实验四的醋酸纤维薄膜电泳与血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳.ppt

实验四的醋酸纤维薄膜电泳与血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳现在学习的是第1页，共42页1.1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作2.2.了解血红蛋白的组成及分类了解血红蛋白的组成及分类一、实验目的实验目的（Experimental Objectives）现在学习的是第2页，共42页电泳电泳：指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，作定向移动。作定向移动。由于各种物质的等电点不同，由于各种物质的等电点不同，在同一在同一P P环境中解离后所带电荷性质及电量环境中解离后所带电荷性质及电量多少也各不相同多少也各不相同,再由于其分子量、结构、形再由于其分子量、结构、形状大小各有差异，因此在同一电场中泳动速度状大小各有差异，因此在同一电场中泳动速度也不一样。一般来说，所带电荷多、分子量小、也不一样。一般来说，所带电荷多、分子量小、形状越接近球形者，泳动速度快，反之则慢。形状越接近球形者，泳动速度快，反之则慢。现在学习的是第3页，共42页电泳技术的分类：主要归纳为；1 1）显微电泳显微电泳即在显微镜下观察即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞电泳。电泳。2 2）自由电泳自由电泳即悬浮在介质中的细即悬浮在介质中的细胞和生物大分子，在电场作用下自由定胞和生物大分子，在电场作用下自由定向移动。向移动。现在学习的是第4页，共42页 3 3）区域电泳区域电泳（区带电泳）：即在不同（区带电泳）：即在不同电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定生物物质，促使获得各自电荷差异的生物生物物质，促使获得各自电荷差异的生物粒子形成各自区域以帯形停留在载体上。粒子形成各自区域以帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，此类酰胺凝胶等，此类 电泳技术分离技巧简便，电泳技术分离技巧简便，运用十分广泛。运用十分广泛。4 4）免疫电泳免疫电泳：即抗原与抗体在比例：即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。疫技术，亲和电泳即属此类。现在学习的是第5页，共42页根据缓冲液的性质不同可分为：1.1.连续系统：连续系统：电泳缓冲液的离子成分、电泳缓冲液的离子成分、PHPH、电位、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电泳时仅具有泳时仅具有电荷效应电荷效应、分子筛效应分子筛效应。2.2.不连续系统：不连续系统：电泳缓冲液离子成分、电泳缓冲液离子成分、pHpH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，带电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，带电颗粒电泳时具有电颗粒电泳时具有浓缩效应浓缩效应、电荷效应电荷效应、分子分子筛效应筛效应。现在学习的是第6页，共42页 血红蛋白（血红蛋白（Hb)Hb)的组成及分类：的组成及分类：血红蛋白（血红蛋白（Hb)Hb)：由：由亚铁血红素亚铁血红素、珠珠蛋白蛋白 组成组成 。每个珠蛋白分子由。每个珠蛋白分子由4 4条多肽条多肽链构成链构成 ，根据其一级结构的不同可分，根据其一级结构的不同可分为为、四种类型。四种类型。现在学习的是第7页，共42页正常成人Hb种类：组成 百分含量 pIHbA 22 9598%6.95HbA2 22 23%7.38HbF 22 6.95 现在学习的是第8页，共42页二、实验原理二、实验原理(Experimental Principles)在pH8.6的环境中，Hb是一种带负电荷的蛋白质（Hb的pI 8.6），在电场中向正极泳动。电泳时，由于各种Hb等电点不同，所带电荷量不同；分子量大小、形状不同，导致各自的泳动速度不同，因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。现在学习的是第9页，共42页 醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性物质均能通过电泳得到分离。物质均能通过电泳得到分离。醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、实验室首选的方法实验室首选的方法。