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传统生化制药存在的问题第三章第三章 基因工程制药基因工程制药教学目标教学目标：掌握基因工程制备生物药物的基本原理、基本技术。：掌握基因工程制备生物药物的基本原理、基本技术。教学要求教学要求：了解了解基因工程的概念、基本操作过程和主要用途；基因工程的概念、基本操作过程和主要用途；理解理解基因基因工程制药的特点和基因工程药物主要种类；工程制药的特点和基因工程药物主要种类；掌握掌握基因工程药物生产的基基因工程药物生产的基本过程，本过程，掌握掌握生物药物目的基因的获得方法，生物药物目的基因的获得方法，掌握掌握药物目的基因的表达药物目的基因的表达方法，方法，掌握掌握基因工程菌的发酵方法及重组蛋白的分离纯化方法。基因工程菌的发酵方法及重组蛋白的分离纯化方法。教学重点教学重点：生物药物目的基因的获得方法、药物目的基因的表达策略、：生物药物目的基因的获得方法、药物目的基因的表达策略、基因工程菌的稳定性及重组药物的分离纯化。基因工程菌的稳定性及重组药物的分离纯化。教学难点教学难点：逆转录法获得药物目的基因、高水平表达策略、产物表达形：逆转录法获得药物目的基因、高水平表达策略、产物表达形式的选择、重组药物的分离纯化。式的选择、重组药物的分离纯化。Contents of chapter 31、基因工程药物生产的基本过程 2、生物药物目的基因的获得 3、药物目的基因的表达 4、基因工程菌的稳定性 GoGoGoGoGoGo5、基因工程菌的发酵工艺 6、基因工程药物的分离纯化 一、重组一、重组DNADNA技术的理论基础技术的理论基础1919世纪中世纪中 孟德尔孟德尔 豌豆杂交试验豌豆杂交试验 遗传因子遗传因子 经典遗传学经典遗传学2020世纪初世纪初 摩尔根摩尔根 果蝇杂交实验果蝇杂交实验 基因基因 基因学基因学19441944年年 艾弗瑞艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验 遗传物质遗传物质DNADNA 分子遗传学分子遗传学19531953年年 沃森沃森-克瑞克克瑞克 DNADNA双螺旋结构双螺旋结构 分子生物学分子生物学19731973年年 伯格伯格-杰克森杰克森-考恩考恩-鲍耶鲍耶 DNADNA分子体外拼接分子体外拼接 基因工程基因工程3.1 基因工程药物生产的基本过程 二、重组二、重组DNADNA技术的基本定义技术的基本定义 将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的性状的DNADNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。体外操作程序，也称为分子克隆技术。供体、受体、载体是重组供体、受体、载体是重组DNADNA技术的三大基本元技术的三大基本元件。件。基因工程的基本用途基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源。息资源。设计、构建生物的新性状甚至新物种。设计、构建生物的新性状甚至新物种。大规模生产生物活性物质。大规模生产生物活性物质。五、基因工程药物的主要种类五、基因工程药物的主要种类1 1、免疫性蛋白免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体；：如各种抗原和单克隆抗体；2 2、细胞因子细胞因子：如各种干扰素、白细胞介素、集落刺：如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、表皮生长因子、凝血因子；激因子、表皮生长因子、凝血因子；3 3、激素激素：如胰岛素、生长激素、心钠素；：如胰岛素、生长激素、心钠素；4 4、酶类酶类：如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维：如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。六、基因工程药物生产基本过程六、基因工程药物生产基本过程获得目的基因获得目的基因 构建重组质粒构建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）构建基因工程菌（或细胞）培养工程菌培养工程菌 产物分离、纯化产物分离、纯化 产品加工、检验等产品加工、检验等 上上 游游 阶阶 段段 首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大转入大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。的难易。下下 游游 阶阶 段段 将实验室成果产业化、商品化，主要包括工将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。机的优化控制等。七、基因工程技术生产药物的优点七、基因工程技术生产药物的优点1 1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障；为临床使用提供有效保障；2 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；范围；3 3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4 4、内源生理活性物质作为药物使用时存在的不足之处，、内源生理活性物质作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程进行改造和去除可以通过基因工程进行改造和去除;5 5、利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选、利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。来源。3.2生物药物目的基因的获得 问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？的目的基因，为什么不能进行直接分离？一、逆转录法一、逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转，再反转录成录成cDNA，然后进行，然后进行cDNA 克隆表达。