酶联免疫吸附剂测定ELISA检测技术.docx

酶联免疫吸附剂测定ELISA检测技术1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗 原定位的酶标抗体技术开展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原 理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体外表，并保持其免疫活性。使抗原或 抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保存其免疫活性，又 保存酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗 体按不同的步骤与固相载体外表的抗原或抗体起反响。用洗涤的方法使固相载体上 形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受 检物质的量成一定的比例。加入酶反响的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产 物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反响的深浅刊物定性或定量 分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反响效果，从而使测定方法到达 很高的敏感度。ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固 相载体外表的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保存其免疫 学活性，又保存酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相 载体外表的抗原或抗体起反响。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物 与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反响而结合在固相 载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反响的底 物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故 可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免 疫反响的结果，使测定方法到达很高的敏感度。ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个 必要的试剂：(1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent)； (2) 酶标记的抗原或抗体，称为“结合物"(conjugate)； (3)酶反响的底物。根据试剂的 来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于 临床检验的ELISA主要有以下几种类型：双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下:间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗 体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：1）将特异 性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释 的受检血清，保温反响。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复 合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中 被洗去。3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人 IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标 记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。4）加底物显色 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换 包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的 结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康 人血清发生反响的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成 份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反响。抗原中也不能含 有与酶标抗人Ig反响的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig 去除，试验中也发生假阳性反响。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而 影响包被效果。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检 的特异性IgG只占总IgG中的一小局部。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸 附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的外表。因此在间接法中，抗原包被后 一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空 余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:401:200）,以防止过高的阴性本 底影响结果的判断。竞争法测抗体触凌厂网- -LT当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测 特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标 本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反响呈色浅于阴性反响。 如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功， 可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗 原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反响。竞争法 测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA 一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合， 洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反响。抗HBe的检测一般采用此法。2.2.5 竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因 此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和 一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的 酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。2.2.6 捕获包被法测抗体k，f - kAIgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA 一般仅适用于检测总抗 体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在 较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固 相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白 或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM （其中包括针对抗 原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM 相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的 IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的 检测模式见图。 类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致 假阳性反响。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM 和抗弓形虫IgM抗体已获成功。2.2.7 ABS-ELISA法 ABS为亲和素（avidin）生物素（biotin）系统（system）的略语。亲和 素是一种糖蛋白，分子量60000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生 物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯 可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。 生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反响大得多，两者 一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS 与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC） 法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗 体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反响，然后再加酶标记的 生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性 糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中 提取的链霉亲和素那么无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于 ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中 ABS-ELISA应用不多。在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。前文（2.2）已述，ELISA中有三个 必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 完整的ELISA试剂盒包含以下 各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗 体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考 标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7） 酶反响终止液。2.2.8 吸附剂 已包被抗原或抗体的固相载体在低温（28）干燥的条件下一般 可保存6个月。有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包 被。以下简述固相载体和包被过程。1.1.1 固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器,不参与化学反响。 可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋 白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保存原来的免疫学活性，加之它的价 格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。ELISA载体的形 状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA 的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8x12的96孔式。为便于作少量 标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板 相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅 速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、 洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其 吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗 体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性 能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差异，各种产品的质量差 异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法 为：以一定浓度的人IgG （一般为10ng/mD包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加 入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反响后，分 别测每孔溶液的吸光度。控制反响条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部 读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%0 与聚苯乙烯 类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪 害I，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白 质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。为比拟不同固相在某一 ELISA 测定中的优劣，可应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标 本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操 作步骤进行测定，然后比拟结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差异最大， 这种载体就是这一 ELISA测定工程的最合适的固相载体。在ELISA中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠，外表经磨砂处理后吸附面积大大增加。 ELISA板孔的吸附面积约为200mm2,小珠均为1000mm2,将近ELISA板孔的5 倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者，球型小珠的外表弧 度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最正确反响状态，因此珠 式ELISA的反响往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊的 洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由 于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较差。小试管作为固相载体也有较大的吸 附外表，而且标本的反响量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为 100-200U1,而小试管可根据需要加大反响体积，标本反响量的增加有助于试验敏感 性的提高。小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。也有应 用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是外表积极 大，反响在悬液中进行，其速率与液相反响近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA固 相载体，反响后用磁铁的吸引进行别离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。1.1.2 包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被（coating）。换言之，包被即是 抗原或抗体结合到固相载体外表的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸 附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体外表的疏水基团间的作 用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。 载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有 更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体外表。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的 吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采 用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存 在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴 露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对 该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反响使抗原固相化。此间接结合在 固相上的抗原远离载体外表，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固 相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗 原也可采用捕获包被法（见2.2.4）,试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复 性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于“00。不 易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗 DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结 合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小时），以 增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被， 也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被 载体，然后加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗 原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙 醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让 脂质自然干固在固相外表。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。1.1.3 包被用抗原用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提 取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗 原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如AFP 从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以 大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而 且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除 大肠杆菌成份，用于ELISA,在反响中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌感 染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些 无法从天然材料中别离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功, 而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中所用包被抗 原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重 组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是 根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗 原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难 于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白 质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体外表。 应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含 有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该 多肽抗原发生反响。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种 情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。1.1.4 包被用抗体包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血 清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的）, 在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA,以保证试 验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG,通常采用硫酸镂盐析和 Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸钱盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG 性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，那么可采用亲和层析 法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgGo腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较 强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必 要时也可用纯化的IgGo应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇， 在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。