第八章液相色谱精选文档.ppt

第八章液相色谱本讲稿第一页，共五十五页第一节第一节 高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介第二节第二节 高效液相色高效液相色谱谱的的类类型型 第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪第四节第四节 高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相第五节第五节 液相色谱流动相液相色谱流动相 第六节第六节 高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器 第八章 高效液相色谱法本讲稿第二页，共五十五页第一节第一节高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介本讲稿第三页，共五十五页 高高效效液液相相色色谱谱法法是是19641965年年开开始始发发展展起来的一项新颖快速的分离分析技术。起来的一项新颖快速的分离分析技术。它它是是在在经经典典液液相相色色谱谱法法的的基基础础上上，引引入入了了气气相相色色谱谱的的理理论论，在在技技术术上上采采用用了了高高压压泵泵、高高效效固固定定相相和和高高灵灵敏敏度度检检测测器器后后，发发展展成成为为高高分分离离速速度度、高高分分离离效效率率、高高检检测测灵灵敏敏度度的的高效液相色谱法。也称现代液相色谱法。高效液相色谱法。也称现代液相色谱法。概述：概述：本讲稿第四页，共五十五页 共同点：共同点：高高效效液液相相色色谱谱是是在在气气相相色色谱谱高高速速发发展展的的情情况况下下发发展展起起来来的的，它它们们之之间间在在理理论论上上和和技技术术上上有有许许多多共共同同点。点。（1）色谱的基本理论是一致的；）色谱的基本理论是一致的；（2）定性定量原理完全一样；）定性定量原理完全一样；（3）均均可可应应用用计计算算机机控控制制色色谱谱操操作作条条件件和和色色谱谱数数据的处理程序，自动化程度高。据的处理程序，自动化程度高。液相色谱和气相色谱的异同点：液相色谱和气相色谱的异同点：本讲稿第五页，共五十五页1.流动相差别流动相差别2.固定相差别固定相差别3.使用范围更广使用范围更广4.4.在原理和结构方面有差异在原理和结构方面有差异 因因液液相相色色谱谱的的流流动动相相是是液液体体，其其粘粘度度比比气气体体大大100100倍倍以以上上，扩扩散散系系数数比比气气体体小小10102 210105 5倍倍；因因此此溶溶质质分分子子与与液液体体流流动动相相之之间间的的作作用用力力不不能能忽忽略略，致致使使液液相相色谱与气相色谱有以下的差别：色谱与气相色谱有以下的差别：二者的差异：二者的差异：液相与气相差异液相与气相差异本讲稿第六页，共五十五页流动相：气相色谱为气体、液相色谱为液体。流动相：气相色谱为气体、液相色谱为液体。以以液液体体作作流流动动相相，液液体体分分子子与与样样品品分分子子间间的的作作用用力力不不能能忽忽略略；液液体体种种类类多多，性性质质差差别别大大，水水溶溶液液或或有有机机溶溶剂剂，极极性性或或非非极极性性化化合合物物，可可供供选选择择的的范范围围广广。是是控控制制柱柱效效和和分分离离效效率率的的重重要因素之一。要因素之一。使使高高效效液液相相色色谱谱除除了了固固定定相相的的选选择择外外，增增加了一个可供选择的重要的操作参数。加了一个可供选择的重要的操作参数。液相与气相差异液相与气相差异1.1.流动相差别流动相差别本讲稿第七页，共五十五页 气气相相色色谱谱固固定定相相多多为为固固体体吸吸附附剂剂或或在在担担体体表表面面上上涂涂渍渍一一层层高高沸沸点点有有机机液液体体而而成成的的液液体体固固定定相相、近近年年才才出出现现一一些些化化学学键键合合相相，粒粒度度粗粗(100(100250250m)m)，吸附等温线多是非线性的，成本较低。，吸附等温线多是非线性的，成本较低。高高效效液液相相色色谱谱固固定定相相大大都都是是新新型型的的固固体体吸吸附附剂剂或或化化学学键键合合相相，粒粒度度小小(3(31010m)m)，分分配配等等温温线线多多是是线线性性的的，峰峰形形对对称称，成成本本较较高高，发发现现容容量量大，分析型色谱柱最大容量可达大，分析型色谱柱最大容量可达50mg50mg以上。以上。液相与气相差异液相与气相差异2.2.固定相差别固定相差别本讲稿第八页，共五十五页 气气相相色色谱谱分分析析是是沸沸点点在在500500以以下下、分分子子量量少少于于450450的的物物质质。