Temporin-PE肽对结肠癌LoVo细胞增殖、迁移及凋亡的影响.docx

Temporin-PE肽对结肠癌LoVo细胞增殖、迁移及凋亡的影响刘桃源李昂王顺李淑艳潘洪明衣同辉摘要目的在细胞水平上初步探讨Temponn-PE肽抗结肠癌作用。 方法分别用50、100、150、200 口 g/mlTemporin-PE肽处理的人结肠 癌LoVo细胞株作为实验组，以等体积DMEM-H (无血清)处理的LoVo 细胞作为对照组。通过CCK-8法和细胞克隆形成实验检测不同浓度 Temporin-PE肽对LoVo细胞增殖活性的抑制作用，划痕实验检测细 胞的迁移能力，DAPI染色检测LoVo细胞的凋亡形态学改变，流式细 胞术检测细胞凋亡率。结果Temporin-PE肽能抑制LoVo细胞的增殖 且呈剂量依赖性；划痕实验可见细胞迁移率随Temporin-PE肽浓度增 高而逐渐降低;DAPI染色可见各实验组出现细胞凋亡，Temporin-PE 浓度越高细胞形态变化越明显;流式细胞术检测凋亡趋势与DAPI染 色一致。结论Temporin-PE肽可抑制LoVo细胞增殖与迁移、促进LoVo 细胞的凋亡，呈剂量依赖性。关键词Temporin-PE肽；结肠癌；增殖；凋亡中图分类号R735. 3+5文献标识码A文章编号2095-0616 (2022) 01-0028-04ImpactsofTemporin-PEpeptideonproliferation,migrationandapoptosisofLoVocellsofcoloncancerLIUTaoyuanLIAngWANGShunLIShuyanPANHongmingYITonghuiQiqiharMedicalUniversity, Heilongjiang, Qiqiharl61006, ChinaAbstractObjectiveTopreliminarilyinvestigatetheanti-co loncancereffectofTemporin-PEpeptideatcelllevel. MethodsLoVoc elIstrainofhumancoloncancertreatedwithTemporin-PEpeptideof5 0 ,100 ,150and200 u g/mlwasusedastheexperimentalgroup ,andLoVocelltreatedwithDMEM-H ( serum-free ) wasusedasthecontrolgroups. CCK-8methodandce11c1oneformatione xperimentwereusedtodetecttheinhibitoryeffectofdifferentcone entrationsofTemporin-PEpeptideontheproliferationactivityofL oVocells. Scratchtestwasusedtodetectthemigrationability,DAPIstainingwasusedtodetectthemorphologicalchangesofapoptos isofLoVocells,andflowcytometrywasusedtodeteettheapoptosisrate. ResultsTemp orin-PEpeptidecaninhibittheproliferationofLoVoceIlsinadose- dependentmanner. Scratchtestshowedthatthemigrationrateofcell sgraduallydecreasedwiththeincreaseofTemperin-PEpeptideconce ntration. DAPIstainingshowedapoptosisinalltheexperimentalgro ups.ThehighertheconcentrationofTemporin-PE,themoreobviousthemorphologicalchangesofcells. Thetrendofapop tosisdetectedbyflowcytometrywasconsistentwithDAPIstaining. C onelusionTemporin-PEpeptidecaninhibittheproliferationandmig rationofLoVocellsandpromotetheapoptosisofLoVocellsinadose-d ependentmanner.KeywordsTemporin-PEpeptide；Coloncancer；Proliferation；Apoptosis2022年结肠癌全球新发病例数超过190万例，位居全球恶性肿 瘤发病率第3位和病死率第2位，且在东亚地区的发病率最高1 o 目前结肠癌治疗的主要手段是手术、化疗、放疗以及靶向治疗等2-4, 但现有治疗手段也存在一定的缺乏，如局部抗癌药物不能精准靶向癌 细胞导致患者产生不良反响。