克隆表达。一）逆转录法的基本过程一）逆转录法的基本过程1 1、mRNA purificationmRNA purification a.a.细胞内细胞内RNARNA的组成和含量的组成和含量：DNA:95%DNA:95%核内，核内，5 5细胞细胞器；器；RNARNA：7575细胞质，细胞质，10%10%核内，核内，15%15%细胞器细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%b.b.真核细胞真核细胞mRNA mRNA 的特点及分离纯化方法的特点及分离纯化方法 3-polyA 3-polyA（20-250AAA20-250AAA）-oligo(dT)-oligo(dT)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAAAA AAAAAOligo(dT)纤维素纤维素Poly(A)-Oligo(dT)100mM NaCl洗脱rRNA/tRNA10mM Tris1mM EDTAPoly(A)mRNATotal RNA纤维素柱纯化纤维素柱纯化Poly(A)mRNA Poly(A)mRNA 流程图流程图2 2、cDNAcDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使第一链的合成：一次好的逆转录反应可使oligo(dT)oligo(dT)选出的选出的mRNAmRNA有有5-30%5-30%被拷贝。被拷贝。3 3、cDNAcDNA第二链的合成：第二链的合成：4 4、cDNA cloningcDNA cloning：expression vector pUC expression vector pUC 5 5、将重组体导入、将重组体导入host cellhost cell6 6、cDNA library identification cDNA library identification 7 7、目的、目的cDNA cDNA 克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、起始点等。）测序、确定基因的转录方向、起始点等。）二）反转录人工合成互补二）反转录人工合成互补DNADNAcDNAcDNA法选择性地克隆蛋法选择性地克隆蛋白编码序列；白编码序列；cDNAcDNA法克隆法克隆的目的基因的目的基因很很“纯净纯净”；cDNAcDNA片一般只有片一般只有2-3kb2-3kb或或更小。更小。三）以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆三）以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆1 1获得目的基因和获得目的基因和质粒载体质粒载体；2 2形成重组质粒；形成重组质粒；3 3制制备备感感受受态态细细胞胞，用用重重组组质质粒粒转化大肠杆菌细胞；转化大肠杆菌细胞；4 4培培养养大大肠肠杆杆菌菌，让让重重组组质质粒粒及及外源目的基因形成大量拷贝；外源目的基因形成大量拷贝；5 5筛筛选选含含重重组组质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌细细胞，进行检查或鉴定。胞，进行检查或鉴定。pUC118pUC118质质粒粒的的多多克克隆隆位位点点整整合合在在lacZlacZ基基因因中中，该该位位点点如如果果没没有有插插入入外外源源目目的的基基因因，lacZlacZ基基因因便便可可表表达达出出半半乳乳糖糖苷苷酶酶，如如果果平平板板培培养养基基中中含含有有IPTGIPTG和和X-galX-gal，X-galX-gal便便会会被被半半乳乳糖糖苷苷酶酶水水解解成成兰兰色色，大大肠杆菌形成蓝色克隆。肠杆菌形成蓝色克隆。在多克隆位点插入外源目的基在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了因，破坏了lacZlacZ基因的结构，大肠基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆杆菌形成白色的克隆利用利用lacZlacZ基因的插入失活筛选重组质粒基因的插入失活筛选重组质粒pUC18pUC18还还携携带带了了氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性基因，可筛选重组质粒。性基因，可筛选重组质粒。一般克隆基因的检查和鉴定方法一般克隆基因的检查和鉴定方法琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离鉴鉴定定大大小小不不等的酶解片段等的酶解片段：磷酸基团带负电荷磷酸基团带负电荷酶解片段酶解片段向阳极移动向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率不同迁移率分子量标准参照物分子量标准参照物l 酶酶切和切和电泳方法电泳方法3232P P标记的标记的DNADNA分子探针分子探针杂交杂交放射自显影法放射自显影法l DNADNA杂交直接鉴定杂交直接鉴定四）四）IFN-IFN-目的基因的获得目的基因的获得1 1、hIFNhIFN、的基因都位于第的基因都位于第9 9号染色体；氨基号染色体；氨基酸组成有酸组成有2929以上的同源性；结构和功能相似，以上的同源性；结构和功能相似，结合同一种受体，临床作用也彼此接近。结合同一种受体，临床作用也彼此接近。2 2、IFN YIFN Y的基因位于第的基因位于第1212号染色体，主要作用是号染色体，主要作用是参与免疫调节，并与参与免疫调节，并与IFNIFN、有协同作用。有协同作用。