对对热热稳稳定定性性差差、易易于于分分解解变变质质，或或具具有有生生理理活活性性的的物物质质，都都不不能能用用升升温温气气化化的的方方法法分分析析。气气相相色色谱谱只只能能分分析析约约占占有有机机物物总总数数15%15%20%20%的物质。的物质。高高效效液液相相色色谱谱在在室室温温或或接接近近室室温温条条件件下下工工作作，可可分分析析沸沸点点在在500500以以上上、分分子子量量450450以以上上的的有有机机物物质质，约约占占总总数数的的80%80%85%85%。高高效效液液相相色色谱谱的的使使用用范范围围远远远远超超过气相色谱。过气相色谱。液相与气相差异液相与气相差异3.使用范围广本讲稿第九页，共五十五页 高压液相色谱仪具有高压输液泵和输液高压液相色谱仪具有高压输液泵和输液系统，其检测器的检测原理和结构与气相系统，其检测器的检测原理和结构与气相色谱也有较大差异。色谱也有较大差异。高效液相色谱和气相色谱在功能方面高效液相色谱和气相色谱在功能方面各有所长、相互补充。各有所长、相互补充。在高效液相色谱广泛应用的同时，气在高效液相色谱广泛应用的同时，气相色谱仍然发挥着它的重要作用。相色谱仍然发挥着它的重要作用。液相与气相差异液相与气相差异4.在原理和结构方面的不同本讲稿第十页，共五十五页一、液液色谱法，一、液液色谱法，二、液固色谱法，二、液固色谱法，三、离子交换色谱法三、离子交换色谱法四、排阻色谱。四、排阻色谱。第二节第二节 高效液相色谱的类型高效液相色谱的类型本讲稿第十一页，共五十五页一、液液色谱法一、液液色谱法 涂涂渍渍固固定定相相，将将某某些些固固定定液液涂涂渍渍在在惰惰性性担担体体的的表表面面；涂涂渍渍的的固固定定相相，固固定定液液易易于于流流失失，柱柱子子寿寿命命短短，分分离离的的重重现现性性和和分分离离效效果果好好，是是目目前前固固定相的发展方向。定相的发展方向。化化学学键键合合固固定定相相，把把化化学学基基团团与与惰惰性性担担体体反反应应，使使其其以以共共价价键键的的形形式式结结合合在在担担体体表表面面上上。柱子性质稳定、寿命长。柱子性质稳定、寿命长。又称液液分配色谱。又称液液分配色谱。1 1、液液色谱固定相的形式，两种：、液液色谱固定相的形式，两种：本讲稿第十二页，共五十五页 不不同同溶溶质质在在两两个个液液相相中中，有有不不同同的的分分配配系系数数。化化学学键键合合相相的的液液液液色色谱谱，分分配配机机理理和和吸吸附附机机理理同同时时存存在在。为为了了防防止止色色谱谱分分离离过过程程中中两两相相的的混混溶溶，流流动动相相与与固固定定相相的极性必须不同。的极性必须不同。2 2、分离原理、分离原理 当当固固定定相相为为极极性性时时，流流动动相相为为非非极极性性溶溶剂剂，此此时时组组分分流流出出先先后后的的顺顺序序是是非非极极性性向向极极性性过过度度，称称为为正正相相色色谱。谱。固固定定相相为为非非极极性性，用用极极性性溶溶剂剂作作流流动动相相，组组分分的的流流出出顺顺序是极性组分先流出，称为序是极性组分先流出，称为反相色谱反相色谱。3 3、正相色谱和反相色谱、正相色谱和反相色谱本讲稿第十三页，共五十五页 固固定定相相与与正正相相色色谱谱或或反反相相色色谱谱相相同同，流流动动相相是是含含有有适适当当有有机机反反离离子子的的溶溶剂剂，它它能能与与组组分分生生成成离离子子对对，称称为为正正相相离离子子对对色色谱谱或或反反相相离离子子对对色色谱谱。离离子子对对色色谱谱，可以分析离子型或可离解的化合物。可以分析离子型或可离解的化合物。4、液液色谱的一种特殊形式液液色谱的一种特殊形式 离子对色谱离子对色谱本讲稿第十四页，共五十五页二、液固色谱二、液固色谱也称液固吸附色谱液固吸附色谱 1、固定相：、固定相：以固体吸附剂如硅胶，各种微球硅珠，以固体吸附剂如硅胶，各种微球硅珠，氧化镁，氧化铝，活性炭，聚酰胺等作为固定相。吸附剂氧化镁，氧化铝，活性炭，聚酰胺等作为固定相。吸附剂粒度约粒度约20205050m m或或35357575m m左右，比液液色谱固定左右，比液液色谱固定相相(3(31010m)m)的粒度大。的粒度大。2、分离原理：、分离原理：吸附剂表面与溶质分子中功能团的吸吸附剂表面与溶质分子中功能团的吸附与解吸作用，是溶质分子与溶剂分子对固定相的竞争吸附与解吸作用，是溶质分子与溶剂分子对固定相的竞争吸附的能力差异。附的能力差异。