基因功能分析的基本策略.ppt

基因功能分析的基本策略 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望转基因模型是研究基因功能的主要手段转基因模型是研究基因功能的主要手段z转基因转基因生物：生物：y外源基因导入生物体表达。外源基因导入生物体表达。z基因打靶基因打靶：y外源基因替换内源基因。外源基因替换内源基因。y基因敲除。基因敲除。y基因敲入。基因敲入。z基因沉默基因沉默：y导入特定基因，抑制内源性基因表达。导入特定基因，抑制内源性基因表达。第一节第一节 转基因技术转基因技术z转基因技术转基因技术(transgenic technology)：将外将外源基因导入细胞，随机整合到受体基因组内，源基因导入细胞，随机整合到受体基因组内，并随细胞分裂而遗传给后代。并随细胞分裂而遗传给后代。y细胞模型。细胞模型。y转基因动物。转基因动物。y转基因植物。转基因植物。一一.转基因生物的意义转基因生物的意义z20 世纪世纪 80 年代年代(Brinster and Palmiter)：y著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。z转基因生物的用途：转基因生物的用途：y研究手段：疾病的转基因动物模型。研究手段：疾病的转基因动物模型。y改良动物性状：抗病性、耐寒性等。改良动物性状：抗病性、耐寒性等。y生产产品：抗体、疫苗等的生产。生产产品：抗体、疫苗等的生产。二、基本原理二、基本原理z构建携带目的基因的载体。构建携带目的基因的载体。z外源基因导入外源基因导入：将目的基因通过显微注射等：将目的基因通过显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中。细胞中。z使使目的基因整合目的基因整合到基因组中。到基因组中。z将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中。动物的输卵管或子宫中。z使其发育成携带外源基因的转基因动物。使其发育成携带外源基因的转基因动物。基本原理基本原理供体基因供体基因供体基因供体基因受体的受精卵受体的受精卵受体的受精卵受体的受精卵基本原理基本原理转基因的受精卵转基因的受精卵转基因的受精卵转基因的受精卵基本原理基本原理转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物基本过程基本过程上游上游基因改造和载体构建基因改造和载体构建中游中游基因转移、胚胎移植与建系基因转移、胚胎移植与建系下游下游基因整合、表达的检测与细胞筛选基因整合、表达的检测与细胞筛选1.1.上游上游基因改造和载体构建基因改造和载体构建外源基因外源基因外源基因外源基因:完整的转录单位完整的转录单位完整的转录单位完整的转录单位,由顺式作用元件、结由顺式作用元件、结由顺式作用元件、结由顺式作用元件、结构基因和转录终止信号组成。构基因和转录终止信号组成。构基因和转录终止信号组成。构基因和转录终止信号组成。报告基因报告基因报告基因报告基因(reporter gene):(reporter gene):在表达载体中引入易于在表达载体中引入易于在表达载体中引入易于在表达载体中引入易于检测的提示重组体存在的基因。检测的提示重组体存在的基因。检测的提示重组体存在的基因。检测的提示重组体存在的基因。GFPGFP、LacZ LacZ、APAP、LUCLUC。融合基因融合基因融合基因融合基因(fusion gene):(fusion gene):将特定的目的基因与报告将特定的目的基因与报告将特定的目的基因与报告将特定的目的基因与报告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完整的转录单位。整的转录单位。整的转录单位。整的转录单位。动物转基因常用的载体动物转基因常用的载体z腺病毒载体腺病毒载体 z逆转录病毒载体逆转录病毒载体 z非病毒类载体：如质粒等。非病毒类载体：如质粒等。2.中游中游基因转移、胚胎移植与建系基因转移、胚胎移植与建系基因导入技术：物理、化学和生物学方法基因导入技术：物理、化学和生物学方法 1)显微注射法显微注射法（microinjection)2)胚胎干细胞法（胚胎干细胞法（embryonic stem cells,ES细胞）细胞）3)逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法 4)精子载体法精子载体法1)DNA显微注射法显微注射法z制备超量受精卵。