微生物的遗传变异与菌种选育幻灯片.ppt

微生物的遗传变异与菌种选育第1页，共63页，编辑于2022年，星期六第 二 节 微 生 物 的 基 因 突 变突变突变:指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在遗传的变化。突变率常在10-910-6范围内。范围内。从突变涉及的范围，突变分为：从突变涉及的范围，突变分为：基因突变基因突变染色体畸变染色体畸变第2页，共63页，编辑于2022年，星期六(一)基因突变的类型（根据遗传信息的变化）原序列原序列 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGG Met Pro Ser Arg Cys Gly同义突变同义突变 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGA Met Pro Ser Arg Cys Gly错义突变错义突变 5-AUG CCU UCA GGA UGU GGA Met Pro Ser Gly Cys Gly第3页，共63页，编辑于2022年，星期六(一)基因突变的类型（根据遗传信息的变化）原序列原序列 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGG Met Pro Ser Arg Cys Gly无义突变无义突变 5-AUG CCU UCA AGA UGA GGA Met Pro Ser Arg移码突变移码突变 5-AUG CCU UCA AGU GUG GG Met Pro Ser Ser Val 第4页，共63页，编辑于2022年，星期六n无义突变无义突变:由于某个碱基的改变使代表某种氨基由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密酸的密 码子突变为终止密码子码子突变为终止密码子UAA、UAG或或UGA，从而使肽链合成提前终止。，从而使肽链合成提前终止。n移码突变：在正常地移码突变：在正常地DNA分子中分子中,碱基缺失或碱基缺失或增加增加非非3的倍数的倍数,造成这位置之后的一系列编码造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。第5页，共63页，编辑于2022年，星期六染色体畸变染色体畸变wDNA的大损伤的大损伤染色体畸变染色体畸变，包括以下，包括以下两个方面：两个方面：染色体结构染色体结构上的缺失、重复、易上的缺失、重复、易位和倒位位和倒位染色体数目染色体数目的变化。的变化。第6页，共63页，编辑于2022年，星期六w易位易位：断裂下来的一小段染色体再顺向或：断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。w倒位倒位：断裂下来的：断裂下来的DNA片段旋转片段旋转180后，后，重新插入到原来染色体的位置上；重新插入到原来染色体的位置上；第7页，共63页，编辑于2022年，星期六染色体结构上的变化v染色体内畸变染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化只涉及一条染色体上的变化v如发生染色体的部分如发生染色体的部分缺失缺失或或重复重复时，其结果时，其结果可造成可造成基因的减少或增加基因的减少或增加；v如发生如发生倒位倒位或或易位易位时，则可造成时，则可造成基因排列顺基因排列顺序的改变序的改变，但数目却不改变。，但数目却不改变。v染色体间畸变染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。，则指非同源染色体间的易位。第8页，共63页，编辑于2022年，星期六突变的表型突变的表型w突变株的表型突变株的表型成因成因检出方法检出方法w营养缺陷型营养缺陷型 因突变而丧失合成一因突变而丧失合成一补充培养基补充培养基w（auxotroph）种或几种生长因子的种或几种生长因子的w 能力，不能在基本培养能力，不能在基本培养w 基上生长基上生长w抗性突变型抗性突变型 因突变而产生了对某因突变而产生了对某 药物培养基药物培养基（resistant mutant）种化学药物或致死种化学药物或致死w 物理因子的抗性物理因子的抗性w条件致死突变型条件致死突变型 突变后在某种条件下突变后在某种条件下 培养条件改变培养条件改变w（conditional 可正常生长、繁殖并可正常生长、繁殖并wlethal mutant）实现其表型，而在另实现其表型，而在另w 一条件下却无法生长一条件下却无法生长w 繁殖的突变型繁殖的突变型第9页，共63页，编辑于2022年，星期六w突变株的表型突变株的表型成因成因 检出方法检出方法w形态突变型形态突变型 因突变而产生的个体因突变而产生的个体 形态形态wMorphologycal 或菌落形态改变或菌落形态改变 （常用颜色变（常用颜色变 化化 ww抗原突变型抗原突变型 因突变而引起的细胞因突变而引起的细胞 借助于抗原借助于抗原wantigenic 成分发生改变成分发生改变 抗体反应抗体反应 ww产量突变型产量突变型 因突变而获得的在有因突变而获得的在有 测定产量或测定产量或 whigh producing 用代谢物产量上高于用代谢物产量上高于 其它其它wmutant 原始菌株的突变株原始菌株的突变株第10页，共63页，编辑于2022年，星期六一些菌种某些性状的自发突变率菌名突变性状突变率Escherichia