溶剂的极性强弱对分离和分析速度影响很大，液溶剂的极性强弱对分离和分析速度影响很大，液固色谱主要用来分析具有极性官能团、且极性不太固色谱主要用来分析具有极性官能团、且极性不太强的化合物。强的化合物。本讲稿第十五页，共五十五页 吸吸附附剂剂对对同同系系物物的的选选择择分分离离能能力力小小，对对不不同同族族化化合合物物的选择分离能力强。主要用于按族分离化合物。的选择分离能力强。主要用于按族分离化合物。溶溶质质分分子子在在吸吸附附剂剂活活性性中中心心上上的的吸吸附附能能力力与与分分子子的的几几何何形形状状有有关关，液液固固色色谱谱对对异异构构体体有有高高的的选选择择性性，能能分分离离几几何何异异构构体体(顺顺反反异异构构体体)和和同同分分异异构构体体(不同取代位不同取代位)。缺缺点点:重重复复性性差差。对对流流动动相相的的含含水水量量须须严严格格控控制制，方方能能获获得得有有重重复复性性的的保保留留值值。每每次次分分析析后后，特特别别是是作作梯梯度度洗洗脱时，色谱柱再生的时间很长，耗费溶剂多。脱时，色谱柱再生的时间很长，耗费溶剂多。3 3、液固色谱分离特点、液固色谱分离特点本讲稿第十六页，共五十五页三、离子交换色谱三、离子交换色谱 1 1、固定相：、固定相：为带有电荷官能团的离子交换剂，并为带有电荷官能团的离子交换剂，并存在带相同电荷数的相反离子存在带相同电荷数的相反离子反离子。根据分离反离子。根据分离离子的不同而采用阳离子交换剂离子的不同而采用阳离子交换剂(-SO(-SO3 3-等基团等基团)或阴或阴离子交换剂离子交换剂(-N(CH(-N(CH3 3)3 3+等等)。2 2、机机理理：流流动动相相中中被被分分析析的的离离子子与与反反离离子子之之间间发发生生竞竞争吸附。根据吸附能力不同将物质分离。争吸附。根据吸附能力不同将物质分离。离子交换色谱主要用于分离能解离为离子的化合离子交换色谱主要用于分离能解离为离子的化合物，如无机离子、核酸、氨基酸等。物，如无机离子、核酸、氨基酸等。本讲稿第十七页，共五十五页交换剂交换剂R+Y-交换剂交换剂R+Y-X-X-交换吸附交换吸附 交交换换剂剂R R+的的反反离离子子Y Y-是是阴阴离离子子的的为为阴阴离离子子交交换换色色谱谱。交交换换剂剂R R-带带负负电电荷荷，其其反反离离子子Y Y+为阳离子的称为阳离子交换色谱。为阳离子的称为阳离子交换色谱。离子交换色谱的吸附示意离子交换色谱的吸附示意本讲稿第十八页，共五十五页四、凝胶色谱四、凝胶色谱 也称排阻色谱、空间排阻色谱等。凝胶色谱是也称排阻色谱、空间排阻色谱等。凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种色谱技术。基于分子大小不同而进行分离的一种色谱技术。1 1、固固定定相相：凝凝胶胶。是是一一种种表表面面惰惰性性，含含有有许许多多不不同同尺尺寸寸孔孔穴穴或或立立体体网网状状结结构构的的物物质质。凝凝胶胶的的孔孔穴穴大大小小应应与与被被分分离离组组分分的的大大小小基基本本相当。相当。本讲稿第十九页，共五十五页2 2、分分离离原原理理：当当试试样样随随流流动动相相在在凝凝胶胶外外的的间间隙隙和和凝凝胶胶空空穴穴中中流流动动时时，分分子子体体积积大大的的不不能能渗渗透透到到凝凝胶胶孔孔穴穴中中去去，随随流流动动相相快快速速流流出出。中中等等大大小小的的分分子子，能能选选择择性性地地渗渗透透到到部部分分孔孔穴穴中中去去，流流出出稍稍慢慢。分分子子体体积积小小的的，则则渗渗透透到到凝凝胶胶内内部部的的孔孔穴穴深深处处中中，移出困难，被冲洗出来的速度慢。移出困难，被冲洗出来的速度慢。分分子子越越小小，在在孔孔穴穴的的渗渗透透越越深深，流流出出越越慢慢。这这样样，各各组分按分子大小先后从柱中流出。组分按分子大小先后从柱中流出。本讲稿第二十页，共五十五页 3 3、应用：、应用：凝胶色谱主要是分离和鉴定高分子凝胶色谱主要是分离和鉴定高分子量的化合物。对于分子量高达量的化合物。对于分子量高达150000000150000000的特大分的特大分子的混合物也可进行分离和鉴定。子的混合物也可进行分离和鉴定。凝胶颗粒的微孔直径大小可根据分析的要求加以凝胶颗粒的微孔直径大小可根据分析的要求加以选择。其孔径的线性范围不同，可以用于分离不同分选择。其孔径的线性范围不同，可以用于分离不同分子量范围的组分。子量范围的组分。凝胶色谱在生物样品凝胶色谱在生物样品(蛋白质、酶、核酸等蛋白质、酶、核酸等)与高分子与高分子化合物的化学分析中有重要的应用价值。化合物的化学分析中有重要的应用价值。