制备超量受精卵。zDNA 显微注射。显微注射。z转移注射卵到输卵管或子宫。转移注射卵到输卵管或子宫。z转基因鼠的鉴定及鼠系建立。转基因鼠的鉴定及鼠系建立。DNA 显微注射显微注射持卵管持卵管持卵管持卵管DNADNA注射针注射针注射针注射针精原核精原核精原核精原核卵原核卵原核卵原核卵原核DNA 显微注射显微注射zDNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵显微注射到尚未发生核融合的受精卵的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原核大，容易辨别。核大，容易辨别。z线性线性 DNA 整合效率比超螺旋整合效率比超螺旋 DNA 高出数高出数倍，因而用于显微注射的转入基因通常是倍，因而用于显微注射的转入基因通常是去除载体序列的线状去除载体序列的线状 DNA。DNA 显微注射法的特点显微注射法的特点DNA 大小无限制，最大可达大小无限制，最大可达 250Kb。随机整合：在染色体上整合的位点是随随机整合：在染色体上整合的位点是随机的，整合的拷贝数也不一定。机的，整合的拷贝数也不一定。转入的基因有可能碰巧整合到具有重转入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干扰该基因的正要功能的基因之中，干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢。和代谢。总效率较低总效率较低(实际成功率实际成功率1/1000)。提高显微注射提高显微注射 DNA 表达的成功率表达的成功率z转入的外源基因要能够高效表达，最好是可转入的外源基因要能够高效表达，最好是可以诱导表达。以诱导表达。z转入基因中应该包含有帮助提高整合效率的转入基因中应该包含有帮助提高整合效率的序列，如微卫星序列。序列，如微卫星序列。微卫星序列微卫星序列微卫星序列微卫星序列微卫星序列微卫星序列微卫星序列微卫星序列诱导表达诱导表达诱导表达诱导表达启动子启动子启动子启动子外源基因外源基因外源基因外源基因2)胚胎干细胞法胚胎干细胞法z胚胎干细胞胚胎干细胞(embryo stem cells,ES 细胞细胞)：y可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他类型细胞的能力。类型细胞的能力。zES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分化特性。化特性。胚胎干细胞法胚胎干细胞法z分离和培养分离和培养 ES 细胞。细胞。z外源基因导入外源基因导入 ES 细胞。细胞。z导入外源基因的导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。细胞的子宫转移。z转基因鼠的鉴定及鼠系建立。转基因鼠的鉴定及鼠系建立。胚胎干细胞的分离和培养胚胎干细胞的分离和培养胚泡胚泡胚泡胚泡培养皿中分离培养皿中分离培养皿中分离培养皿中分离胚泡内层细胞胚泡内层细胞胚泡内层细胞胚泡内层细胞胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶消化解离消化解离消化解离消化解离加饲养层细胞培养加饲养层细胞培养加饲养层细胞培养加饲养层细胞培养胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞的分离和培养胚胎干细胞的分离和培养胚胎干细胞外源胚胎干细胞外源 DNA 的导入的导入DNADNA胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞囊胚囊胚囊胚囊胚 原囊胚原囊胚原囊胚原囊胚 转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物磷酸钙磷酸钙磷酸钙磷酸钙-DNA-DNA 共沉淀法共沉淀法共沉淀法共沉淀法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法微注射微注射微注射微注射外源外源 DNA 的整合的整合用于用于 ES 细胞的细胞的 DNA 载体一般带有定点整载体一般带有定点整合元件合元件,避免了随机整合。