免疫检测新技术.ppt

免疫检测新技术现在学习的是第1页，共34页章节安排章节安排第一节第一节 生物素生物素-亲和素免疫检测新技术亲和素免疫检测新技术第四节第四节 免疫转印技术免疫转印技术的因素的因素第二节第二节 免疫胶体金检测新技术免疫胶体金检测新技术第第2节影响节影响第三节第三节 免疫电镜技术免疫电镜技术现在学习的是第2页，共34页目的与要求目的与要求 1、了解标生物素、了解标生物素-亲和素免疫检测技术的原理及种亲和素免疫检测技术的原理及种类类。2、理解免疫胶体金检测技术的原理及常用的检测方法。、理解免疫胶体金检测技术的原理及常用的检测方法。3、了解免疫电镜技术的应用、了解免疫电镜技术的应用。4、了解免疫转印技术的原理及应用。、了解免疫转印技术的原理及应用。难点与重点难点与重点 重点重点：免疫胶体金检测技术的原理。：免疫胶体金检测技术的原理。难点难点：免疫胶体金检测技术的原理。：免疫胶体金检测技术的原理。现在学习的是第3页，共34页第一节第一节 生物素生物素-亲和素免疫检测新技术亲和素免疫检测新技术现在学习的是第4页，共34页利用生物素与亲和素专一性结合以及生物素、亲和素既可标记抗原或抗体，又可被标记物所标记的特性，可建立生物素-亲和素系统来显示抗原抗体特异性反应的各种免疫检测技术。现在学习的是第5页，共34页一、生物素与亲和素的特性一、生物素与亲和素的特性1、生物素、生物素生物素(biotin)是一种广泛分布于动、植物组织的生长因子，亦称辅酶R或维生素H，尤以蛋黄、肝、肾组织中含量较高。结构式中的咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位。利用生物素的羧基加以化学修饰后，可以制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。针对不同的被标记物可以应用不同类型的活化生物素。现在学习的是第6页，共34页一、生物素与亲和素的特性一、生物素与亲和素的特性2、亲和素、亲和素(avidin)：是一种存在于鸡蛋清中的碱性糖蛋白，结晶呈白色粉末状，易溶于水。在pH213缓冲液中性质稳定，消化道多种蛋白水解酶不能使其失活。它对热的耐受性较强，经80温度作用2min仍保持活性。亲和素是由4个相同的亚单位组成的四聚体，富含色氨酸，通过色氨酸与生物素的咪唑环呈十分牢固的结合。亲和素的每个亚单位可结合1个分子生物素，因此1个亲和素分子可结合4个生物素分子。链霉亲和素现在学习的是第7页，共34页二、亲和素二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型生物素系统免疫检测技术类型1、亲和素、亲和素-生物素生物素-过氧化物酶技术过氧化物酶技术(ABC法法)（1）原理：ABC法是利用亲和素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接，最后加底物进行显色反应。其中，ABC复合物是将过氧化酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化酶连接物与过量的亲和素蛋白反应而制备的。现在学习的是第8页，共34页二、亲和素二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型生物素系统免疫检测技术类型1、亲和素、亲和素-生物素生物素过氧化物酶技术过氧化物酶技术(ABC法法)（2）应用：组织切片和细胞悬液中抗原的检测在免疫电镜中的应用标记抗体渗透性是免疫电镜技术的关键，小分子的生物素就可得到更高的渗透力，且生物素化抗体可在组织包埋前或包埋后加入，因此ABC法进行抗原的亚细胞水平定位分析得到较好的应用。现在学习的是第9页，共34页目前最灵敏的免疫组化二抗检测系统目前最灵敏的免疫组化二抗检测系统由于亲和素和生物素有极强的亲和力（其亲和力比抗体和大多数抗原的亲和力高100万倍），因而亲和素和生物之间的结合是不可逆的。此外，亲和素具有4个生物素结合位点，大多数蛋白质包括酶可以和多个生物素分子结合。利用这些特征，可以把亲和素和生物素化的酶结合为大分子复合物（ABCs）。现在学习的是第10页，共34页使用步骤：使用步骤：1加入一抗，与切片孵育。如加入兔抗肿瘤相关抗原的抗体。2加入生物素化二抗，如生物素化抗-兔IgG。3加入亲和素-生物素化酶复合物（ABC）。4加入酶作用底物，定位抗原。现在学习的是第11页，共34页二、亲和素二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型生物素系统免疫检测技术类型2、桥亲和素、桥亲和素-生物素技术生物素技术(BRAB)原理及应用：方法是用生物素分别标记抗体和酶，然后以亲和素为桥，把两者连接起来。检查抗原时，先用生物素标记的抗体与细胞(或组织内)的抗原反应，洗去未结合的抗体，加人亲和素孵育后，洗去未结合的亲和素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片，以细胞化学方法呈色反应。现在学习的是第12页，共34页现在学习的是第13页，共34页二、亲和素二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型生物素系统免疫检测技术类型3、标记生物素、标记生物素-亲和素技术亲和素技术(LAB)LAB法是以生物素标记抗体作第1抗体，酶标记亲和素作为第2抗体。BRAB法和LAB法都需以生物素标记第1抗体，应用不如ABC法普遍。但是，用于免疫细胞中免疫球蛋白的显示具有特异性。