本讲稿第二十一页，共五十五页第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 现现代高效液相色代高效液相色谱仪谱仪，在复，在复杂杂程度及各程度及各种部件的功能上都有很大的差种部件的功能上都有很大的差别别。仪器的基仪器的基本结构可分为：本结构可分为：液相输送系统，进样系统，色液相输送系统，进样系统，色谱分离系统与检测记录数据处理系统谱分离系统与检测记录数据处理系统等四部分。等四部分。本讲稿第二十二页，共五十五页液相色谱仪的结构示意图液相色谱仪的结构示意图馏分馏分收集器收集器高压高压输液泵输液泵贮液器贮液器梯度洗脱装置梯度洗脱装置液液相相输输送送系系统统进进样样阀阀进样系统进样系统色色谱谱柱柱色色谱谱分分离离系系统统检测记检测记 录系统录系统 检测器检测器记录仪记录仪本讲稿第二十三页，共五十五页一、液相输送系统一、液相输送系统 液相输送系统包括：液相输送系统包括：贮液槽、高压泵贮液槽、高压泵，有的，有的还配备有还配备有梯度洗脱装置梯度洗脱装置。1 1、贮液槽：、贮液槽：贮存流动相，容量为贮存流动相，容量为0 0.5 51L1L。流流动动相相必必须须脱脱气气，除除去去溶溶解解在在流流动动相相中中的的空空气气，以以防防止止溶溶解解的的空空气气在在检检测测池池内内形形成成气气泡泡，引引起起基基线线漂漂移，或不规则的噪音。移，或不规则的噪音。脱脱气气的的方方法法：(1)(1)超超声声波波振振动动脱脱气气，(2)(2)加加热热沸沸腾回流脱气腾回流脱气 (3)(3)真空脱气。真空脱气。本讲稿第二十四页，共五十五页 高高压压输输液液泵泵的的作作用用是是输输送送恒恒定定流流量量的的流流动动相相。按输液特性可分为：恒流泵和恒压泵。按输液特性可分为：恒流泵和恒压泵。(1)(1)恒恒流流泵泵 主主要要优优点点是是始始终终输输送送恒恒定定流流量量的的液液体体，与与柱柱压压力力的的大大小小和和压压力力的的变变化化无无关关。因因此此，保保留留值值的的重重复复性性好好，基基线线稳稳定定，能能满满足足高高精精度度分分析和梯度洗脱的要求。析和梯度洗脱的要求。2.2.高压输液泵高压输液泵本讲稿第二十五页，共五十五页 恒流泵的主要类型为：恒流泵的主要类型为：柱塞式柱塞式往复泵。往复泵。该该泵泵的的主主要要优优点点：输输液液连连续续，流流速速与与色色谱谱系系统统的的压压力力无无关关，泵泵室室的的体体积积很很小小(几几微微升升到到几几十十微微升升)。适适用用于于梯梯度度洗洗脱脱和和再再循循环环洗洗脱脱，清清洗洗方方便便，更更换换溶剂容易。溶剂容易。缺缺点点：输输送送有有脉脉动动的的液液流流，液液流流不不稳稳定定，引引起起基基线线噪噪声声。克克服服的的方方法法是是在在泵泵和和色色谱谱柱柱间间串串入一根盘状阻尼管，使液流平稳。入一根盘状阻尼管，使液流平稳。本讲稿第二十六页，共五十五页 恒恒压压泵泵通通过过采采用用适适当当的的气气动动装装置置，使使高高压压惰惰性性气气体体直直接接加加压压于于流流动动相相，输输出出无无脉脉动动的的液液流流。也也称称为为气气动动泵泵。这这种种泵泵简简单单价价廉廉，但但流流速速不不如如恒恒流流泵泵精精确确稳稳定定。只只适适用用于于对流速精度要求不高的分析或作为装填色谱柱用泵。对流速精度要求不高的分析或作为装填色谱柱用泵。恒恒压压泵泵的的优优点点：容容易易获获得得高高压压，没没有有脉脉冲冲，流流速速范围大。范围大。缺缺点点：受受系系统统压压力力变变化化的的影影响响大大，保保留留值值重重复复性性较较差差，不不适适于于梯梯度度洗洗脱脱操操作作。泵泵体体积积较较大大，更更换换溶溶剂剂麻麻烦烦、耗费量大耗费量大。（2 2）恒压泵）恒压泵本讲稿第二十七页，共五十五页 洗脱装置有两种工作方式：洗脱装置有两种工作方式：一一种种是是以以两两台台或或多多台台高高压压泵泵将将不不同同的的溶溶剂剂吸吸入入混混合合室室，在在高高压压下下混混合合，然然后后进进入入色色谱谱柱柱。优优点点是是通通过过电电子子器器件件分分别别程程序序控控制制两两台台或或多多台台输输液液泵泵的的流流量量，就就可可以以获获得得任任何何一一种种形形式式的的淋淋洗洗浓度曲线。缺点混合多种溶剂，需要多台高压泵。浓度曲线。缺点混合多种溶剂，需要多台高压泵。另另一一种种是是以以一一台台高高压压泵泵通通过过多多路路电电磁磁阀阀控控制制各各路路吸吸入入的的流流量量,同同时时吸入几种溶剂，经混合后送到色谱柱，这样只要一台高压泵。吸入几种溶剂，经混合后送到色谱柱，这样只要一台高压泵。3.3.