1.2试剂：硅胶、0.5%的羧甲基纤维素钠、展层-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）1.3仪器：层析板、尺子、铅笔、药匙、玻璃棒、50ml小烧杯、10ml量筒、托盘天平、毛细玻璃管、层析缸、烘箱、吹风机2.实验方法2.1实验流程：制作硅胶层析板在层析板上点氨基酸样品对氨基酸样品进行层析对氨基酸样品进行显色2.2实验步骤：步骤操作（1）制作硅胶层析板1.调浆：称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。2.涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。3.干燥：将玻璃板水平放置，室温下30min自然晾干。4.活化：70烘干30分钟。（2）在层析板上加氨基酸样品1.标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm。2.点样：用毛细玻璃管分别吸取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样，重复滴两滴。加样后原点扩散直径不超过2mm。（3）对氨基酸样品进行层析将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔轻轻描出溶剂前沿界线。（4）对氨基酸样品进行显色用热风机或在85下烘干15min-20min，即可显出各层斑点。2.3注意事项：（一）吸附剂:薄层层析用的吸附剂如氧化铝和硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜，如果颗粒太大，展开时溶剂推进速度太快，分离效果不好。反之，颗粒太小，层析展开时太慢，斑点容易拖尾，分离效果也会造成效果出现影响。（二）点样:点样的次数依照样品溶液的浓度而定，样品太少时，有的成分不易显示，样品太多会导致斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离，点样后的斑点纸巾一般为0.2cm。取出的毛细玻璃管一定要放回原瓶，如果使用完毛细玻璃管忘记不知道是哪种氨基酸的，直接把毛细管放到一边，不要放到任何一瓶氨基酸溶液中，避免污染。（三）操作:1.切勿用手直接接触薄层板面。2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。3.滴加氨基酸使用的毛细管一定要放回对应的氨基酸容器。 4.将层析板浸入展层-显色剂时点样线不能浸入到溶液中。四、结果与讨论 1实验中观察到的现象1.1制作层析板时，加入羧甲基纤维素钠的乳酸在搅拌后变为糊状，继续搅拌后变为均匀的糊状，均匀的涂层后糊状物均匀的摊开在玻璃板表面，颜色趋近透明，带有淡淡白色。1.2打开层析缸，展层-显色剂无色透明但有浓重臭味，将薄层板浸入时，液面上行展层，但氨基酸没有显色。1.3在薄层板层析后烘干可见深浅不一的紫红色斑点，精氨酸最深，丙氨酸次之，甘氨酸最浅，这三个氨基酸只有一个斑点，而混合氨基酸有三个斑点。2层析结果（如图所示）3实验数据记录从点样线到溶剂前沿线之间的距离约为6.80cm。测定次数各氨基酸斑点中心至原点中心的距离(cm)丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点311.891.490.700.721.491.9021.911.500.720.701.511.8831.931.480.710.681.501.92平均值1.911.490.710.701.501.904结果计算与记录计算Rf值的公式：样品斑点到原点距离平均值（cm）溶剂前沿到原点距离（cm）Rf值氨基酸名称丙氨酸1.916.800.280甘氨酸1.496.800.219精氨酸0.716.800.104混合点10.706.800.103精氨酸混合点21.506.800.221甘氨酸混合点31.906.800.279丙氨酸5实验结论由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可根据Rf值来鉴定被分离的物质。根据混合氨基酸混合点1、2、3所出现的位置，以及丙氨酸、精氨酸、甘氨酸显色反应所出现的位置，混合氨基酸成分很可能是丙氨酸、精氨酸、甘氨酸，再加上Rf值的相似度，可以下结论，混合氨基酸为精氨酸、甘氨酸、丙氨酸三种氨基酸的混合物。本次实验不存在重大的失误。6结果讨论6.1总结 本次实验结果较为理想，通过本次实验，学会了制作薄层板、对氨基酸溶液进行点样和层析，明白了Rf值的意义，知道如何用其鉴别氨基酸溶液。最终层析图谱也大致对应，基本达到实验目的。6.2斑点颜色不同讨论：因为氨基酸自身的结构、酸碱性不同，所以氨基酸与茚三酮反应的显色有深浅不同。6.3实验结果误差分析（1）制板操作过程中，所用的薄层板无法做到绝对的平整，固体吸附剂也不一定能十分均匀地分布在板上，因此存在因为薄层板不平整或固体吸附剂分布不均匀带来的层析液扩散变慢,影响实验结果。（2）由于氨基酸溶液层析后呈斑点状，每个人测量时取的中心不同，测到的距离也不同，存在测量误差。（3）点样过程中，可能存在误用样品的现象，在同一个点样点上点了多种不同的氨基酸标准液，导致实验结果不明显或不准确。（4）点样过程中，没有进行重复点样，导致实验结果不明显；或是在点样次数过多，样品量太大导致斑点过大，互相影响，导致实验结果不准确。7.思考题：（1）硅胶的吸附力与含水量的问题硅胶属于极性吸附剂，含水量越多，会导致单位体积硅胶颗粒的减少，从而降低硅胶的吸附力。根据活性级别越大，吸附能力越小的关系，硅胶的吸附能力与含水量呈负相关，含水量高，活度级数高。（2）吸附实验中吸附剂的选择根据 吸附剂的选择一般根据被吸附的吸附质、实验温度。若被测成分极性大则应选吸附性较弱的吸附剂，若被测成分具有亲脂性则应选吸附性强的吸附剂（3）氨基酸纸层析，两者有何区别？纸层析不用铺板，固定相是水，吸附性比较弱，展开剂的极性较强，而薄层层析要用硅胶做层析板，固定相是硅胶，吸附性比纸层析强，展开剂的极性一般。