coliE.coliE.coliE.coliStaphylococcus aureusS.aureusSalmonella typhi抗T1噬菌体抗T3噬菌体不发酵乳糖抗紫外线抗青霉素抗链霉素抗25ug/L链霉素抗异烟肼310-8110-7110-10110-5110-7110-9510-6510-5第11页，共63页，编辑于2022年，星期六突变的机制 碱基置换（转换碱基置换（转换 颠换）颠换）基因突变基因突变 移码突变（缺失移码突变（缺失 添加）添加）诱变诱变 染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位 自发突变自发突变突变第12页，共63页，编辑于2022年，星期六突变的原因：自发、诱发w自发突变：自发突变：没有人工参与的情况下微生物没有人工参与的情况下微生物自然发生的突变自然发生的突变w诱发突变诱发突变：物理（紫外线、射线、激光、：物理（紫外线、射线、激光、等离子）或化学因素（烷化剂、吖啶类化等离子）或化学因素（烷化剂、吖啶类化合物等）导致合物等）导致第13页，共63页，编辑于2022年，星期六基因突变的特点基因突变的特点1.不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。关系。2.自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。3.稀有性：突变率低且稳定。稀有性：突变率低且稳定。4.独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。5.可诱发性：诱变剂可提高突变率。可诱发性：诱变剂可提高突变率。6.稳定性：变异性状稳定可遗传。稳定性：变异性状稳定可遗传。7.可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向 突变，相反的过程则称为回复突变或回变。突变，相反的过程则称为回复突变或回变。第14页，共63页，编辑于2022年，星期六基因突变的机制w自发突变机制自发突变机制w1、背景辐射和环境因素的影响、背景辐射和环境因素的影响：由于一：由于一些原因不详的低剂量诱变因素的长期总和些原因不详的低剂量诱变因素的长期总和诱变效应。如各种短波辐射或高温，以及诱变效应。如各种短波辐射或高温，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质的作用等。质的作用等。w2、微生物自身有害代谢产物的诱变效应、微生物自身有害代谢产物的诱变效应：如咖啡碱、硫氰化合物等。在许多微生物如咖啡碱、硫氰化合物等。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株。的陈旧培养物中易出现自发突变株。第15页，共63页，编辑于2022年，星期六w3、氨基的互变异构效应、氨基的互变异构效应：T和和G会以会以酮式酮式或烯或烯醇式两种互变异构的状态出现，而醇式两种互变异构的状态出现，而C和和A则会以则会以亚氨基式亚氨基式或氨基式两种互变异构的状态出现。或氨基式两种互变异构的状态出现。w4、环状突变效应、环状突变效应：在：在DNA的复制过程中，某一的复制过程中，某一单链上偶然产生一个小环，其上的基因就会越单链上偶然产生一个小环，其上的基因就会越过复制而发生遗传缺失。过复制而发生遗传缺失。第16页，共63页，编辑于2022年，星期六 碱基置换（转换碱基置换（转换 颠换）颠换）点突变点突变 移码突变（缺失移码突变（缺失 添加）添加）诱发突变诱发突变 染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位 第17页，共63页，编辑于2022年，星期六诱发突变的机制w碱基置换碱基置换w移码突变移码突变w染色体畸变染色体畸变第18页，共63页，编辑于2022年，星期六w1、碱基置换、碱基置换w定义定义：对对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤小损伤,一般也称点突变。它只涉及一对碱基被另一一般也称点突变。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。对碱基所置换。w分类分类：w 转换转换:DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤链中的一个嘌呤被另一个嘌呤,或一个或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换嘧啶被另一个嘧啶所置换.w 颠换颠换:DNA链中的一个嘌呤被另一个嘧啶链中的一个嘌呤被另一个嘧啶,或一个或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。嘧啶被另一个嘌呤所置换。第19页，共63页，编辑于2022年，星期六直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂w如如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基甲基-N硝基硝基-N-亚硝基胍，亚硝基胍，N-甲基甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。