梯度洗脱装置梯度洗脱装置 指在分离过程中，随时间函数程序的改变，流动相的指在分离过程中，随时间函数程序的改变，流动相的组成也逐渐改变，即流动相的强度组成也逐渐改变，即流动相的强度(极性，极性，pHpH，离子强度，离子强度等等)逐渐改变。逐渐改变。本讲稿第二十八页，共五十五页 包包括括：进进样样口口、注注射射器器、六六通通阀阀和和定定量量管管等。等。它的作用是把样品有效的送入色谱柱中。它的作用是把样品有效的送入色谱柱中。进进样样系系统统是是柱柱外外效效应应的的重重要要来来源源之之一一，为为了了减减少少对对板板高高的的影影响响，避避免免由由柱柱外外效效应应而而引引起起峰峰展展宽宽，对对进进样样口口要要求求死死体体积积小小，没没有有死死角角，能能够够使使样样品品象象塞子一样进入色谱柱。塞子一样进入色谱柱。二、二、进样系统进样系统本讲稿第二十九页，共五十五页 包括：色谱柱，柱温箱和连接阀等。包括：色谱柱，柱温箱和连接阀等。色色谱谱柱柱 色色谱谱柱柱包包括括柱柱管管和和固固定定相相两两部部分分。柱柱材材料料要要求求耐耐高高温温，内内壁壁光光滑滑，管管内内径径均均匀匀，无无条条纹纹或或微孔等；最常用的是不锈钢管。微孔等；最常用的是不锈钢管。柱柱温温箱箱 柱柱温温是是液液相相色色谱谱的的重重要要操操作作参参数数。在在较较高高的的柱柱温温下下操操作作的的优优点点：1.1.能能增增加加样样品品在在流流动动相相中中的的溶溶解解度度，缩缩短短分分析析时时间间，柱柱温温升升高高66，组组分分保保留留时时间间约约减减少少30%30%；2.2.减减少少传传质质阻阻力力，增增加加柱柱效效；3.3.降降低流动相粘度，在相同流量下，降低柱压。低流动相粘度，在相同流量下，降低柱压。液相色谱常用柱温范围为室温液相色谱常用柱温范围为室温6565。三、三、色谱分离系统色谱分离系统本讲稿第三十页，共五十五页 四、检测记录数据系统四、检测记录数据系统包括：检测器、记录仪和微型数据处理机。包括：检测器、记录仪和微型数据处理机。常用的检测器为：示差折光检测器，紫外常用的检测器为：示差折光检测器，紫外吸收检测器，荧光检测器，二极管阵列检测吸收检测器，荧光检测器，二极管阵列检测器等。器等。记录和数据处理系统与气相色谱仪相记录和数据处理系统与气相色谱仪相同。同。本讲稿第三十一页，共五十五页一、液一、液-固色谱固定相固色谱固定相二、二、液液色谱固定相液液色谱固定相三、三、离子交换剂固定相离子交换剂固定相四、凝胶色谱固定相四、凝胶色谱固定相第四节第四节 高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相本讲稿第三十二页，共五十五页 是是以以硅硅胶胶为为基基体体的的各各种种类类型型的的硅硅珠珠。主主要要有有全全多多孔孔微粒型硅珠、多孔层硅珠和堆积型硅珠。微粒型硅珠、多孔层硅珠和堆积型硅珠。1 1、全全多多孔孔硅硅珠珠，最最初初使使用用的的是是粒粒度度303070m70m的的全全多多孔硅珠，比表面孔硅珠，比表面积积大大约约100100400m400m2 2/g/g。优优点点：孔孔径径大大而而深深，粒粒度度大大，易易于于装装柱柱；比比表表面面积积大大、柱容量大，允柱容量大，允许较许较大大进样进样量；制作工量；制作工艺简单艺简单，成本也低，成本也低。缺点：缺点：孔径深，孔径深，传质传质阻力大，柱效不高。阻力大，柱效不高。现现在在多多用用粒粒度度为为5 510m10m的的全全多多孔孔微微粒粒型型硅硅珠珠，在在柱柱效或柱容量方面都有大大提高。效或柱容量方面都有大大提高。一、液一、液-固色谱固定相固色谱固定相本讲稿第三十三页，共五十五页 2 2、多多孔孔层层硅硅珠珠：也也称称表表面面多多孔孔硅硅珠珠或或薄薄壳壳硅硅珠珠。它它是是在在粒粒度度为为30305050m m的的硅硅珠珠表表面面上上，覆覆盖一层多孔性基质，厚度为盖一层多孔性基质，厚度为1 12 2m m。优优点点：孔孔浅浅，传传质质阻阻力力小小，柱柱效效较较高高；流流动动性性好好，可用于干法装柱。可用于干法装柱。缺缺点点：比比表表面面积积小小，只只有有1 120m20m2 2/g/g，样样品品容容量量小，易发生过载现象。只适用于高灵敏度检测器。小，易发生过载现象。只适用于高灵敏度检测器。液液-固色谱固定相固色谱固定相本讲稿第三十四页，共五十五页 3 3、堆堆积积型型硅硅珠珠：将将颗颗粒粒极极细细的的硅硅珠珠经经一一定定工工艺，凝聚成艺，凝聚成5 51010m m的堆积硅珠。的堆积硅珠。优优点点：粒粒度度分分布布窄窄、粒粒径径接接近近，比比表表面面积积大大，柱柱渗渗透透性小，柱效高，压力低。性小，柱效高，压力低。