Temporin-PE 肽 （F-L-P-I-V-A-K-L-L-S-G-L-L）是从 Pelophylax, kl. Esculentus 蛙的皮肤分泌物中别离得到的一种生物活性肽。研究发现， Temporin-PE 肽对 NCI-H157、U251MG. PC-3、MDA-MB-435s 细胞的增 殖有抑制作用，说明Temporin-PE肽具有一定的抗肿瘤活性5。本 实验拟在体外研究Temporin-PE肽对结肠癌LoVo细胞增殖、迁移和 凋亡的影响，并进一步探讨其分子机制，旨在为研发新的结肠癌治疗 策略提供参考。1材料与方法 1. 1材料结肠癌细胞株LoVo （中科院上海细胞库）；Temporin-PE肽（安 平药业）；DMEM-H培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；CCK-8试剂（北京索莱宝）；吉姆萨 染色液（上海碧云天生物技术）；DAPI试剂（北京索莱宝有 限公司）；AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKit （北京博奥森技术 ）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。1. 2方法1. 2.1细胞培养与分组人结肠癌LoVo细胞株用含有10%胎牛血清 的DMEM-H培养基在37t、5加0培养箱中培养。待细胞融合度达70% 80%时,分别用 50、100、150、200ug/mlTemporin-PE 处理细胞,以 等体积DMEM-H （无血清）处理的细胞为对照组（每个浓度设3个复 孔）。1. 2. 2CCK-8法检测细胞增殖情况采用CCK-8法检测 Temporin-PE肽对LoVo细胞的增殖抑制作用。细胞培养与分组同 1.2. 1,将LoVo细胞接种于96孔板中培养过夜，实验组加入相应浓 度Temporin-PE肽，对照组加入等体积DMEMT,分别培养12、24h, 测定450nm处0D值，计算细胞存活率。1. 2. 3细胞克隆形成实验细胞培养与分组同1. 2.1,取处于对数 生长期LoVo细胞，按8X10个/孔接种于6孔板，培养24h充分贴壁 后，分别加入相应浓度Temporin-PE肽。处理24h后弃旧培养基，用 含10%胎牛血清的DMEM-H培养基继续培养1周后，PBS洗涤，吉姆萨 染液染色，计算各组细胞克隆形成数。划痕实验细胞培养与分组同1.2.1,取处于对数生长期 LoVo细胞，按3X10个/孔接种于12孔板，培养过夜。用200 U1枪 头进行划痕，PBS洗涤2次，分别加入相应浓度Temporin-PE肽，分 别于Oh和24h拍照o1. 2. 5DAPI染色细胞培养与分组同1.2. 1,取处于对数生长期 LoVo细胞，按1义10个/孔接种于96孔板，培养过夜。分别加入相 应浓度Temporin-PE培养基培养24h, 4%多聚甲醛固定细胞25min, PBS洗涤2次，加入DAPI染色液室温lOmin, PBS洗涤2次，340nm 波长激发荧光，荧光镜下观察各组细胞形态。1. 2. 6流式细胞术细胞培养与分组同1. 2.1,取处于对数生长期 LoVo细胞，按3X10个/孔接种于12孔板，培养过夜。分别加入相 应浓度Temporin-PE培养基培养24h,用无EDTA胰酶消化后收集细 胞，PBS 洗涤 2 次重悬细胞，使用AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKit试剂盒染色后冰浴放置；流式 细胞仪检测各组细胞凋亡率。1.3统计学方法使用GraphpadPrism8. 0软件进行统计分析，数据以2结果ITemporin-PE肽抑制LoVo细胞增殖CCK-8实验结果显示，不同浓度Temporin-PE肽处理细胞12、24h 后，细胞存活率均随浓度的增加而降低，见图lo说明Temporin-PE 肽能抑制LoVo细胞增殖且呈剂量依赖性。2. 2Temporin-PE肽抑制LoVo细胞克隆形成能力克隆形成实验结果显示，与对照组比拟，实验组细胞克隆形成率 显著下降，差异有统计学意义(P0.01),见图2。说明Temporin-PE 肽能抑制LoVo细胞的克隆形成能力。2. 3Temporin-PE肽抑制LoVo细胞的迁移划痕实验结果显示，与对照组比拟，实验组24h细胞划痕面积随 Temporin-PE肽浓度增高而增大，见图3。通过划痕面积计算各组迁 移率，可见LoVo细胞迁移率随Temporin-PE肽浓度增高而降低，差 异有统计学意义(P0. 05),见图4。说明Temporin-PE肽能抑制LoVo 细胞的迁移能力。2. 4Temporin-PE肽诱导结肠癌LoVo细胞凋亡DAPI染色实验结果显示，对照组细胞核大小均一，实验组细胞 核皱缩、大小不一，在200ug/ml组出现明显凋亡小体，见图5。流 式细胞术实验结果显示，与对照组比拟，实验组凋亡率显著增高，且 随浓度增加细胞凋亡率也显著增加，差异有统计学意义(P0.001), 见图6。