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第二章蛋白质的定性定量分析课件本讲稿第一页，共五十七页 蛋白质定性分析蛋白质定性分析(qualitative analysis)确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质何种蛋白质 蛋白质定量分析蛋白质定量分析(quantitative analysis)确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量成分的含量本讲稿第二页，共五十七页 蛋白质含量的测定方法蛋白质含量的测定方法（重点掌握）（重点掌握）蛋白质相对分子量测定蛋白质相对分子量测定(SDS-PAGE)等电聚焦电泳等电聚焦电泳(IEF)（一般了解）（一般了解）蛋白质的免疫印迹分析蛋白质的免疫印迹分析(western blot)本讲稿第三页，共五十七页第一章第一章 蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定基于蛋白质的基于蛋白质的元素组成特点元素组成特点基于蛋白质的基于蛋白质的化学显色反应化学显色反应基于蛋白质的基于蛋白质的光吸收特性光吸收特性本讲稿第四页，共五十七页 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%本讲稿第五页，共五十七页一、紫外光谱一、紫外光谱(A280)吸收法吸收法 这一方法可用来快速检测溶液中是否含有这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰白质的洗脱峰本讲稿第六页，共五十七页原原 理理 色氨酸、酪氨酸的最大色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在吸收峰在280 nm附近附近 大多数蛋白质含有这两种大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液质溶液280 nm的光吸收值是分的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收本讲稿第七页，共五十七页优优 点点 快速快速缺缺 点点 核酸可引起强干扰作用核酸可引起强干扰作用芳香族氨基酸含量差异可以起误芳香族氨基酸含量差异可以起误差差 对蛋白质无破坏性对蛋白质无破坏性 不是严格的定量，适用于测定蛋不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液白质粗提液 本讲稿第八页，共五十七页计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法 蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260注意事项注意事项 石英比色杯石英比色杯 调零所用溶液调零所用溶液 配制标准蛋白所用溶液配制标准蛋白所用溶液 光密度范围光密度范围本讲稿第九页，共五十七页二、考马斯亮蓝二、考马斯亮蓝G-250检测法检测法 这是一种迅速、可靠的通过染色法测定这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法溶液中蛋白质含量的方法本讲稿第十页，共五十七页原原 理理 该法是基于考马斯亮蓝该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在反应迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量的光吸收值大小计算蛋白的含量本讲稿第十一页，共五十七页所需时间所需时间 10 min优优 点点 快速（反应时间仅需快速（反应时间仅需2 min）敏感，几乎没有蛋白质损失敏感，几乎没有蛋白质损失缺缺 点点 用这种测定方法对蛋白质引起不用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性可逆的变性 对各种纯化蛋白质反应不同对各种纯化蛋白质反应不同本讲稿第十二页，共五十七页计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 反应反应1015 min后开始出现沉淀，后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀件下易发生沉淀 若选用目的蛋白来做标准曲线或用若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确较准确本讲稿第十三页，共五十七页三、三、Lowry检测法检测法 这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用到广泛应用.本讲稿第十四页，共五十七页原原 理理 首先在碱性溶液中形成铜首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂磷钨酸试剂(Folin-酚试剂酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在色的复合物在745 750 nm处有最大的吸收峰，处有最大的吸收峰，颜色的深浅颜色的深浅(吸收值吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据与蛋白质浓度成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量的光吸收值大小计算蛋白质的含量本讲稿第十五页，共五十七页优优 点点 一种可靠的蛋白质定量方法一种可靠的蛋白质定量方法 不同蛋白质之间差别很小不同蛋白质之间差别很小缺缺 点点 某些试剂不稳定某些试剂不稳定 干扰物质多干扰物质多 使蛋白质发生不可逆变性使蛋白质发生不可逆变性本讲稿第十六页，共五十七页计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 在加入试剂在加入试剂30 min后呈色达到饱后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱和，时间延长颜色信号减弱 许多干扰物质降低颜色反应许多干扰物质降低颜色反应 高盐浓度可引起沉淀高盐浓度可引起沉淀本讲稿第十七页，共五十七页四、四、BCA(二喹啉甲酸二喹啉甲酸)检测法检测法 这是近年来新研制的一种改进的这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定测定法法本讲稿第十八页，共五十七页原原 理理 在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2生成络合物，同时将生成络合物，同时将Cu2还原成还原成Cu。