缺点：制造工艺复杂，价格昂贵。缺点：制造工艺复杂，价格昂贵。微粒型全多孔硅珠和堆积型硅珠具有传质快，柱效微粒型全多孔硅珠和堆积型硅珠具有传质快，柱效高，容量大的优点，已成为液固色谱常用的固定相，高，容量大的优点，已成为液固色谱常用的固定相，普遍取代了多孔层硅珠。普遍取代了多孔层硅珠。液液-固色谱固定相固色谱固定相本讲稿第三十五页，共五十五页不同土壤，不同磷源30 mm二、二、液液色谱固定相液液色谱固定相 主主要要为为化化学学键键合合固固定定相相。以以硅硅珠珠为为基基质质，利利用用硅硅珠珠表表面的硅醇基团与键合基反应加工而成。面的硅醇基团与键合基反应加工而成。优点是：优点是：1 1、在在表表面面键键合合了了有有机机物物基基团团，消消除除了了表表面面的的吸吸附附活活性性点，使表面更均一。点，使表面更均一。2 2、可可以以通通过过改改变变键键合合不不同同的的有有机机分分子子基基团团来来改改变变选选择择性。性。3.3.柱柱效效高高，固固定定液液不不流流失失，提提高高了了柱柱子子的的稳稳定定性性和使用寿命。和使用寿命。4.4.由由于于牢牢固固的的化化学学键键，能能耐耐各各种种溶溶剂剂，有有利利于于梯梯度度淋洗和样品的回收。淋洗和样品的回收。本讲稿第三十六页，共五十五页三、三、离子交换剂固定相离子交换剂固定相 离子交换剂固定相的基质有两种类型：一种是以硅胶离子交换剂固定相的基质有两种类型：一种是以硅胶微球；另一类是苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物。微球；另一类是苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物。强酸性阳离子交换树脂的交换基为磺酸基，弱酸性的羧强酸性阳离子交换树脂的交换基为磺酸基，弱酸性的羧基。基。强碱性的阴离子交换树脂基为季铵盐，弱碱性的为强碱性的阴离子交换树脂基为季铵盐，弱碱性的为-NH(R)-NH(R)2 2CICI。主要类型：薄壳玻珠苯磺酸、薄壳玻珠乙基苯主要类型：薄壳玻珠苯磺酸、薄壳玻珠乙基苯磺酸、薄壳玻珠丙氨基丙酸、堆积硅珠丙氨基丙磺酸、薄壳玻珠丙氨基丙酸、堆积硅珠丙氨基丙酸、薄壳玻珠丙基苄基二甲胺氯等。酸、薄壳玻珠丙基苄基二甲胺氯等。本讲稿第三十七页，共五十五页按化学类型可分为软性，半软性，刚性凝胶。按化学类型可分为软性，半软性，刚性凝胶。软软性性凝凝胶胶在在高高的的流流速速下下会会被被压压缩缩，并并会会从从柱柱末末端端挤压出来，只适用于低流速的液相色谱。挤压出来，只适用于低流速的液相色谱。半半软软性性凝凝胶胶可可用用于于高高效效液液相相色色谱谱，但但压压力力不不能能超超过过150kg/cm150kg/cm2 2。刚刚性性凝凝胶胶为为多多孔孔硅硅胶胶，它它们们近近于于纯纯的的SiOSiO2 2,其其孔孔径径按按不不同同方方法法形形成成。多多孔孔硅硅胶胶表表面面上上有有酸酸性性基基团团，能能与某些样品作用，需进行表面处理。与某些样品作用，需进行表面处理。四、凝胶色谱固定相四、凝胶色谱固定相本讲稿第三十八页，共五十五页在液相色谱中，许多溶剂都可用作流动相。在液相色谱中，许多溶剂都可用作流动相。第五节、液相色谱流动相第五节、液相色谱流动相一、对流动相的要求一、对流动相的要求1.1.对色谱柱、固定相和分离组分要有惰性。对色谱柱、固定相和分离组分要有惰性。2.2.对样品有较大的溶解度。对样品有较大的溶解度。3.3.对所选用的检测器没有干扰。对所选用的检测器没有干扰。4.4.粘度小。粘度小。5.5.纯度高，成本低，容易清洗，沸点合适，纯度高，成本低，容易清洗，沸点合适，以利于回收分离样品。以利于回收分离样品。6.6.毒性要小，稳定性要好。毒性要小，稳定性要好。本讲稿第三十九页，共五十五页 1 1、流流动动相相对对检检测测器器的的影影响响。如如用用紫紫外外检检测测器器时时，要要求求流流动动相相在在紫紫外外区区吸吸收收很很弱弱。采采用用示示差差折折光光仪仪时时，流流动动相相的的折折光光指指数数要要与与样样品品组组分分的的折折光指数有较大差别。光指数有较大差别。2 2、流流动动相相的的粘粘度度小小，分分析析组组分分在在流流动动相相中中的的扩扩散散系系数数大大，减减少少了了传传质质阻阻力力。如如流流动动相相粘粘度度增增加加，不不仅仅柱柱效效降降低低，而而且且渗渗透透性性下下降降，分分析析时时间增加。间增加。对流动相的要求对流动相的要求注：注：本讲稿第四十页，共五十五页 在在液液相相色色谱谱中中一一般般固固定定相相不不容容易易改改变变(色色谱谱柱柱固固定定)。