说明Temporin-PE肽能诱导LoVo细胞凋亡且呈剂量依赖性。3讨论近年来，结肠癌的全球发病率呈现逐年上升趋势，而且结肠癌的 早期临床病症不明显，难以早期诊断早期治疗，中晚期结肠癌患者临 床治疗效果差，因此寻找更有效的结肠癌治疗方法是目前的研究重点 之一 6-7。目前已有数百种生物活性肽被发现具有抗癌活性，抗癌 肽因具有广谱的抗癌活性、不易产生细胞耐药、与传统抗肿瘤药物具 有良好的协同效应等特点，在癌症的临床治疗中有巨大的研究应用前 景8T0。Temporin-PE 肽是从 Pel ophyl ax, kl. Esculentus 蛙的皮 肤分泌物中别离得到的一种生物活性肽，已有研究说明其具有一定的 抗菌及抗癌活性。肿瘤细胞的增殖和迁移是影响患者生存率和复发率的重要因素 11-13。本研究利用不同浓度Temporin-PE肽处理结肠癌LoVo细胞, 观察其增殖、迁移和凋亡情况。CCK-8检测结果显示，在LoVo细胞 培养液中分别加入不同浓度的Temporin-PE肽，培养12h和24h后, 细胞的增殖均受到抑制，且呈剂量依赖性。克隆形成实验结果显示, Temporin-PE肽显著降低LoVo细胞的克隆形成能力。划痕实验结果 显示，随着Temporin-PE肽浓度的增高，LoVo细胞的迁移能力显著 降低，提示Temporin-PE肽对LoVo细胞增殖、克隆形成能力以及迁 移能力均产生了明显的抑制作用。细胞凋亡是细胞增殖过程中重要的 调控机制，肿瘤细胞因正常凋亡受到抑制醇致细胞无限增殖14-15。 本研究利用DAPI实验及流式细胞术检测Temporin-PE肽对LoVo细胞 凋亡能力的影响。DAPI染色结果显示，Temporin-PE肽作用24h后, 可见细胞边界收缩变圆，细胞核大小不一，出现核内局部染色质断裂、 皱缩现象，核碎裂细胞明显增多。流式细胞术分析可见，随着 Temporin-PE肽浓度的增高，各组LoVo细胞凋亡率也呈显著增高趋 势，提示Temporin-PE肽能促进LoVo细胞凋亡。综上所述，Temporin-PE肽能抑制结肠癌LoVo细胞的增殖、克 隆和迁移能力，促进细胞凋亡。其分子机制还需要进一步的研究来探 讨。参考文献1刘宗超，李哲轩，张阳，等.2022全球癌症统计报告解读J. 肿瘤综合治疗电子杂志，2022, 7 (2)： 1-14.21KARPISHEHV , NIKKH00A , HOJJAT-FARSANGIM , etaL ProstaglandinE2asapotenttherapeutictargetfortreatmento fcoloncancerJ. ProstaglandinsOtherLipidMediat, 2022, 144： 106338.3RGupta , BhattL-K , JohnstonT-P , etal. Coloncancerstemcells：PotentialtargetforthetreatmentofcolorectalcancerJ. CancerB iolTher, 2022, 20 (8)： 1068-1082.4韦金磊，张森.结直肠癌的临床治疗进展J.中国临床新医学, 2022, 11 (2)： 202-208.51SANGM ,WUQ ,XIX ,etaL Identificationandtarget- modificationsoftemperin-PE ： Anovelantimicrobialpeptideinthedefensiveskinsecretionsofthe ediblefrog,Pelophylaxkl. esculentusJ. BiochemBiophysResCommun,2022, 495 (4)： 2539-2546.6徐润强，刘海盛.5-氟尿喀咤和抗Fas单抗联合治疗结肠癌的临床治疗效果J.中国医药科学,2022, 11 (8)： 193-195, 233.7WUC. SystemicTherapyforColonCancerJ. SurgOncolClinNAm, 2022, 27 (2)： 235-242.8CHIANGJ0NGW ,CHUTIPONGTANATES ,HONGENGS. Anticancerpeptide ： Physicochemicalproperty , functionalaspectandtrendinclinicalapplication ( Review ) J. IntJOncol, 2022, 57 (3)： 678-696.9LISCAN0Y,ONATE-GARZONJ,DELGADOJP. PeptideswithDualAntimicrobial-AnticancerActivity ： StrategiestoOvercomePeptideLimitationsandRationalDesignofAn ticancerPeptidesJ. 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