w它们可与碱基发生化学反应。它们可与碱基发生化学反应。第20页，共63页，编辑于2022年，星期六碱基转换的分子机制w亚硝酸亚硝酸可使碱基发生可使碱基发生氧化脱氨氧化脱氨作用，作用，故它能使腺嘌呤故它能使腺嘌呤（A）变成次黄嘌变成次黄嘌呤呤（H），使胞嘧啶，使胞嘧啶（C）变成尿变成尿嘧啶嘧啶（U），从而发生转换。，从而发生转换。第21页，共63页，编辑于2022年，星期六间接引起置换的诱变剂w引起这类变异的诱变剂都是一些引起这类变异的诱变剂都是一些碱基碱基类似物类似物，如如5-溴尿嘧啶、溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧氨基尿嘧啶、啶、8-氮鸟嘌呤、氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤和氨基嘌呤和6-氯嘌氯嘌呤等。呤等。w它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入到到DNA分子中后而引起碱基置换分子中后而引起碱基置换.第22页，共63页，编辑于2022年，星期六2、移码突变：、移码突变：DNA分子中的一个或少数几个分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。变。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。分子的微小损伤。有效诱变剂有效诱变剂：吖啶类染料，如吖啶黄、吖：吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙和啶橙和-氨基吖啶等。氨基吖啶等。第23页，共63页，编辑于2022年，星期六吖啶类化合物的诱变机制w至今还不很清楚。有人认为，它们能嵌入至今还不很清楚。有人认为，它们能嵌入两个相邻两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），），从而在从而在DNA复制过程中，会使链上增添或复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。第24页，共63页，编辑于2022年，星期六第25页，共63页，编辑于2022年，星期六第三节第三节 微生物的基因重组微生物的基因重组w基因重组基因重组：凡把两个不同性状个体内的遗传凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。合，形成新遗传型个体的方式。w重组是分子水平上的一个概念，而一般所说重组是分子水平上的一个概念，而一般所说的杂交则是细胞水平上的一个概念。杂交中的杂交则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。形式。第26页，共63页，编辑于2022年，星期六基因重组的意义v基因重组是杂交育种的理论基础。基因重组是杂交育种的理论基础。v杂交育种的优点：杂交育种的优点：v选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲本本v利用杂交育种可以消除某一菌株在经过长利用杂交育种可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象第27页，共63页，编辑于2022年，星期六一、原核微生物的基因重组 转化转化转导转导接合接合 基基因因重重组组的的方方式式第28页，共63页，编辑于2022年，星期六转化v转化或转化作用转化或转化作用：受体菌直接吸收来自供体菌：受体菌直接吸收来自供体菌的的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌体菌DNA的受体菌称为转化子的受体菌称为转化子v范围范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。若干放线菌和蓝细菌及少数真核微生物也有转若干放线菌和蓝细菌及少数真核微生物也有转化报道。化报道。第29页，共63页，编辑于2022年，星期六v转化发生的条件转化发生的条件两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。都可发生转化。进行转化的受体细胞必须处于进行转化的受体细胞必须处于感受态感受态，亦即受体，亦即受体细胞最易接受外源细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一片段并实现其转化的一种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转变成变成感受态感受态第30页，共63页，编辑于2022年，星期六转导w转导转导：以噬菌体为媒介，把供体细胞的：以噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子。新遗传形状的受体细胞称为转导子。w转导的方式转导的方式：普遍转导普遍转导 转导转导 特异性转导特异性转导 第31页，共63页，编辑于2022年，星期六普遍转导：普遍转导：噬菌体能传递供体菌任何基因。噬菌体能传递供体菌任何基因。