避免了随机整合。定点整合位点应选择在基因组内编码非必定点整合位点应选择在基因组内编码非必需产物的地方，以减少整合对细胞正常功需产物的地方，以减少整合对细胞正常功能的影响。能的影响。定点整合位点必须在基因组的可以进行转定点整合位点必须在基因组的可以进行转录的地方。录的地方。胚胎干细胞法的特点胚胎干细胞法的特点定点整合。定点整合。ES 细胞在体外培养，外源细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可导入后可用正用正-负选择法筛选择正确整合的负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞细胞,相对较简单。相对较简单。目前只在小鼠身上获得成功目前只在小鼠身上获得成功。3）逆转录病毒感染法）逆转录病毒感染法z逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建获得四获得四/八细胞胚胎八细胞胚胎/囊胚囊胚/原肠胚原肠胚外源外源 DNA 导入早期胚胎：导入早期胚胎：获得病毒颗粒感染早期胚胎获得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养包装细胞与早期胚胎共培养感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育成携带外源基因的动物。成携带外源基因的动物。逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法外源基因外源基因外源基因外源基因逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒感染逆转录病毒感染逆转录病毒感染逆转录病毒感染四四四四/八细胞胚胎八细胞胚胎八细胞胚胎八细胞胚胎/囊胚囊胚囊胚囊胚/原肠胚原肠胚原肠胚原肠胚嵌合小鼠嵌合小鼠嵌合小鼠嵌合小鼠纯合体小鼠纯合体小鼠纯合体小鼠纯合体小鼠逆转录病毒感染法的特点逆转录病毒感染法的特点z通过病毒通过病毒 DNA 插入宿主插入宿主 DNA 的机制，将外的机制，将外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率高。源目的基因整合到宿主基因组，整合效率高。z反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(10kb)。z对家禽类的转基因研究有重要意义。对家禽类的转基因研究有重要意义。4）精子载体法）精子载体法外源外源外源外源 DNA DNA精子精子精子精子 卵细胞卵细胞卵细胞卵细胞 受精卵受精卵受精卵受精卵 转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物共育法共育法共育法共育法脂质体转染法脂质体转染法脂质体转染法脂质体转染法电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法DNA精子精子受精卵受精卵受精卵受精卵DNADNA卵细胞卵细胞卵细胞卵细胞DNADNA胚胎干细胞胚胎干细胞DNADNA逆转录病毒感染逆转录病毒感染逆转录病毒感染逆转录病毒感染磷酸钙磷酸钙磷酸钙磷酸钙-DNA-DNA-DNA-DNA共沉淀法共沉淀法共沉淀法共沉淀法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法四细胞四细胞四细胞四细胞胚胎胚胎胚胎胚胎囊胚囊胚囊胚囊胚原肠胚原肠胚原肠胚原肠胚转基因转基因转基因转基因动物动物动物动物微注射微注射微注射微注射显微注射显微注射显微注射显微注射3.3.下游下游基因整合与表达检测及筛选基因整合与表达检测及筛选染色体基因水平：是否整合了外源基因以染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。及整合的位点和拷贝数。转录水平：转基因的转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以的存在与否以及表达水平。及表达水平。蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。能检测。