现在学习的是第10页，共42页三、实验材料、主要仪器和试剂三、实验材料、主要仪器和试剂（Equipments,Materials and Agents）1 1、试剂、试剂 0.9%0.9%的的NaClNaCl溶液；蒸馏水；溶液；蒸馏水；四氯化碳；碘酊；四氯化碳；碘酊；75%75%酒精；酒精；TEBTEB缓冲液（缓冲液（pH8.6pH8.6）；丽春红染液；）；丽春红染液；漂洗液。漂洗液。2 2、实验器材、实验器材 醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺针；醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺针；消毒棉签。消毒棉签。现在学习的是第11页，共42页四、操作步骤四、操作步骤（Operating Procedure）1.1.取血：取血：用用2%2%碘酊棉球消毒受试者手指，再用碘酊棉球消毒受试者手指，再用75%75%酒酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约50ul50ul放入放入事事先已加入先已加入0.9%NaCl 1ml0.9%NaCl 1ml 的的1.5ml1.5ml离心管中。离心管中。如出血不畅，可对手指稍加挤压。如出血不畅，可对手指稍加挤压。现在学习的是第12页，共42页2.2.制备制备HbHb液：液：1 1）洗涤红细胞洗涤红细胞：将上述离心管，颠倒混匀：将上述离心管，颠倒混匀5-65-6次，次，4000rpm4000rpm，离心，离心3 3分钟。弃上清，再分钟。弃上清，再加加1ml 0.9%NaCl1ml 0.9%NaCl悬浮红细胞，相同条件悬浮红细胞，相同条件重复离心一次。重复离心一次。2 2）溶血溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水：向红细胞沉淀中加入蒸馏水1 1滴，滴，摇匀，再加入四氯化碳摇匀，再加入四氯化碳1 1滴，振荡混匀，滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，取上清即得相同条件再离心一次，取上清即得HbHb液。液。现在学习的是第13页，共42页3.3.电泳电泳1 1）膜条准备：）膜条准备：2 2）点样：）点样：取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的液体，取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的液体，然后平铺然后平铺,（毛面朝上毛面朝上），用小玻片沾取适量），用小玻片沾取适量HbHb液，按液，按印于点样线上，点样处印于点样线上，点样处离膜条边缘离膜条边缘1.5cm1.5cm左右左右。现在学习的是第14页，共42页3 3）电泳：）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面向下，在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面向下，上样一端靠近负极，盖严电泳室。通电预电泳上样一端靠近负极，盖严电泳室。通电预电泳5-5-10min10min。调节电压为。调节电压为100V100V，电泳，电泳30304040分钟。分钟。4 4）染色：）染色：电泳完毕后关闭电源。将膜条取下，放电泳完毕后关闭电源。将膜条取下，放在丽春红染色液中染色在丽春红染色液中染色1010分钟。分钟。5 5）漂洗：漂洗：取出染色膜条，放入漂洗液中漂洗至凝取出染色膜条，放入漂洗液中漂洗至凝胶背景无色为止。胶背景无色为止。现在学习的是第15页，共42页五、结果与分析：五、结果与分析：（Results and Analysis）观察膜条上观察膜条上HbHb条带的位置及颜色的深浅。绘图条带的位置及颜色的深浅。绘图纪录之。纪录之。现在学习的是第16页，共42页现在学习的是第17页，共42页现在学习的是第18页，共42页六、临床意义 Hb Hb醋酸纤维素薄膜碱性电泳可以筛选异常血醋酸纤维素薄膜碱性电泳可以筛选异常血红蛋病红蛋病。异常血红蛋白：指珠蛋白链中一个或数个氨 基酸被置换、缺失或增加，造成血红蛋白结构及功能异常，导致一系列病理和生理改变。是常见的是常见的遗传病之一遗传病之一.人类异常血红蛋白高达两千多种类型，约300人中即有一人是异常血红蛋白携带者。因此，在临床上快速、早期诊断尤为重要。现在学习的是第19页，共42页分子病分子病 GeneGene突变导致蛋白质分子突变导致蛋白质分子质质和和量量异常，从而异常，从而引起机体功能障碍的一类疾病，称为分子病。引起机体功能障碍的一类疾病，称为分子病。现在学习的是第20页，共42页异常异常HbHb病：病：1 1、基因突变导致珠蛋白结构改变。、基因突变导致珠蛋白结构改变。镰状细胞贫血镰状细胞贫血 2 2、基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏、基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏 或合成量异常。