转导频率：转导频率：10-810-5第32页，共63页，编辑于2022年，星期六特异性转导：特异性转导：噬菌体只能传递供体菌某些噬菌体只能传递供体菌某些特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）基因）转导频率：转导频率：10-6第33页，共63页，编辑于2022年，星期六接合w概念概念：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状。整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状。w存在范围存在范围：细菌和放线菌中都存在接合现象。：细菌和放线菌中都存在接合现象。第34页，共63页，编辑于2022年，星期六二、真核微生物的基因重组w真核微生物的基因重组的方式真核微生物的基因重组的方式w有性杂交有性杂交w准性生殖准性生殖第35页，共63页，编辑于2022年，星期六w有性杂交有性杂交：性细胞接合，质配、核配，减：性细胞接合，质配、核配，减数分裂，染色体重组，并产生新遗传型后数分裂，染色体重组，并产生新遗传型后代。代。第36页，共63页，编辑于2022年，星期六有性杂交育种w过程过程：将甲亲本与乙亲本菌株分别接种到产孢：将甲亲本与乙亲本菌株分别接种到产孢子培养基斜面上，用蒸馏水洗下子囊，机械法子培养基斜面上，用蒸馏水洗下子囊，机械法破坏子囊获得子囊孢子，将子囊孢子铺平板获破坏子囊获得子囊孢子，将子囊孢子铺平板获得单倍体细胞组成的菌落，通过离心等方法使得单倍体细胞组成的菌落，通过离心等方法使单倍体细胞密集接触，即有机会产生双倍体的单倍体细胞密集接触，即有机会产生双倍体的有性杂交后代。有性杂交后代。第37页，共63页，编辑于2022年，星期六准性生殖准性生殖：同种微生物的两个不同来源的体：同种微生物的两个不同来源的体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。低频率的基因重组并产生重组子。第38页，共63页，编辑于2022年，星期六w工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物*从自然界中分离出来就能被利用；从自然界中分离出来就能被利用；对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。用。使用重组使用重组DNA技术改造的菌株技术改造的菌株w育种的目的：育种的目的：改善菌种的特性，使之能提高产量、改进质量、改善菌种的特性，使之能提高产量、改进质量、降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。w目前育种总趋势目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。第39页，共63页，编辑于2022年，星期六工业生产中微生物育种的基本方法包括：工业生产中微生物育种的基本方法包括：自然选育、诱变育种、杂交育种及基因重自然选育、诱变育种、杂交育种及基因重组定向育种等。组定向育种等。第四节第四节 微生物的菌种选育微生物的菌种选育第40页，共63页，编辑于2022年，星期六 一、自然选育一、自然选育 采样采样 增殖培养增殖培养 从自然界选育菌株从自然界选育菌株 纯种分离纯种分离 性能鉴定性能鉴定 从自发突变中选育菌株从自发突变中选育菌株第41页，共63页，编辑于2022年，星期六诱诱变变育育种种：是是用用物物理理或或化化学学的的诱诱变变剂剂使使诱诱变变对对象象DNA的的分分子子结结构构发发生生改改变变，引引起起性性状状变变异异并并通通过过筛筛选选获获得得符符合合要要求求的的变变异异菌菌株株的的一一种种育育种方法。种方法。l诱诱变变育育种种具具有有极极其其重重要要的的实实践践意意义义。当当前前发发酵酵工工业业和和其其它它微微生生物物生生产产部部门门所所使使用用的的高高产产菌菌株株，几几乎乎毫毫无无例例外外地地都都是是通通过过诱诱变变育育种种而而明明显显提提高高其其生生产产性性能能的。的。诱变育种育种第42页，共63页，编辑于2022年，星期六选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验第43页，共63页，编辑于2022年，星期六1、出、出发菌株的菌株的选择 出出发菌株菌株用来用来育种处理的育种处理的起始菌株起始菌株出出发菌株菌株应具具备 对诱变剂的敏感性高、变异幅度广对诱变剂的敏感性高、变异幅度广 具有特定生具有特定生产性状的能力或潜力性状的能力或潜力 出出发菌株的来源菌株的来源 自然界直接分离到的野生型菌株自然界直接分离到的野生型菌株 长期在生期在生产条件下条件下驯化而化而筛选菌株菌株第44页，共63页，编辑于2022年，星期六2 2、同步培养：、同步培养：对数生数生长期：生期：生长状状态比比较同步，容易同步，容易变异异3 3、制、制备单细胞或胞或单孢子子悬液液要求要求 菌体处于对数生长期，菌体处于对数生长期，细胞分散且胞分散且为单细胞，胞，方法：方法：玻璃珠打散玻璃珠打散10-15min;10-15min;用无菌脱脂棉用无菌脱脂棉过滤。