鉴定方法鉴定方法PCRSouthern blot染色体原位杂交染色体原位杂交Northern blotRT-PCRWestern blot基因转移鼠纯合鼠系的建立基因转移鼠纯合鼠系的建立 转基因杂合鼠转基因杂合鼠转基因杂合鼠转基因杂合鼠未转基因未转基因未转基因未转基因鼠鼠鼠鼠生殖系细胞中不生殖系细胞中不生殖系细胞中不生殖系细胞中不含转入基因含转入基因含转入基因含转入基因生殖系细胞中含生殖系细胞中含生殖系细胞中含生殖系细胞中含转入基因转入基因转入基因转入基因子代多次交配可得到纯合子代多次交配可得到纯合子代多次交配可得到纯合子代多次交配可得到纯合转基因鼠系转基因鼠系转基因鼠系转基因鼠系三、转基因动物的应用三、转基因动物的应用n分析动物表型与外源基因的关系，揭示外分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能。源基因的功能。n建立人类疾病的转基因动物模型。建立人类疾病的转基因动物模型。n基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。人类疾病的转基因动物模型人类疾病的转基因动物模型z完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。z为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。效的系统。z转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段。转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段。人类疾病的转基因动物模型人类疾病的转基因动物模型z各种人类遗传病的鼠模型，如：各种人类遗传病的鼠模型，如：各种人类遗传病的鼠模型，如：各种人类遗传病的鼠模型，如：y老年性痴呆症老年性痴呆症老年性痴呆症老年性痴呆症(Alzheimersdisease)(Alzheimersdisease)、y关节炎关节炎关节炎关节炎(arthritis)(arthritis)、y肌肉营养缺乏症肌肉营养缺乏症肌肉营养缺乏症肌肉营养缺乏症(muscular distrophy)(muscular distrophy)、y肿瘤发生肿瘤发生肿瘤发生肿瘤发生(tumorigenesis)(tumorigenesis)、y高血压高血压高血压高血压(hypertension)(hypertension)、y神经退行性疾病神经退行性疾病神经退行性疾病神经退行性疾病(neurodegenenerative disorder)(neurodegenenerative disorder)、y内分泌功能障碍内分泌功能障碍内分泌功能障碍内分泌功能障碍(endocrinological(endocrinological disfunction)disfunction)、y动脉硬化症及其他很多疾病。动脉硬化症及其他很多疾病。动脉硬化症及其他很多疾病。动脉硬化症及其他很多疾病。利用转基因动物反应器生产药用蛋白利用转基因动物反应器生产药用蛋白z转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物反应器等。生物反应器等。z抗凝血酶抗凝血酶 III：转基因绵羊的乳汁中。：转基因绵羊的乳汁中。z乳球蛋白乳球蛋白z红细胞生成素红细胞生成素z凝血因子凝血因子 VIIIz凝血因子凝血因子 IXz生长激素生长激素转基因改良移植器官转基因改良移植器官z改造异种来源器官的遗传性状，使之适应改造异种来源器官的遗传性状，使之适应于人体器官或组织的移植。于人体器官或组织的移植。z1997 年起，利用遗传改良的转基因猪肝做年起，利用遗传改良的转基因猪肝做为严重肝病患者的离体生命支持物。为严重肝病患者的离体生命支持物。动物的克隆动物的克隆z1996 1996 年，首次实现动物的无性生殖。年，首次实现动物的无性生殖。年，首次实现动物的无性生殖。年，首次实现动物的无性生殖。z由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供细胞质发育而来。细胞质发育而来。细胞质发育而来。细胞质发育而来。