-IFN-IFN的的cDNA cDNA 克隆（参阅：克隆（参阅：P73P73）1 1、人脐血白细胞诱生，制备、人脐血白细胞诱生，制备 mRNA mRNA和和12s mRNA 12s mRNA；2 2、12s mRNA 12s mRNA 反转录合成反转录合成IFN sscDNA IFN sscDNA、dscDNA dscDNA；3 3、IFN dscDNAIFN dscDNA经经TdTTdT酶增补同聚物末端后，克隆在酶增补同聚物末端后，克隆在pBR322pBR322质粒质粒的的Pst IPst I位点上；位点上；4 4、重组、重组DNADNA分子转化分子转化E.coli E.coli；转化子随机分成；转化子随机分成1212组、每组组、每组512512个；个；5 5、从每组转化子中抽提重组质粒、从每组转化子中抽提重组质粒DNADNA，并用，并用12s mRNA 12s mRNA 杂交；杂交；6 6、从阳性杂交分子中回收、从阳性杂交分子中回收mRNAmRNA，在无细胞蛋白合成系统中翻，在无细胞蛋白合成系统中翻译；译；cell-free,protein-synthesizing system 无细胞蛋白合成系统无细胞蛋白合成系统 表达系统之一，此系统含有核糖体、表达系统之一，此系统含有核糖体、tRNAtRNA和各种氨基酸及体外合成多肽所必须的一系列和各种氨基酸及体外合成多肽所必须的一系列蛋白因子，只要加入蛋白因子，只要加入mRNAmRNA即可表达。即可表达。7 7、分别测定各组体外翻译混合物中、分别测定各组体外翻译混合物中IFNIFN的活性；的活性；8 8、将活性最高的克隆组的、将活性最高的克隆组的512512个转化子再随机分成个转化子再随机分成8 8组、每组组、每组6464个；个；9 9、重复、重复5-85-8步操作，最终获得含有人步操作，最终获得含有人-IFN-IFN完整完整cDNAcDNA序列的重组克隆。序列的重组克隆。参见：参见：人白细胞干扰素基因的克隆化及其在大肠杆人白细胞干扰素基因的克隆化及其在大肠杆菌中的表达，侯云德等，中国医学科学院学报，菌中的表达，侯云德等，中国医学科学院学报，1982.121982.12，Vol.4Vol.4，No.8No.8二、化学合成法二、化学合成法 前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNADNA的碱基序列。的碱基序列。限制：（限制：（1 1）不能合成太长的基因。）不能合成太长的基因。（2 2）人工合成基因时，遗传密码的简并）人工合成基因时，遗传密码的简并 会为选择密码子带来很大的困难。会为选择密码子带来很大的困难。（3 3）费用高。）费用高。思考题思考题1 1、名词解释：、名词解释：重组重组DNADNA技术技术 、基因工程。、基因工程。2 2、简述基因工程制药的一般程序。、简述基因工程制药的一般程序。3 3、简述逆转录法获取真核基因的方法。、简述逆转录法获取真核基因的方法。4 4、简述简述获取获取IFNIFN目的基因的方法。目的基因的方法。3.3 药物目的基因的表达（生产工艺原理和特点）克隆蛋白质药物基因的一个主要目的是为了高克隆蛋白质药物基因的一个主要目的是为了高效地表达该基因，从而大量地生产市场原本难以获效地表达该基因，从而大量地生产市场原本难以获得的药物。得的药物。基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。译以及所有加工过程。进行进行基因表达研究基因表达研究时，应综合考虑基因的时，应综合考虑基因的表达表达产量产量、表达产物的、表达产物的稳定性稳定性、产物的、产物的生物学活性生物学活性和表和表达产物的达产物的分离纯化分离纯化等各种因素的影响，建立最佳的等各种因素的影响，建立最佳的基因表达体系基因表达体系。一、宿主细胞的选择一、宿主细胞的选择1 1、宿主细胞应满足的要求宿主细胞应满足的要求 容易获得较高浓度的细胞；容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度；发热量低，需氧低，适当的发酵温度；容易进行代谢调控；容易进行代谢调控；容易进行容易进行DNADNA技术操作；技术操作；产物的产量、产率高，且易提取纯化。产物的产量、产率高，且易提取纯化。2 2、分类分类：第一类为原核细胞，如大肠杆菌等；：第一类为原核细胞，如大肠杆菌等；第二类为真核细胞，如酵母等。第二类为真核细胞，如酵母等。3 3、大肠杆菌表达外、大肠杆菌表达外1 1、全基因组测序，、全基因组测序，共有共有44054405个开放型阅个开放型阅读框架。读框架。2 2、基因克隆表达系、基因克隆表达系统成熟完善。统成熟完善。3 3、繁殖迅速、培养、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗简单、操作方便、遗传稳定。传稳定。4 4、被美国、被美国FDAFDA批准为批准为安全的基因工程受体安全的基因工程受体生物。生物。源基因的优势源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势1 1、缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；、缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；2 2、缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；、缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；3 3、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；蛋白；4 4、细胞周质内含有种类繁多的内毒素。、细胞周质内含有种类繁多的内毒素。问题问题什么是内毒素什么是内毒素endotoxin 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌的菌体中存在的的菌体中存在的毒性毒性物质的物质的总称，是多种革兰氏阴性菌的总称，是多种革兰氏阴性菌的细胞壁细胞壁成分，由成分，由菌体菌体裂解裂解后释出的后释出的毒素毒素，又称之为，又称之为“热原热原”。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种脂多糖脂多糖成分。只有当细菌死亡溶解或用人工方成分。只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以称法破坏菌细胞后才释放出来，所以称内毒素内毒素。