制备：物理诱变剂制备：物理诱变剂生理盐水生理盐水 化学诱变剂化学诱变剂缓冲液缓冲液 浓度：浓度：细菌、放菌、放线菌菌 10 108 8个个/ml/ml 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 10 106 6个个/ml/ml第45页，共63页，编辑于2022年，星期六w4、诱变处理、诱变处理w诱变剂剂量的选择诱变剂剂量的选择w用用5085%的杀菌剂量的杀菌剂量w诱变剂使用方式诱变剂使用方式 单一处理单一处理 w 复合处理复合处理第46页，共63页，编辑于2022年，星期六第47页，共63页，编辑于2022年，星期六w5、中间培养：诱变处理后再液体培养基中培、中间培养：诱变处理后再液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖3代代以上，得到纯的变异细胞。以上，得到纯的变异细胞。w6、分离、筛选、分离、筛选w筛选方案：筛选方案：w分为初筛和复筛两步进行。分为初筛和复筛两步进行。w初筛初筛：删去明确不符合要求的大部分菌株，把：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网。状的菌株不至于漏网。w复筛复筛：对突变株的生产性能作比较精确的定量：对突变株的生产性能作比较精确的定量测定。一般是将微生物摇瓶培养，然后再对培测定。一般是将微生物摇瓶培养，然后再对培养液进行分析测定，确认符合要求的菌株；养液进行分析测定，确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。指标。第48页，共63页，编辑于2022年，星期六原生质体育种 原生质体：原生质体：脱去细胞壁的细胞。脱去细胞壁的细胞。原生质体育种：原生质体育种：通过人工方法将遗传性状不同的两个细胞通过人工方法将遗传性状不同的两个细胞的细胞壁去除，采用理化或生物学方法诱导它们的原生质的细胞壁去除，采用理化或生物学方法诱导它们的原生质体发生融合而产生重组子的过程。体发生融合而产生重组子的过程。过程：原生质体的制备、原生质体的融合（过程：原生质体的制备、原生质体的融合（使遗传物使遗传物质重新组合）、细胞壁的再生、筛选优良质重新组合）、细胞壁的再生、筛选优良性状的融合子性状的融合子、实用型菌株的筛选。、实用型菌株的筛选。第49页，共63页，编辑于2022年，星期六第50页，共63页，编辑于2022年，星期六基因工程技术用于工业菌种改良w基因工程基因工程：用人为的方法将所需要的某用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质一供体生物的遗传物质-DNA提取出来，提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶进行切在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的割后，把它与作为载体的DNA连接起来，连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中使供体殖的受体细胞中使供体DNA进行正常的进行正常的复制和表达，从而获得新物种。复制和表达，从而获得新物种。第51页，共63页，编辑于2022年，星期六DNA重组改良菌种1、目标、目标DNA的获得：的获得：从微生物细胞中采集分离从微生物细胞中采集分离由由mRNA反转录反转录cDNA用化学方法合成特定功能的基因用化学方法合成特定功能的基因从基因库（从基因库（美国、欧洲和日本等国家的生物技术信息研究中美国、欧洲和日本等国家的生物技术信息研究中心保存的心保存的DNA序列数据库）序列数据库）中筛选、扩增获得中筛选、扩增获得2、选择载体：细菌质粒和噬菌体、选择载体：细菌质粒和噬菌体3、目标、目标DNA与载体与载体DNA的体外重组的体外重组4、重组、重组DNA引入宿主细胞引入宿主细胞第52页，共63页，编辑于2022年，星期六第5节 微生物菌种保藏及复壮衰退与复壮的概念衰退与复壮的概念 衰退（衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。复壮复壮(rejuvenation)：狭义的复壮狭义的复壮是指在菌种已发生衰退是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种断地从生产中选种第53页，共63页，编辑于2022年，星期六第5节 微生物菌种保藏及复壮 微生物工业对菌种的要求微生物工业对菌种的要求 (1)廉价原料、生长迅速、目的产物产量廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。高。(2)易于控制培养条件，酶活性高；发易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。酵周期较短。(3)抗杂菌和嗜菌体的能力强。抗杂菌和嗜菌体的能力强。(4)菌种纯，不易变异和退化，不产生菌种纯，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。安全生产。第54页，共63页，编辑于2022年，星期六菌种保藏菌种保藏 基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于休眠状态。为地创造条件，使菌种的代谢活动处于休眠状态。要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。尽量使菌种保持原来优良的生产性能。