z核移植技术（核移植技术（核移植技术（核移植技术（Nuclear Transfer)Nuclear Transfer)核移植技术（核移植技术（Nuclear Transfer)第二节第二节 基因打靶基因打靶基因打靶基因打靶(Gene Targeting)：通过：通过 DNA 定定点同源重组，改变基因组中的某一特定基点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究此基因的功能。因，在生物活体内研究此基因的功能。基因敲除基因敲除(gene knockout):将某个基因定向将某个基因定向去除。去除。基因敲入基因敲入(gene knockin):定向将一段基因定向将一段基因序列替代另一段基因序列。序列替代另一段基因序列。一、基因打靶的基本程序一、基因打靶的基本程序z打靶载体的构建。打靶载体的构建。z打靶载体导入打靶载体导入 ES 细胞及其鉴定。细胞及其鉴定。z基因敲除基因敲除 ES 细胞注射入胚泡。细胞注射入胚泡。z胚泡植入假孕小鼠的子宫。胚泡植入假孕小鼠的子宫。z嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。1.打靶载体的构建打靶载体的构建同源基因片段同源基因片段同源基因片段同源基因片段质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体HB1HB1 HB2HB2neoneor r基因基因基因基因HSV-tkHSV-tk基因基因基因基因2.打靶载体导入打靶载体导入ES细胞细胞磷酸钙磷酸钙-DNA 共沉淀法共沉淀法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法电穿孔法电穿孔法脂质体转染法脂质体转染法显微注射法显微注射法打靶载体的正打靶载体的正-负选择负选择z与整合位点两端区域同源的两段与整合位点两端区域同源的两段 DNA 序列序列(HB1和和HB2)。z目的基因。目的基因。z编码抗编码抗 G418 的新霉素磷酸转移酶基因（的新霉素磷酸转移酶基因（neor基因）。基因）。z2个不同的胸苷激酶基因（个不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和和HSV-tk2），分别来自），分别来自I 型型II型单纯疱疹病毒。型单纯疱疹病毒。打靶载体的正筛选打靶载体的正筛选 tk1 HB1 tk1 HB1 neoneor r HB2 tk2 HB2 tk2载体载体载体载体载体载体载体载体同源重组同源重组同源重组同源重组neoneor rG418G418正筛选，细胞存活正筛选，细胞存活正筛选，细胞存活正筛选，细胞存活染色体染色体染色体染色体染色体染色体染色体染色体打靶载体的负筛选打靶载体的负筛选 tk1 HB1 tk1 HB1 neoneor r HB2 tk2 HB2 tk2染色体染色体染色体染色体染色体染色体染色体染色体非特异性整合非特异性整合非特异性整合非特异性整合 GCVGCV负筛选，细胞死亡负筛选，细胞死亡负筛选，细胞死亡负筛选，细胞死亡PCR 鉴定鉴定z在打靶载体的在打靶载体的 HB1 和和 HB2 之间，加上一个之间，加上一个载体和鼠的基因组中都没有的独特载体和鼠的基因组中都没有的独特DNA 序序列（列（US）。）。z如发生随机整合，如发生随机整合，PCR 无法扩增出预期的无法扩增出预期的DNA 片段。片段。z如果整合于特定位点时，则如果整合于特定位点时，则 PCR 可以扩增可以扩增出预期大小的片段。出预期大小的片段。PCR 鉴定：特异整合鉴定：特异整合 tk1 HB1 US neor HB2 tk2P2P2P1P1PCRPCR反应有特异条带反应有特异条带反应有特异条带反应有特异条带特异整合特异整合特异整合特异整合基因敲除小鼠的获得基因敲除小鼠的获得z基因敲除基因敲除ES细胞注射入胚泡细胞注射入胚泡z胚泡植入假孕小鼠的子宫胚泡植入假孕小鼠的子宫z嵌合体的杂交育种：同源重组只发生在一嵌合体的杂交育种：同源重组只发生在一条染色体上，因而同源重组后只能得到嵌条染色体上，因而同源重组后只能得到嵌合体，将嵌合体杂交，即可得到纯合子。合体，将嵌合体杂交，即可得到纯合子。基因敲除和基因敲除和 RNA 干扰干扰z基因敲除是在基因水平将某个基因定点去除，基因敲除是在基因水平将某个基因定点去除，动物整体水平。动物整体水平。zRNA 干扰不是敲除基因，而是诱导干扰不是敲除基因，而是诱导 RNA 的的特异性降解，干扰基因的表达。一般是在细特异性降解，干扰基因的表达。一般是在细胞水平。胞水平。