或合成量异常。地中海贫血：地中海贫血：、地贫地贫现在学习的是第21页，共42页镰镰 状状 细细 胞胞 病病 形成原因形成原因：链链第第6 6位位谷谷氨氨酸酸被被缬缬氨氨酸酸取取代代，形形成成HbSHbS（镰镰状状H Hb)b)。在在缺缺氧氧情情况况下下，HbSHbS聚聚合合形形成成长长棒棒状状聚聚合合物物，使使红红细细胞胞镰镰变变,变变形形能能力力低低，导导致致溶溶血血、贫贫血血，引引起起血血粘粘度度增增高高，血管梗阻性继发症状。血管梗阻性继发症状。发病的分子基础是：发病的分子基础是：链链基基因因的的一一个个碱碱基基对对GAG(A)变变为为GTG(T)，致致使使血血红红蛋蛋白白的的链链N端端第第6位位的的谷谷氨氨酸酸被被缬缬氨氨酸酸取取代代形成形成HbS。现在学习的是第22页，共42页临床症状临床症状：血管阻塞的继发症状：一过性剧痛（腹痛、关节痛）血管阻塞的继发症状：一过性剧痛（腹痛、关节痛）,脑脑血管意外血管意外急性大面积组织损伤：心梗，肺、肾脏损伤；急性大面积组织损伤：心梗，肺、肾脏损伤；慢性溶血性贫血慢性溶血性贫血 患者多在成年以前死亡患者多在成年以前死亡 现在学习的是第23页，共42页地中海贫血地中海贫血由于由于 珠蛋白基因的缺失或缺珠蛋白基因的缺失或缺 陷使陷使 链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。特点：特点：b b 都表现为低色素性贫血都表现为低色素性贫血地地中中海海贫贫血血由由于于 珠珠蛋蛋白白基基因因的的缺缺失失或或缺缺陷陷使使 链链的的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。合成受到抑制而引起的溶血性贫血。地地中中海海贫贫血血现在学习的是第24页，共42页 最初发现在地中海地区居住的人群发病最初发现在地中海地区居住的人群发病率特别高，因而称为率特别高，因而称为地中海贫血。地中海贫血。实际上世界各地都有发生，非洲和东南实际上世界各地都有发生，非洲和东南亚也比较常见。我国东南沿海地区高发。亚也比较常见。我国东南沿海地区高发。现在学习的是第25页，共42页 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的一、实验目的（Experimental Objectives）：）：1.1.掌握血清脂蛋白电泳的基本原理及操作方法掌握血清脂蛋白电泳的基本原理及操作方法2.2.了解血清脂蛋白测定的临床意义了解血清脂蛋白测定的临床意义 现在学习的是第26页，共42页 血清中的脂类物质均以不同的比例与载脂蛋白血清中的脂类物质均以不同的比例与载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白。各种脂蛋白中所含载脂蛋结合成水溶性的脂蛋白。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，其颗粒大小相差也很大。白的种类及数量不同，其颗粒大小相差也很大。现在学习的是第27页，共42页血浆脂蛋白的分类血浆脂蛋白的分类*1电泳分类法：电泳分类法：2超速离心法：超速离心法：乳糜微粒乳糜微粒 CM CM -脂蛋白脂蛋白 VLDLLDL 前前-脂蛋白脂蛋白 LDL LDL -脂蛋白脂蛋白 HDLHDL现在学习的是第28页，共42页功能功能48508095507050转运外源性转运外源性三酰甘油和三酰甘油和胆固醇到全身胆固醇到全身转运内源性转运内源性三酰甘油到全身三酰甘油到全身转运内源性转运内源性胆固醇到全身胆固醇到全身逆向逆向转运转运胆固醇肝脏胆固醇肝脏分分 类类CMVLDL(Pre-LP)LDL(-LP)HDL(-LP)表表10-1 血浆脂蛋白的分类、组成、性质、功能血浆脂蛋白的分类、组成、性质、功能现在学习的是第29页，共42页血浆脂蛋白的组成特点及功能血浆脂蛋白的组成特点及功能*密度法密度法电泳法电泳法密度密度CMCMCMCM最小最小VLDLVLDL前前-脂蛋白脂蛋白LDLLDL-脂蛋白脂蛋白HDLHDL-脂蛋白脂蛋白最大最大组成组成特点特点含含TGTG最多最多 80958095；含含ApoApo最少；最少；含含TGTG第二多第二多 50705070含含ApoApo第二第二少少含含ChCh最多最多48504850含含ApoApo最多最多,5050 含含pLpL最多；最多；含含TGTG最少，最少，含含ChCh第二多。第二多。功能功能转运转运外外源性源性TGTG和和Ch Ch 由由肠肠 全身全身转运转运内内源性源性TGTG由由肝肝 全身全身转运转运内内源性源性ChCh由由肝肝 全身全身转转运外运外源性源性ChCh逆向转运逆向转运ChCh由由全身全身 肝肝合成合成部位部位小肠内膜上皮小肠内膜上皮细胞细胞肝细胞肝细胞血浆中血浆中VLDLVLDL转变而来转变而来肝细胞、小肠肝细胞、小肠粘膜细胞粘膜细胞现在学习的是第30页，共42页二、实验原理二、实验原理(Experimental Principles)：在在pH 8.6pH 8.6的缓冲液中，脂蛋白带负电荷，在电的缓冲液中，脂蛋白带负电荷，在电场中向正极泳动。