常用改变流动相的强度或极性来提高分离效率。常用改变流动相的强度或极性来提高分离效率。溶溶剂剂极极性性的的大大小小，可可用用溶溶剂剂强强度度E E0 0来来表表示示，溶溶剂剂强强度度的的顺顺序序称称为为洗洗脱脱序序列列，与与溶溶剂剂的的洗洗脱脱能能力力大大致致相相符符。工工作作中中，可可以以溶溶剂剂洗洗脱脱序序列列为为依依据据，正正确确的的选选择择一一定定强强度度的的溶剂，以解决色谱分离。溶剂，以解决色谱分离。溶溶剂剂的的极极性性也也可可用用溶溶解解度度参参数数d d 表表示示，它它是是静静电电力力、诱导力、色散力和氢健力等的总效应。诱导力、色散力和氢健力等的总效应。二、溶剂强度二、溶剂强度本讲稿第四十一页，共五十五页常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序溶溶剂剂正正戊戊烷烷正正己己烷烷环环己己烷烷四四氯氯化化碳碳苯苯乙乙醚醚氯氯仿仿二二氯氯甲甲烷烷四四氢氢呋呋喃喃二二氧氧六六烷烷丙丙酮酮醋醋酸酸乙乙酯酯乙乙腈腈甲甲醇醇水水强强度度E00.000.010.010.180.320.38 0.400.420.450.560.560.580.650.951.00小小大大溶溶解解度度7.17.38.28.69.27.49.19.69.19.89.48.6 11.8 12.921参数参数d d 与与E E0 0略有差异略有差异本讲稿第四十二页，共五十五页三、液固色谱流动相的选择三、液固色谱流动相的选择 主主要要考考虑虑：溶溶剂剂的的强强度度、溶溶剂剂的的组组成成、适适当当控控制溶剂的含水量。制溶剂的含水量。四、液液色谱流动相的选择四、液液色谱流动相的选择 正正相相色色谱谱：在在非非极极性性的的流流动动相相中中，加加入入极极性性改改性性剂剂如如甲甲醇醇、四四氢氢呋呋喃喃、氯氯仿仿等等，通通过过改改变变溶溶剂剂的的强强度来使组分分离。度来使组分分离。反反相相色色谱谱：用用水水与与强强溶溶剂剂甲甲醇醇、乙乙腈腈以以适适当当比比例例混混合合，再再适适当当配配上上其其它它溶溶剂剂，结结合合梯梯度度洗洗脱脱技技术术，可可使使复杂的组分分离。复杂的组分分离。离离子子对对色色谱谱：改改变变反反离离子子的的浓浓度度，控控制制各各组组分分的分配系数来使组分分离。的分配系数来使组分分离。本讲稿第四十三页，共五十五页五、离子交换色谱流动相的选择五、离子交换色谱流动相的选择 1、pH值值，pH值值对对交交换换基基团团和和样样品品组组分分的的离离解解度度都都有有显显著著影影响响。增增加加pH值值，样样品品的的正正电电性性降降低低，在在阳阳离离子子色色谱谱上上保保留留值值下下降，在阴离子色谱上保留值增加。降，在阴离子色谱上保留值增加。2、离离子子强强度度，流流动动相相的的离离子子强强度度越越大大，洗洗脱脱能能力力越越强、组分的保留时间越短。强、组分的保留时间越短。3、缓缓冲冲液液类类型型，不不同同离离子子因因电电荷荷数数、离离子子半半径径、离离子子的的溶溶剂剂化化特特性性不不同同，与与交交换换基基团团的的作作用用力力不不同同、洗洗脱脱能能力力也也不不同。同。阳离子交换能力：阳离子交换能力：Ba2+K+NH4+Li+H+。阴阴离离子子：OHOH-SOSO42-柠柠檬檬酸酸根根 酒酒石石酸酸根根 NONO3-POPO43-醋醋酸酸根根 ClCl-。本讲稿第四十四页，共五十五页 1、粘粘度度，高高粘粘度度将将限限制制扩扩散散，降降低低组组分分的分离度。的分离度。2、溶溶剂剂对对样样品品组组分分的的溶溶解解能能力力，使使用用的的溶溶剂剂既既要要能能溶溶解解样样品品，又又要要与与凝凝胶胶的的性性质质极极为为相相似似，这这样样才才能能润润湿湿凝凝胶胶、防防止止凝凝胶胶对对样样品组分的吸附作用。品组分的吸附作用。六、凝胶色谱流动相的选择六、凝胶色谱流动相的选择本讲稿第四十五页，共五十五页 检检测测器器联联接接在在液液相相色色谱谱柱柱的的出出口口上上。样样品品在在色色谱谱柱柱中中被被分分离离后后，随随同同流流动动相相连连续续的的流流经经检检测测器器，检检测测器器根根据据流流动动相相中中组组分分的的量量或或组组分分的的浓浓度度输输出出一一个个信信号号，来来定定量量表表示示被被测测组组分分含含量量或或浓浓度度的的变变化化，最最终终得得到到样样品品中中各个组分的含量。各个组分的含量。第六节、高效液相色谱检测器第六节、高效液相色谱检测器 检检测测器器是是色色谱谱分分析析工工作作中中，定定性性、定定量量分分析的主要工具。析的主要工具。