1.1.5 包被的条件 包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等 应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸 盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH78的Tris-HCL缓冲液 作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37 中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性 质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质 的包被浓度为100ng/ml-20ug/mlo封闭 封闭（blocking）是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。 抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体外表尚有未被占据的空隙，封 闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰 物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清 白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好 的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）o高质量的速溶食用低脂 奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长 期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固 相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶 标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单 抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相外表，业已 起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的（见）0 包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。3.2 结合物结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。良好 的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合 物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少 含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物尚要有良好的稳 定性。3.2.1 酶 用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反响的转化率高，专一性 强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保存它的活性局部 和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和 保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosohatase, AP）O 在少 数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶邛-D-半乳糖甘酶和胭酶等。国 产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%, 分子量为44000,是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而 成，是一种口卜咻蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰，辅基是深 棕色的含铁吓琳环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ（Reinheit Zahl, 德文，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP 的RZ>?.0oHRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ外，更应注意酶的 活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位 表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的AP有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛 肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的AP分子 量为80000,酶作用的最适合pH为8.0；用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000, 最适pH为9.6。在ELISA中,AP系统的敏感度一般高于HRP系统,空白值也较低， 但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低。3.2.2 抗原和抗体制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的IgG,以免在与酶 联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特 异的免疫活性，可以在高稀释度进行反响，实验结果本底浅淡。如用F（ab）2进行标 记，那么更可防止标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求 是抗原必须是高纯度的。3.2.3 结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸 盐氧化法。 （1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋 白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步 法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反响后即得酶标记抗 体。 ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达 60%-70%)和重复性好等优点。缺点是交联反响是随机的，酶与抗体交联时分子间 的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联， 影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗 体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物 中绝大局部的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本 底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。(2)过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常 用此法。反响时，过碘酸钠将HRP分子外表的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质 上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最正确比例为：酶/ 抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所 有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最 后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游 离的抗体那么不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上 的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测， 效果更好。纯化的方法很多，别离大分子化合物的方法均可应用。硫酸镂盐析法最 为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的 游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛别离更为可 取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个局部：游离酶、游离抗体和 纯结合物而取得最正确的别离效果，但费用较贵。结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结 合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，那么又影响检测的敏感性。 所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度 时，能维护一个低的本底，并获得测定的最正确灵敏度，到达最合适的测定条件和测 定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的 载体作试验时，能得到阳性反响的最高稀释度。例如某一 HRP：抗人IgG制剂标明 的工作浓度为1:5000,表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA 试验时，将发生阳性反响。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓 度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反响温 度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行“滴配”选择能到达高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。3.2.4 结合物的保存 酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失 活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干 过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体 积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中 的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见325）临用时按标明的稀释 度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使 用时不需再行稀释，在4-8保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易 失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结 合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。3.2.5 结合物的稀释液用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为防止结合物在反 应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1% 牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于 塑料外表的非离子型外表活性剂，如吐温20, 0.05%的浓度较为适宜。在间接测定 抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。3.3 酶的底物HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反响,最具代表性的过氧化物为H2O2, 其反响式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作 比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基联苯胺 （3,3,5,5'-tetramethylbenzidine,TMB）和ABTS2,2'-azino-di-（3-ethylbenziazobine sulfonate-6）oOPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反响后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP 结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD-2HCL为水溶性。曾有报道OPD 有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后 更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制 成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢那么 配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸储水稀释。先进的ELISA 试剂盒中那么直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液，只需加入OPD 后即可作为底物应用液。TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视比照鲜明。TMB1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反响。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复 合物。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反响。固相免疫复合物上 的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量 与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。 通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大 分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗 体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清， 包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择 两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种 双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反响， 作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和 固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成”夹心复合物”。类同于沉淀反响中抗原过剩 的后带现象，此时反响后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗 体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见132,图1-4）,如按常法测读，所 得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）,因为标准曲线 到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反响甚至可不显色而出现假阴性结果。 因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP 和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类 试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。 但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr> adw> ayr、ayw4个亚型， 虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反响性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗 体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清 标本中如含有RF,它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假 阳性反响。采用F （ab）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc段，从而消 除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的 一项考核指标（参见6.2）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原， 但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物 使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反响 用HCL或H2s04终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收 波长为405nmo ABTS虽不如0PD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂 盒所采用。 另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸 3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA,经 HRP 作用后，产物显荧光，可用荧 光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物 (urea peroxide)o H2O2应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便、 稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸镭水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低 温(28)可稳定1年。3.3.1 AP的底物 AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯 (p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的 对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反响后，黄色可稳定一时 间。 AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)，可用于ELISA作荧光测定，敏感 度较高于用显色底物的比色法。3.4 洗涤液 在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。3.5 酶反响终止液常用的HRP反响终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终 体积而异，在板式ELISA中一般采用2moi/L。3.6 阳性对照品和阴性对照品 阳性对照品(positive control)和阴性对照品 (negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此 对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清 为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产 生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复 钙人血浆(recalcified human plasma)为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤 维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检 测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,最 好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定 量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称， 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比拟，可对标本中受检物质的量有一个粗 略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml,阳性对照 品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。3.7 参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒（例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等）应 含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均 配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条 件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式 点。本文将表达板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA, 国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作， 必能得出准确的结果。4.1 标本的采取和保存 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌 物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成 份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些那么需经预处理（如粪便和某些 分泌物）。大局部ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝 剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待 血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为 检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注 意防止溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的 ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反响。如在冰箱中保 存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天 内测定的血清标本可放置于4,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后， 蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，防止气泡，可上下颠倒混和，不 要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。 反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作屡次检测，宜少量 分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。4.2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸播 水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用p