二、表达载体必须具备的条件：二、表达载体必须具备的条件：（1 1）载体能够独立的复制）载体能够独立的复制（2 2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记（3 3）具有很强的启动子）具有很强的启动子（4 4）具有阻遏子）具有阻遏子（5 5）有很强的终止子）有很强的终止子（6 6）有翻译的起始信号：起始密码）有翻译的起始信号：起始密码AUGAUG、SDSD序列序列常用的表达载体：常用的表达载体：（1 1）pBV220pBV220系统；（系统；（2 2）pETpET系统。系统。1 1、目的基因表达产量目的基因表达产量与单位体积产量成正比；与单位体积产量成正比；2 2、单位体积产量单位体积产量与细胞浓度和每个细胞的平均表与细胞浓度和每个细胞的平均表达量的关系？达量的关系？3 3、细胞浓度细胞浓度与细胞生长速率、目的基因拷贝数和与细胞生长速率、目的基因拷贝数和表达产物产量的关系？表达产物产量的关系？4 4、每个细胞的表达量每个细胞的表达量与目的基因拷贝数、基因表与目的基因拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷的关达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷的关系？系？三、影响药物基因表达量的因素三、影响药物基因表达量的因素基因工程的基本原理基因工程的基本原理提高外源基因的剂量提高外源基因的剂量分子遗传学原理分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等等分子生物学原理分子生物学原理筛选构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：筛选构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、序列、mRNA非编码区、密码子非编码区、密码子等等分子生物学分子生物学原理原理基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产生产发酵工程原理发酵工程原理一）质粒拷贝数对外源基因高效表达的影响一）质粒拷贝数对外源基因高效表达的影响 表达型质粒表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。有效解决策略是控制重组质粒的扩增。有效解决策略是控制重组质粒的扩增。二）启动子在转录水平上影响外源基因的表达二）启动子在转录水平上影响外源基因的表达 启动子的强弱启动子的强弱 启动子最佳距离启动子最佳距离 启动子的可控性启动子的可控性 启动子启动子(promoterpromoter)：DNADNA模板上专一地与模板上专一地与RNARNA聚合酶结合并决定转聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。也决定基因的转录效率。三）终止子影响外源基因的表达三）终止子影响外源基因的表达 外源基因在强启动子的控制下表达，外源基因在强启动子的控制下表达，RNARNA聚合酶容易聚合酶容易滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNADNA序列，形成序列，形成长短不一的长短不一的mRNAmRNA混合物。混合物。过长转录物的产生影响外源基因的表达：过长转录物的产生影响外源基因的表达：转录产物越长，转录产物越长，RNARNA聚合酶转录一分子聚合酶转录一分子mRNAmRNA所需的时所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；过长的过长的mRNAmRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；程菌无谓的能量消耗；过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。大大降低外源基因编码产物的翻译效率。四）核糖体结合位点（四）核糖体结合位点（RBSRBS）的有效性）的有效性 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNAmRNA的翻译起始效的翻译起始效率密切相关。率密切相关。翻译起始作用发生在称为核糖体结合位点的翻译起始作用发生在称为核糖体结合位点的mRNAmRNA的特的特定序列上。这是位于编码区前面的一段很短的碱基序列。定序列上。这是位于编码区前面的一段很短的碱基序列。大肠杆菌细胞中结构不同的大肠杆菌细胞中结构不同的mRNAmRNA分子具有不同的翻译分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNAmRNA翻译的起翻译的起始效率主要由其始效率主要由其5 5端的结构序列所决定。端的结构序列所决定。五）五）SDSD序列的影响序列的影响 SD序列序列：mRNAmRNA中用于结合原核细胞中用于结合原核细胞核糖体核糖体的序的序列。一般来说，列。一般来说，mRNAmRNA与核糖体的结合程度越强，翻与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SDSD序列与序列与16S rRNA16S rRNA的碱基互补性，其中以的碱基互补性，其中以GGAGGGAG四个四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成基中任何一个换成C C或或T T，均会导致翻译效率大幅度，均会导致翻译效率大幅度降低。降低。六）六）SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响 SDSD序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为AAAAAAAA或或UUUUUUUU，翻译效，翻译效率最高；而率最高；而CCCCCCCC或或GGGGGGGG的翻译效率则分别是最高值的翻译效率则分别是最高值的的50%50%和和25%25%。紧邻。紧邻AUGAUG的前三个碱基成份对翻译起的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌始也有影响，对于大肠杆菌-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNAmRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAUUAU或或CUUCUU，如果用如果用UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG取代之，则酶的表达水平低取代之，则酶的表达水平低2020倍。