现在学习的是第14页，共34页二、亲和素二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型生物素系统免疫检测技术类型4、生物素生物素-亲和素或链霉亲和素亲和素或链霉亲和素ELISA检测技术检测技术包括BAB-ELISA，BA-ELISA和ABC-ELISA等技术。现在学习的是第15页，共34页第第2节节 免疫胶体金检测技术免疫胶体金检测技术现在学习的是第16页，共34页免疫胶体金标记技术是以胶体金颗粒为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。已广泛应用于光镜、电镜、流式细胞仪、免疫转印、体外诊断试剂的制造等领域。胶体金即水溶胶，是一种带负电荷的疏水胶体溶液，具有一般溶胶的特性，主要通过还原剂将氯化金分子聚合成特定大小金颗粒的方法而产生。可通过采用柠檬酸、抗坏血酸钠和白磷等还原氯金酸或四氯化金而制备胶体金。胶体金颗粒可通过静电吸引及其表面的物理特性与多种生物分子(如抗体、SPA)相结合，形成蛋白质-金颗粒复合物，即胶体金标记物(胶体金探针)。一、概一、概 述述现在学习的是第17页，共34页二、原理胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。现在学习的是第18页，共34页二、原理胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。现在学习的是第19页，共34页二、原理胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。现在学习的是第20页，共34页二、原理免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。现在学习的是第21页，共34页三、常用的免疫胶体金检测技术三、常用的免疫胶体金检测技术1、免疫胶体金光镜染色法、免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。现在学习的是第22页，共34页三、常用的免疫胶体金检测技术三、常用的免疫胶体金检测技术2、免疫胶体金电镜染色法、免疫胶体金电镜染色法 可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。现在学习的是第23页，共34页三、常用的免疫胶体金检测技术三、常用的免疫胶体金检测技术3、斑点免疫金渗滤法、斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜(如NC膜)作载体，先将抗原或抗体点于NC膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。现在学习的是第24页，共34页三、常用的免疫胶体金检测技术三、常用的免疫胶体金检测技术4、胶体金免疫层析法、胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。现在学习的是第25页，共34页现在学习的是第26页，共34页四、免疫胶体金检测技术的应用四、免疫胶体金检测技术的应用免疫胶体金检测技术主要应用于组织化学染色、基础免疫学研究(如通过胶体金标记的CD分子单克隆抗体采用流式细胞术检测淋巴细胞亚群)和疾病诊断。现在学习的是第27页，共34页第第3节节 免疫电镜技术免疫电镜技术现在学习的是第28页，共34页免疫电镜技术(immune electron microscopy，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电镜的高分辨能力相结合的检测技术，该方法始建于1941年。IEM主要包括两个方面应用：在电镜下利用标记抗体，直接对抗原在分子水平上进行定位；利用特异性抗体捕获、浓缩相应的病毒，经负染后在电镜下检查病毒粒子，可用于病毒病的诊断。现在学习的是第29页，共34页一、抗原定位一、抗原定位用酶、铁蛋白、胶体金标记的特异性抗体，对组织切片进行染色，结合电镜技术，可对细胞或组织内抗原的分布进行定位。根据标记物的不同，免疫电镜技术可分为电镜免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白标记技术、免疫胶体金技术等。现在学习的是第30页，共34页二、病毒检测二、病毒检测在所检病毒样中加入已知抗血清，使形成抗原(病毒)抗体复合物，经过超速离心或琼脂、滤纸浓缩、过滤系统后将此抗原抗体复合物浓集于电镜铜网的For-mar膜上，负染色后进行电镜观察。由于抗体将病毒浓缩在一起，比直接观察散在病毒粒子的方法大大提高了敏感性。现在学习的是第31页，共34页目前有几种方法：经典的免疫电镜法是将待检样品与抗血清混合反应后，超速离心，吸取沉淀物染色观察；快速法是在琼脂糖凝胶上打孔，下垫滤纸，孔中加入待检样品与抗血清混合液，然后将铜网膜漂浮于孔中的免疫反应液滴上，待液滴被滤纸吸下后取出铜网膜、染色观察；抗体捕捉法是先将用抗血清包被铜网膜，然后将此包被有抗体的铜网膜悬浮于待测病毒溶液的液滴上，作用一定时间后，染色铜网膜并观察。二、病毒检测二、病毒检测现在学习的是第32页，共34页第三节第三节 免疫转印技术免疫转印技术现在学习的是第33页，共34页免疫转印(immunoblotting)技术又称蛋白质印迹或Western blotting，是一种将蛋白质凝胶电泳、膜转移电泳与抗原抗体反应相结合的新型免疫分析技术。现在学习的是第34页，共34页