本讲稿第四十六页，共五十五页 对对检检测测器器的的要要求求：灵灵敏敏度度高高、重重复复性性好好、响响应应快快、峰峰形形好好、线线性性范范围围广广、对对流流量量和和温温度度的的变变化不敏感。化不敏感。应应用用最最广广泛泛的的是是紫紫外外吸吸收收检检测测器器、示示差差折折光光检测器、荧光检测器、二极管阵列检测器等。检测器、荧光检测器、二极管阵列检测器等。本讲稿第四十七页，共五十五页 紫紫外外吸吸收收检检测测器器（UVUV）的的作作用用原原理理和和结结构构与与常常用用的的紫紫外外可可见见分分光光光光度度计计基基本本相相同同，仪仪器器结结构构的的主主要要区区别别是是将将吸吸收收池池改改为为流流动动池池。流流动动吸吸收收池池的的体体积积一一般般只只有有5 51515l l，光光程程长长1cm1cm左左右右，以以适适应应高高效液相色谱进样量小，柱外谱带展宽小的要求。效液相色谱进样量小，柱外谱带展宽小的要求。一、紫外吸收检测器一、紫外吸收检测器本讲稿第四十八页，共五十五页 示示差差折折光光检检测测器器(RI)(RI)是是利利用用连连续续测测定定参参比比池池与与样品池中溶液折射率变化来测量样品浓度。样品池中溶液折射率变化来测量样品浓度。示示差差折折光光检检测测器器的的优优点点是是：通通用用性性强强。使使用用的的普普及及程程度度仅仅次次于于紫紫外外吸吸收收检检测测器器。缺缺点点是是：灵灵敏敏度度不不高高，不不能能进进行行痕痕量量分分析析；对对溶溶剂剂的的变变化化非非常常敏敏感感，不不适适用用于于梯梯度度洗洗脱脱；对对温温度度的的变变化化也也非非常常敏敏感感，使使用用中中必必须须将将温温度度保保持持在在给给定定温度温度0.0010.001的范围内；对流量的变化不太敏感。的范围内；对流量的变化不太敏感。二、示差折光检测器二、示差折光检测器本讲稿第四十九页，共五十五页 荧荧光光检检测测器器(FD)(FD)的的作作用用和和结结构构与与荧荧光光分分光光光光度度计基本相同。计基本相同。区区别别：吸吸收收池池改改为为流流动动池池。流流动动池池的的体体积积一一般般只只有有5 515L15L，光光程程长长1cm1cm，以以适适应应高高效效液液相相色色谱谱进进样样量小，柱外谱带展宽小的要求。量小，柱外谱带展宽小的要求。荧光检测器的优点是选择性好荧光检测器的优点是选择性好(具有相同激发波长具有相同激发波长和发射波长的物质是很少的和发射波长的物质是很少的)，灵敏度高，灵敏度高(大多数情况大多数情况下皆优于紫外吸收检测器下皆优于紫外吸收检测器)，但线性范围较窄，应用不，但线性范围较窄，应用不普遍。普遍。三、三、荧光检测器荧光检测器本讲稿第五十页，共五十五页四、二极管阵列检测器四、二极管阵列检测器 本本质质是是紫紫外外吸吸收收检检测测器器。检检测测器器的的光光路路特特点点：氘氘灯灯发发出出的的紫紫外外光光，经经消消色色差差透透镜镜系系统统聚聚焦焦后后进进入入流流通通池池，吸吸收收后后的的透透过过光光，经经全全息息衍衍射射光光栅栅色色散散后后，由由光光电二极管组成的阵列所检测。电二极管组成的阵列所检测。这这种种检检测测器器是是一一种种反反光光路路系系统统：光光先先通通过过吸吸收收池池，再再色色散散，全全部部阵阵列列在在很很短短的的时时间间内内即即可可扫扫描描读读数数一一次次；这这种种高高速速的的数数据据收收集集保保证证了了流流出出峰峰不不变变形形。只只有有测测暗暗电电流流的的快快门门是是移移动动部部件件，其其余余皆皆固固定定不不动动，保保证证了了测测定定结结果果的的重重复复性性和可靠性。和可靠性。本讲稿第五十一页，共五十五页 二二极极管管阵阵列列检检测测器器配配有有解解读读软软件件，可可为为每每一一样样品品提提供供极极为为丰丰富富的的色色谱谱与与光光谱谱信信息息(时时间间、波波长长、吸吸光光度度的的三三维维信信息息直直观观图图)，对对未未分分离离的的峰峰也也可可进进行行定定量量分分析析；可可协协助助进进行行色色谱谱峰峰的的定定性性，样样品品组组分分纯纯度度的的测测定定等等，缺缺点点：造价高，一次性投资大。造价高，一次性投资大。四、二极管阵列检测器（续）四、二极管阵列检测器（续）本讲稿第五十二页，共五十五页 五、其它类型检测器五、其它类型检测器 高效液相色谱检测器还有其它高效液相色谱检测器还有其它类型，如：质谱检测器、电导检测类型，如：质谱检测器、电导检测器、红外检测器等在各个不同领域器、红外检测器等在各个不同领域都有一定程度的应用。都有一定程度的应用。本讲稿第五十三页，共五十五页本讲稿第五十四页，共五十五页本讲稿第五十五页，共五十五页