倍。七）七）SDSD序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响 SDSD序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUGAUG正好处正好处于核糖体复合物结构中的于核糖体复合物结构中的P P位位，这是翻译启动的前提，这是翻译启动的前提条件。条件。SD SD序列一般位于序列一般位于AUGAUG之前大约七个碱基处，在此之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。效率不同程度的降低。八）密码子偏爱性对外源基因表达的影响八）密码子偏爱性对外源基因表达的影响 原核细胞和真核细胞基因组中密码子的使用频原核细胞和真核细胞基因组中密码子的使用频率具有较大程度的差异性，因此外源基因尤其是高率具有较大程度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。因素是密码子的正确选择。一般而言，可通过一般而言，可通过外源基因全合成外源基因全合成或或同步表达同步表达相关相关tRNAtRNA编码基因编码基因两种策略使外源基因上的密码子两种策略使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达。在大肠杆菌细胞中获得最佳表达。小小 结：结：影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 1 1、外源基因的拷贝数：、外源基因的拷贝数：2 2、外源基因的表达效率：、外源基因的表达效率：3 3、表达产物的稳定性：融合蛋白表达。、表达产物的稳定性：融合蛋白表达。4 4、细胞的代谢负荷：细胞的生长和外源基因的、细胞的代谢负荷：细胞的生长和外源基因的 表达分成两个阶段。表达分成两个阶段。5 5、工程菌的培养条件：优化培养条件使外源基、工程菌的培养条件：优化培养条件使外源基 因大量表达。因大量表达。四、真核基因在大肠杆菌中的表达形式四、真核基因在大肠杆菌中的表达形式融合蛋白表达融合蛋白表达非融合蛋白表达非融合蛋白表达分泌型表达分泌型表达 一）药物蛋白基因分泌型表达一）药物蛋白基因分泌型表达1.1.分泌型目的蛋白表达系统的构建分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的包括大肠杆菌在内的G G不能将蛋白质直接分泌到胞外，但不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些有些GG能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于过程严格依赖于细菌素释放蛋白细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的，它激活定位于内膜上的磷酸磷酸酯酶酯酶，导致细菌内外膜的，导致细菌内外膜的通透性增大通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。同时，用另一种携带大粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。同时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。2.分泌表达形式的优点分泌表达形式的优点1 1）目的蛋白稳定性高：重组人胰岛素原若分泌到细）目的蛋白稳定性高：重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是在细胞质中的胞周质中，其稳定性大约是在细胞质中的100100倍。倍。2 2）目的蛋白易于分离。）目的蛋白易于分离。3 3）目的蛋白末端完整：相当多的药物蛋白）目的蛋白末端完整：相当多的药物蛋白N N端并不含端并不含有有甲硫氨酸甲硫氨酸残基。当药物基因在大肠杆菌中表达时，残基。当药物基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质蛋白质N N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如将药端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如将药物基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一物基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌表达，其旦分泌表达，其N N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去。剪切过程中被有效除去。3.3.分泌表达形式的缺点分泌表达形式的缺点 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。药物基因很难在大肠杆菌中进泌机制并不健全。药物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数即便能分泌表达，但其表达行分泌型表达，少数即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的药物蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但业化的药物蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。并不普遍。二）以融合蛋白的表达形式表达药物基因二）以融合蛋白的表达形式表达药物基因 将药物基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼将药物基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于分位于N端，端，药物蛋白位于药物蛋白位于C端端。