用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳，场中向正极泳动。用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳，各种脂蛋白因其所带的负电荷量及颗粒大小、形状各种脂蛋白因其所带的负电荷量及颗粒大小、形状等不同，在电场中的泳动速度也不一样，故可将其等不同，在电场中的泳动速度也不一样，故可将其分离，用不同方法显色便可进行定性、定量分析。分离，用不同方法显色便可进行定性、定量分析。现在学习的是第31页，共42页三、主要设备、实验材料和试剂三、主要设备、实验材料和试剂（Equipments,Materials and Agents）（一）试剂（一）试剂 巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（PH8.6 I=0.05PH8.6 I=0.05）；制胶缓冲）；制胶缓冲液（液（PH8.6 I=0.05PH8.6 I=0.05）；）；0.45%0.45%琼脂糖凝胶；琼脂糖凝胶；苏丹黑苏丹黑B B染色液：制胶缓冲液（染色液：制胶缓冲液（PH8.6 PH8.6 I=0.05I=0.05）（二）设备（二）设备 电泳仪和电泳槽；普通离心机；水浴箱；微量电泳仪和电泳槽；普通离心机；水浴箱；微量加样器等加样器等现在学习的是第32页，共42页四、操作步骤四、操作步骤（Operating Procedure）1 1预染血清：预染血清：取取Eppendof Eppendof 管一支，加入血清管一支，加入血清0.2ml0.2ml及及苏丹黑苏丹黑B B染料液染料液0.02ml0.02ml，混匀后置于，混匀后置于37C37C水水浴中预染浴中预染3030分钟，分钟，2000rpm2000rpm离心离心5 5分钟，取分钟，取上清液备用。上清液备用。现在学习的是第33页，共42页2.2.制备琼脂糖胶板：制备琼脂糖胶板：将将0.45%0.45%的琼脂糖凝胶，经高温溶化后的琼脂糖凝胶，经高温溶化后，将胶模水平放置，插入上样梳。待琼脂，将胶模水平放置，插入上样梳。待琼脂糖凝胶液冷却至糖凝胶液冷却至6565左右时，小心倒入左右时，小心倒入胶模中，使胶液缓慢、均匀展开，厚约胶模中，使胶液缓慢、均匀展开，厚约0.5cm0.5cm，室温下静置，室温下静置30 min30 min，待凝固完全，待凝固完全后，轻轻拔出上样梳，在胶板上即形成相后，轻轻拔出上样梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。互隔开的样品槽。现在学习的是第34页，共42页现在学习的是第35页，共42页3.3.点样点样：用微量加样器吸取预染血清约：用微量加样器吸取预染血清约15l15l，加，加入凝胶样品槽内。入凝胶样品槽内。4.4.电泳：电泳：加完样品后的凝胶板，立即通电。加完样品后的凝胶板，立即通电。点样点样端置于负极端置于负极。调电压。调电压100V100V，电泳约，电泳约4545分钟，分钟，观察到分开的电泳条带后关闭电源，取出凝观察到分开的电泳条带后关闭电源，取出凝胶板观察结果。胶板观察结果。现在学习的是第36页，共42页现在学习的是第37页，共42页五、结果与分析五、结果与分析（Results and Analysis）肉眼观察各区带的颜色深浅、宽窄及其排列顺肉眼观察各区带的颜色深浅、宽窄及其排列顺序，绘出脂蛋白电泳图谱。序，绘出脂蛋白电泳图谱。正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从正极到正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从正极到负极依次为负极依次为-脂蛋白、前脂蛋白、前-脂蛋白和脂蛋白和-脂蛋脂蛋白白，原点处应为乳糜微粒。原点处应为乳糜微粒。现在学习的是第38页，共42页CM现在学习的是第39页，共42页现在学习的是第40页，共42页电泳法电泳法 CM 前前 密度法密度法 CM LDL VLDL HDL对应关系对应关系*现在学习的是第41页，共42页六、临床意义：1.1.正常人血清脂蛋白琼脂糖电泳，可分离出三条区带，从正常人血清脂蛋白琼脂糖电泳，可分离出三条区带，从正极到负极依次为正极到负极依次为-脂蛋白、前脂蛋白、前-脂蛋白和脂蛋白和-脂蛋白，原脂蛋白，原点处应无乳糜微粒。且点处应无乳糜微粒。且-脂蛋白含量-脂蛋白含量前-脂蛋白。2.2.参考值：参考值：-脂蛋白（脂蛋白（LDL)LDL)：67%67%-脂蛋白脂蛋白(HDL)(HDL)：2030%2030%前前-脂蛋白脂蛋白(VLDL)(VLDL)：028.6%028.6%现在学习的是第42页，共42页