w挑选典型菌种的优良纯种挑选典型菌种的优良纯种 一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）w创造适于微生物长时期休眠的环境条件创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）护剂或酸碱中和剂等）第55页，共63页，编辑于2022年，星期六 保存方法：保存方法：应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。封保藏法。霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。细菌：采用冷冻干燥保藏法。细菌：采用冷冻干燥保藏法。放线菌：沙土或冷冻保藏法。放线菌：沙土或冷冻保藏法。第56页，共63页，编辑于2022年，星期六菌种保藏的方法 菌菌 连续在培养基上（内）移种连续在培养基上（内）移种 种种 生活态生活态 传代培养保藏法传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种连续在活宿主上（内）移种 保保 固体斜面固体斜面 藏藏 湿法湿法 半固体琼脂柱半固体琼脂柱 方方 休眠态休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法法 干法干法 藏在玻璃管内藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上吸附在合适的载体上(河沙、土壤、硅河沙、土壤、硅 胶、滤纸、麸皮胶、滤纸、麸皮)第57页，共63页，编辑于2022年，星期六干法保藏菌种的方法 滴入小试管（在放入大试管干燥器中）滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内藏在玻璃管内 封入安瓿瓶封入安瓿瓶 真空干燥真空干燥 冷冻真空干燥冷冻真空干燥 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体合适的载体 有机基质（麸皮、麦粒）有机基质（麸皮、麦粒）滤纸片滤纸片 薄片状载体薄片状载体 明胶小片明胶小片 血清蛋白乙烯薄膜小片血清蛋白乙烯薄膜小片 第58页，共63页，编辑于2022年，星期六几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类*产孢子微生物各大类36月612月12年110年515年以上简便简便简便简便有效简便、有效第59页，共63页，编辑于2022年，星期六v菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务：广泛收集实验室和生产广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。交换和使用的目的。v常用的菌种保藏机构常用的菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典美国的典型菌种保藏中心型菌种保藏中心(ATCC)第60页，共63页，编辑于2022年，星期六菌种的退化现象：菌种的退化现象：个体或群体特征发生变化；生产能力降个体或群体特征发生变化；生产能力降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力降低。低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力降低。退化的原因退化的原因 1、菌种保藏不妥、菌种保藏不妥;2、菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或、菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件；是失去某些需要的条件；3、经诱变获得的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征的、经诱变获得的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征的情况。情况。第61页，共63页，编辑于2022年，星期六防止菌种退化的措施1、合理育种、合理育种使用单核细胞，避免使用多核细胞使用单核细胞，避免使用多核细胞合理选择诱变剂的种类和剂量合理选择诱变剂的种类和剂量诱变后进行充分的后培养及分离纯化诱变后进行充分的后培养及分离纯化2、选用合适的培养基、选用合适的培养基3、创造良好的培养条件：温度、适度、氧气、创造良好的培养条件：温度、适度、氧气、Ph4、控制传代次数：降低自发突变的几率、控制传代次数：降低自发突变的几率5、用不同类型的细胞移种传代：、用不同类型的细胞移种传代：对丝状微生物而言，通常对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。采用稳定的单核孢子进行接种。孢子代替菌丝，子囊孢子代孢子代替菌丝，子囊孢子代替分生孢子替分生孢子6、采用有效的菌种保藏方法、采用有效的菌种保藏方法第62页，共63页，编辑于2022年，星期六菌种的复壮措施纯种分离纯种分离把仍保持原有优良性状的单细胞分离出来，把仍保持原有优良性状的单细胞分离出来，扩大增殖培养扩大增殖培养寄生型接种于宿主体内生长以提高活力寄生型接种于宿主体内生长以提高活力联合复壮联合复壮高剂量紫外线和低剂量高剂量紫外线和低剂量DTG第63页，共63页，编辑于2022年，星期六