通过在。通过在DNA水平水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收药物蛋白。子中释放回收药物蛋白。1.1.以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点1 1）药物蛋白药物蛋白稳定性高，尤其对分子量较小的多肽效稳定性高，尤其对分子量较小的多肽效果更佳。果更佳。2 2）目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离，利用受体蛋白成熟的抗体、，利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白。的融合蛋白。3 3）药物蛋白表达率高药物蛋白表达率高，与受体蛋白共用一套完善的，与受体蛋白共用一套完善的表达元件。表达元件。4 4）药物蛋白溶解性好药物蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。有水溶性。5 5）药物蛋白需要回收药物蛋白需要回收，融合蛋白需要裂解和进一步，融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获药物蛋白。在实际生产中，产品主要分离，才能获药物蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。的成本往往就在该工段。2.2.融合蛋白表达质粒的构建原则融合蛋白表达质粒的构建原则1 1）受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物）受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。2 2）药物基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融）药物基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为药物蛋白分离回收中两种组份的分子量过于接近，为药物蛋白分离回收创造条件。创造条件。3 3）两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，）两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。4 4）两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。）两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。大肠杆菌中表达的蛋白以大肠杆菌中表达的蛋白以mRNAmRNA的的AUGAUG为起为起始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列。始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列。优点：优点：能够较好地保持原来的蛋白活性；能够较好地保持原来的蛋白活性；缺点：缺点：容易被蛋白酶破坏，氨基末端常常容易被蛋白酶破坏，氨基末端常常带有带有甲硫氨酸甲硫氨酸，在人体内用药时可能会引起人，在人体内用药时可能会引起人体免疫反应。体免疫反应。三）以非融合蛋白形式表达药物基因三）以非融合蛋白形式表达药物基因1.1.以包涵体形式表达药物基因以包涵体形式表达药物基因 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌在一定由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌在一定生长条件下，大量合成的药物基因蛋白致密地集生长条件下，大量合成的药物基因蛋白致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露的水不溶聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露的水不溶性结构（性结构（Inclusion BodiesInclusion Bodies，IBIB）。包涵体中一般还含有少量的包涵体中一般还含有少量的DNADNA、RNARNA和脂多糖和脂多糖等非蛋白分子。等非蛋白分子。2.2.包涵体表达形式的优点包涵体表达形式的优点1 1）能简化外源基因表达产物的分离操作）能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。物中分离出来。2 2）能在一定程度上保持表达产物的结构稳定）能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。威胁。3.3.包涵体表达形式的缺点包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物丧失了原有的生物活性活性，必须通过有效的，必须通过有效的变性变性、复性复性操作，才能回收操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白。标蛋白。包涵体变性、复性操作的效率对目标产物的收率包涵体变性、复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的标蛋白分子中的CysCys残基数目较高时，体外复性蛋白残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过质的成功率相当低，一般不超过30%30%。例：例：rHuINSrHuINS的主要表达策略和特点的主要表达策略和特点 1.A1.A链和链和B B链分别表达法链分别表达法 1 1）化学合成）化学合成HuINS AHuINS A、B B链的编码序列，两个双链链的编码序列，两个双链DNADNA片段片段分别克隆在含有分别克隆在含有PtacPtac启动子和启动子和LacZ LacZ 基因的表达型质粒上，基因的表达型质粒上，后者与后者与A A、B B链的编码序列形成杂合基因，连接位点为甲硫链的编码序列形成杂合基因，连接位点为甲硫氨酸密码子；氨