第三节第三节 RNA 干扰干扰z1990 年，年，Jorgense 等通过等通过 转基因改造牵牛转基因改造牵牛花颜色。花颜色。z外源基因不但不能加深花的颜色，反而造成外源基因不但不能加深花的颜色，反而造成内源基因表达的降低。内源基因表达的降低。RNA 干扰是干扰是dsRNA 导致的导致的基因沉默基因沉默z1998 年，年，Fire 等等在在 C.elegans 中用中用 antisense RNA 抑制基因表达。抑制基因表达。yds RNA 比比 sense 或或 antisense RNA 都好都好。y注射甚至口服注射甚至口服 dsRNA 都能诱发基因沉默。都能诱发基因沉默。y很少量的双链很少量的双链 RNA 就能诱发就能诱发 C.elegans 整整体的基因沉默，甚至能传递到子一代。体的基因沉默，甚至能传递到子一代。zRNA 干扰：干扰：RNA interference(RNAi)RNAi 是真核生物中广泛存在的现象是真核生物中广泛存在的现象植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白(GFP)(GFP)基因基因基因基因被抑制，显露出红色。被抑制，显露出红色。被抑制，显露出红色。被抑制，显露出红色。线虫：左侧为线虫：左侧为线虫：左侧为线虫：左侧为 GFP GFP 转基因线虫；右侧线虫则经转基因线虫；右侧线虫则经转基因线虫；右侧线虫则经转基因线虫；右侧线虫则经 GFP dsRNA GFP dsRNA 处理。部分细胞处理。部分细胞处理。部分细胞处理。部分细胞 RNAi RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。Hela Hela 细胞：经细胞：经细胞：经细胞：经 ORC6 siRNA ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象作用后，细胞出现多核现象作用后，细胞出现多核现象作用后，细胞出现多核现象。绿色为绿色为绿色为绿色为 tubulin tubulin，红色为红色为红色为红色为 DNA DNA。ORC6 ORC6 细胞分裂调控蛋白。细胞分裂调控蛋白。细胞分裂调控蛋白。细胞分裂调控蛋白。果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA shRNA 造成的色素缺乏的造成的色素缺乏的造成的色素缺乏的造成的色素缺乏的缺陷型。缺陷型。缺陷型。缺陷型。RNA 干扰干扰zRNA RNA 干扰干扰干扰干扰：双链：双链：双链：双链 RNA RNA 诱导的同源诱导的同源诱导的同源诱导的同源 mRNA mRNA 降解降解降解降解。zRNA RNA 干扰技术可以干扰技术可以干扰技术可以干扰技术可以用于基因敲除，选用于基因敲除，选用于基因敲除，选用于基因敲除，选择性关闭特定细胞择性关闭特定细胞择性关闭特定细胞择性关闭特定细胞基因。基因。基因。基因。siRNA 的产生的产生zzDicerDicer：RNase III RNase III 的一种，可降解的一种，可降解的一种，可降解的一种，可降解 dsRNA dsRNA 成成成成 siRNA siRNA。zzShort interfering RNA(siRNA)Short interfering RNA(siRNA)：2123nt 2123nt siRNA 诱导同源序列的降解诱导同源序列的降解zRNA-Induced Silencing Complexzz产生两种后果：产生两种后果：产生两种后果：产生两种后果：yy同源同源同源同源 mRNA mRNA 的降解。的降解。的降解。的降解。yy同源同源同源同源 mRNA mRNA 翻译受阻。翻译受阻。翻译受阻。翻译受阻。基因沉默的机制是多方面的基因沉默的机制是多方面的zdsRNA 造成的造成的 mRNA 降解。降解。Post-translational gene silencingzdsRNA 造成同源性基因的甲基化和表达关闭。造成同源性基因的甲基化和表达关闭。zdsRNA 造成染色质结构变化。造成染色质结构变化。zdsRNA 对蛋白质的合成产生影响。对蛋白质的合成产生影响。RNAi 和基因敲除和基因敲除z在基因组在基因组 DNA 上，通过同源重组进行的基因上，通过同源重组进行的基因敲除。敲除。