而。而BCA试试剂可敏感特异地与剂可敏感特异地与Cu结合，形成稳定的有颜色的结合，形成稳定的有颜色的复合物，在复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量计算蛋白质的含量本讲稿第十九页，共五十七页优优 点点 检测敏感性高检测敏感性高缺缺 点点 蛋白质发生不可逆的变性蛋白质发生不可逆的变性 终产物稳定终产物稳定巯基试剂和去垢剂干扰巯基试剂和去垢剂干扰本讲稿第二十页，共五十七页第二节第二节 蛋白质相对分子量测定蛋白质相对分子量测定分子量测定分子量测定(molecular weight,MW)排阻层析排阻层析沉降平衡超速离心沉降平衡超速离心动态弹性光散射动态弹性光散射孔径梯度电泳孔径梯度电泳质谱质谱(ESI-MS)本讲稿第二十一页，共五十七页一、一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量测定蛋白质的相对分子量1.不连续系统原理不连续系统原理2.SDS-PAGE凝胶的制备凝胶的制备制备分离胶制备分离胶制备浓缩胶制备浓缩胶加样加样装板装板电泳电泳卸板并进行凝胶染色卸板并进行凝胶染色本讲稿第二十二页，共五十七页3.SDS-PAGE基本原理基本原理 SDS 影响迁移率的因素影响迁移率的因素l 十二烷基十二烷基硫硫酸钠酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate)l 十二烷基十二烷基磺磺酸钠酸钠(Sodium Dodecyl Sulfonate)本讲稿第二十三页，共五十七页 SDS作用：作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于与蛋白牢固结合，当其浓度大于1 mmol/L 时，时，SDS与蛋白质的结合比例为与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与得样品中各种蛋白质与SDS形成的形成的SDS-蛋白质复合蛋白质复合物都带有物都带有相同密度的负电荷相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异天然的电荷差异本讲稿第二十四页，共五十七页 SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物分子构型分子构型也几乎相同也几乎相同(雪茄烟雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的，而且具有相同的荷质比荷质比，因此在因此在SDS-PAGE中，中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系对数线性关系 Watch SDS-PAGE原理原理本讲稿第二十五页，共五十七页4.SDS-PAGE测定分子量的操作测定分子量的操作 标准品的选择及处理标准品的选择及处理 待测样品的制备待测样品的制备 电泳分离及染色电泳分离及染色 相对迁移率的计算相对迁移率的计算Watch SDS-PAGE操作操作本讲稿第二十六页，共五十七页Analysis for SDS-PAGE electrophoresis本讲稿第二十七页，共五十七页5.注意事项注意事项 选择合适的胶浓度选择合适的胶浓度 样品中高浓度的阳离子可能会导致样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去 SDS与蛋白质之间的结合程度与蛋白质之间的结合程度 蛋白质的分子量范围蛋白质的分子量范围 15200 KD之间之间v 二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原v 溶液中溶液中SDS的浓度的浓度v 溶液的离子强度溶液的离子强度本讲稿第二十八页，共五十七页 多亚基蛋白质分子量检测多亚基蛋白质分子量检测v 用其它方法测定分子量进行参照用其它方法测定分子量进行参照v SDS和巯基乙醇和巯基乙醇 SDS-PAGE测定的准确性测定的准确性v 电荷异常或构象异常电荷异常或构象异常v 带有较大辅基的蛋白质带有较大辅基的蛋白质v 某些结构蛋白某些结构蛋白本讲稿第二十九页，共五十七页二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量1.基本原理基本原理2.凝胶过滤测定分子量的操作凝胶过滤测定分子量的操作 v 分子筛效应分子筛效应v 洗脱体积与相应分子量的关系洗脱体积与相应分子量的关系装柱装柱平衡平衡加样加样平衡平衡洗脱洗脱收集样品并计算收集样品并计算Ve绘制标准曲线绘制标准曲线本讲稿第三十页，共五十七页本讲稿第三十一页，共五十七页3.注意事项注意事项 柱床表面不能干燥柱床表面不能干燥v 凝胶的选择凝胶的选择 Sephadex 溶胀溶胀v G值的意义值的意义 凝胶柱的再生与保存凝胶柱的再生与保存本讲稿第三十二页，共五十七页第第 三三 节节 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点本讲稿第三十三页，共五十七页等电点等电点(isoelectric point,pI)两性电解质性质两性电解质性质支持介质支持介质(supporting media)Figure of IEF本讲稿第三十四页，共五十七页+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10Isoelectric Focusing本讲稿第三十五页，共五十七页ReadyStripTM IPG Strips310473658710310NL3.95.14.75.95.5-6.76.3-8.3High-purity monomersNarrow ranges for resolution of low-abundance proteinsOverlapping gradients for“cyber gels”Three lengths -7 cm,11 cm and 17 cm -0.5 mm x 3.3 mm本讲稿第三十六页，共五十七页Broad RangepH 3-10Narrow RangepH 4-7Micro RangepH 4.7-5.931044774.75.94.75.9本讲稿第三十七页，共五十七页第四节第四节 蛋白质的免疫印迹分析蛋白质的免疫印迹分析本讲稿第三十九页，共五十七页 印迹技术印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中的是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术介质上并加以检测分析的技术 1975年，年，Edwen Southern提出了提出了分子印迹分子印迹(渍渍)的概念的概念 目前这种技术已被广泛用于目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测和蛋白质的检测本讲稿第四十页，共五十七页印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用 DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析、重组质粒和噬菌体的分析 RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析的定性定量分析 蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究用于蛋白质定性定量及相互作用研究 由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为 免疫免疫印迹技术印迹技术(immunoblotting)本讲稿第四十一页，共五十七页一、免疫印迹分析的应用一、免疫印迹分析的应用 对蛋白质进行定性分析对蛋白质进行定性分析 对蛋白质进行半定量分析对蛋白质进行半定量分析 信号转导分析信号转导分析生物大分子相互作用分析生物大分子相互作用分析本讲稿第四十二页，共五十七页二、免疫印迹分析的基本流程二、免疫印迹分析的基本流程 电泳分离蛋白电泳分离蛋白 转移至固相膜转移至固相膜 封闭非特异结合位点封闭非特异结合位点 与第一抗体温育反应与第一抗体温育反应 与第二抗体交联物温育反应与第二抗体交联物温育反应 显色显色制备蛋白样品制备蛋白样品蛋白质转移蛋白质转移抗体检测抗体检测本讲稿第四十四页，共五十七页免疫印迹操作流程图免疫印迹操作流程图本讲稿第四十五页，共五十七页1.样品的制备样品的制备 组织或细胞中提取组织或细胞中提取v 裂解裂解v 去污剂去污剂(SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20)v 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂(PMSF、EDTA、Pepstatin、Leupeptin、Aprotinin)v 蛋白质的定量蛋白质的定量(Bradford、BCA、Lowry)基因工程表达重组产物基因工程表达重组产物本讲稿第四十六页，共五十七页2.电泳分离电泳分离 SDS-PAGE 非变性非变性PAGE EIF本讲稿第四十七页，共五十七页3.蛋白质的电转移蛋白质的电转移方法：半干法、方法：半干法、湿法湿法 作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上膜上 注意：注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡有任何气泡 ！？！？本讲稿第四十八页，共五十七页常用的蛋白质转移膜常用的蛋白质转移膜种类种类 微孔大小微孔大小 结合能力结合能力 特点特点NC膜膜0.45 um80-100 ug/cm2应用广泛应用广泛 20kD易丢失易丢失PVDF膜膜0.22 um0.45 um80-100 ug/cm2170-200 ug/cm2 20kD不易丢失不易丢失容量大、强度高容量大、强度高尼龙膜尼龙膜480 ug/cm2用于核酸用于核酸本讲稿第四十九页，共五十七页电转移装置电转移装置本讲稿第五十页，共五十七页电转移示意图电转移示意图本讲稿第五十一页，共五十七页电转移装置电转移装置本讲稿第五十二页，共五十七页4.靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测 封闭封闭 对转移膜上的潜在结合位点进行封闭对转移膜上的潜在结合位点进行封闭，防防止抗体非特异性结合在膜上，止抗体非特异性结合在膜上，降低背景颜降低背景颜色色BSA、脱脂奶粉、脱脂奶粉 本讲稿第五十三页，共五十七页本讲稿第五十四页，共五十七页 靶蛋白与第一抗体反应靶蛋白与第一抗体反应 单抗、多抗单抗、多抗 注意：注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；阳性对照可用已免疫前血清、非相关单克隆抗体；阳性对照可用已知靶蛋白等知靶蛋白等 作用：排除假象作用：排除假象本讲稿第五十五页，共五十七页 与第二抗体反应与第二抗体反应 第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋白，第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物质进行标记可用同位素或非同位素物质进行标记 酶标抗体常用酶：酶标抗体常用酶：碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)胶体金标记、胶体金标记、125I标记标记标记标记本讲稿第五十六页，共五十七页 显色显色 AKP可催化底物可催化底物5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸吲哚磷酸(bromochloroindolyl phosphate，BCIP)与氮蓝四唑与氮蓝四唑(niro-blue tetrazolium，NBT)发生反应，产生深蓝色化发生反应，产生深蓝色化合物，显示出蛋白质所在的位置。合物，显示出蛋白质所在的位置。Watch procedure HRP可催化底物显色生成棕色化合物，显示出蛋可催化底物显色生成棕色化合物，显示出蛋白质所在的位置白质所在的位置 本讲稿第五十七页，共五十七页