z在在 mRNA 水平进行的基因敲除：水平进行的基因敲除：yAntisense oligonucleotidesyRibozymeyRNA interference：dsRNA；siRNA；shRNAdsRNA 能够诱发细胞的抗病毒反应能够诱发细胞的抗病毒反应z在哺乳动物存在干扰素相关的抗病毒体系。在哺乳动物存在干扰素相关的抗病毒体系。zdsRNA 激活激活 dsRNA-dependent protein kinase(PKR)，进一步诱导非序列依赖的内源，进一步诱导非序列依赖的内源性性 RNA 降解。降解。z在胚胎期细胞，上述非特异的抗病毒体系尚未在胚胎期细胞，上述非特异的抗病毒体系尚未形成。通过形成。通过 dsRNA 可以诱导序列特异的可以诱导序列特异的 RNAi。siRNA 与与 shRNAz 30bp siRNA 30bp siRNA 可以可以可以可以诱导诱导诱导诱导 RNAi RNAi，并克，并克，并克，并克服哺乳细胞的障碍。服哺乳细胞的障碍。服哺乳细胞的障碍。服哺乳细胞的障碍。zShort hairpin RNAShort hairpin RNA：(shRNA)(shRNA)z可达成稳定的基因可达成稳定的基因可达成稳定的基因可达成稳定的基因敲除。敲除。敲除。敲除。shRNA 表达载体系统表达载体系统miRNA 表达载体系统表达载体系统siRNA 设计原则设计原则zsiRNA antisense siRNA antisense 链链链链 5 5 端稳定性较低时具有更好的效端稳定性较低时具有更好的效端稳定性较低时具有更好的效端稳定性较低时具有更好的效率。率。率。率。y必要时必要时必要时必要时采用专业软件进行设计采用专业软件进行设计采用专业软件进行设计采用专业软件进行设计。z采用多个采用多个采用多个采用多个 siRNA siRNA 片段片段片段片段，并筛选其中最有效的。，并筛选其中最有效的。，并筛选其中最有效的。，并筛选其中最有效的。y有时有时有时有时 siRNA siRNA 的干扰效果只表现在蛋白水平。的干扰效果只表现在蛋白水平。的干扰效果只表现在蛋白水平。的干扰效果只表现在蛋白水平。z尽可能使用较低的尽可能使用较低的尽可能使用较低的尽可能使用较低的 siRNA siRNA 浓度，以保证其特异性。浓度，以保证其特异性。浓度，以保证其特异性。浓度，以保证其特异性。z设立补救试验可进一步确认设立补救试验可进一步确认设立补救试验可进一步确认设立补救试验可进一步确认 RNAi RNAi 与效果之间的关系。与效果之间的关系。与效果之间的关系。与效果之间的关系。shRNA 与与 siRNA 应用的局限应用的局限z在某些细胞的特定状态下，在某些细胞的特定状态下，在某些细胞的特定状态下，在某些细胞的特定状态下，shRNA shRNA 或或或或 siRNA siRNA 仍能够仍能够仍能够仍能够诱发细胞的抗病毒反应。诱发细胞的抗病毒反应。诱发细胞的抗病毒反应。诱发细胞的抗病毒反应。zmiRNA miRNA 在与其靶基因在与其靶基因在与其靶基因在与其靶基因 mRNA mRNA 不完全匹配的情况下仍不完全匹配的情况下仍不完全匹配的情况下仍不完全匹配的情况下仍能够诱发能够诱发能够诱发能够诱发 RNAi RNAi。yy在有在有在有在有 14bp 14bp 匹配的情况下就能够诱发干扰。匹配的情况下就能够诱发干扰。匹配的情况下就能够诱发干扰。匹配的情况下就能够诱发干扰。zsiRNA siRNA 可在翻译水平发挥作用，有研究发现，它能够可在翻译水平发挥作用，有研究发现，它能够可在翻译水平发挥作用，有研究发现，它能够可在翻译水平发挥作用，有研究发现，它能够造成大量蛋白翻译的降低。造成大量蛋白翻译的降低。造成大量蛋白翻译的降低。造成大量蛋白翻译的降低。shRNA 与与 siRNA 的比较的比较zsiRNAsiRNAy应用非常方便，干扰效力往往比较高。应用非常方便，干扰效力往往比较高。应用非常方便，干扰效力往往比较高。应用非常方便，干扰效力往往比较高。y只能进行达成只能进行达成只能进行达成只能进行达成瞬时瞬时瞬时瞬时的基因表达抑制。的基因表达抑制。的基因表达抑制。的基因表达抑制。在线虫和植物，在线虫和植物，在线虫和植物，在线虫和植物，siRNA siRNA 可扩增，但哺乳细胞不能。可扩增，但哺乳细胞不能。可扩增，但哺乳细胞不能。可扩增，但哺乳细胞不能。zshRNAshRNAy前期工作比较复杂。前期工作比较复杂。前期工作比较复杂。前期工作比较复杂。y可以进行可以进行可以进行可以进行稳定稳定稳定稳定的基因表达抑制。的基因表达抑制。的基因表达抑制。的基因表达抑制。