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动物细胞融合 现在学习的是第1页，共25页动物细胞融合动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动 受精作用受精作用两个细胞正在融合两个细胞正在融合现在学习的是第2页，共25页动物细胞融合基本过程：动物细胞融合基本过程：现在学习的是第3页，共25页诱导方法：诱导方法：诱导方式诱导方式物理法：物理法：化学法：化学法：生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒电刺激电刺激聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG现在学习的是第4页，共25页 聚乙二醇聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞醇，就会发生细胞凝集作用凝集作用；在稀释和除去聚乙二；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它高，但是它有一定毒性有一定毒性，对有些细胞，对有些细胞(如卵细胞如卵细胞)不适不适用。用。聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融合诱导融合现在学习的是第5页，共25页实验原理：实验原理：利用利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜，在修复时相互合并在一起引起相临的重排质膜，在修复时相互合并在一起,使使两细胞的胞质沟通两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生从而造成相互接触的细胞之间发生融合。融合。现在学习的是第6页，共25页 利用利用PEG介导细胞融合介导细胞融合,其融合效果受以下其融合效果受以下几种因素的影响：几种因素的影响：1.PEG的分子量与浓度的分子量与浓度:细胞融合效果与细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；的分子量及其浓度成正比；但但PEG的分子量越大、浓度越高的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为分子量一般为10004000，浓度一般为，浓度一般为4060%。现在学习的是第7页，共25页2.PEG的的pH值值:经验证，经验证，PEG的的pH值在值在8.08.2之间融合效果最之间融合效果最好。好。3.PEG的处理时间的处理时间:处理时间越长，融合效果越好处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适故处理时间可适当放宽至数分钟。当放宽至数分钟。现在学习的是第8页，共25页4.融合时的温度融合时的温度:由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,在细在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞哺乳动物的细胞,一般采用的温度为一般采用的温度为3840。而本次试而本次试验基本在验基本在37 的条件下进行。的条件下进行。现在学习的是第9页，共25页实验选材：实验选材：本次试验选用本次试验选用鸡的外周血鸡的外周血做细胞融合材料做细胞融合材料,这是因为这是因为:1.鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2.实验材料便宜、易得，避免了用培养的细胞株做细实验材料便宜、易得，避免了用培养的细胞株做细胞融合实验材料所耗的实验成本和精力；胞融合实验材料所耗的实验成本和精力；3.细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。若细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多别。若细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。个核，定为融合细胞。现在学习的是第10页，共25页实验步骤：实验步骤：取新鲜鸡血取新鲜鸡血,制成体积分数制成体积分数10%鸡红细胞悬液。鸡红细胞悬液。称称0.5gPEG(MW=4000)，熔化。尽快加入，熔化。尽快加入0.5ml预热预热80的的Hanks 液，制成质量分数液，制成质量分数50%PEG，轻轻摇匀，散温，轻轻摇匀，散温，置置37恒温水浴箱中备用恒温水浴箱中备用（以防冷却后会形成结晶）（以防冷却后会形成结晶）。吸取吸取1 mL 悬液置刻度离心管中悬液置刻度离心管中,另加另加5 mLHanks 液液,混匀混匀,离心（离心（1000r/min）5min。现在学习的是第11页，共25页吸取吸取0.5mlPEG加入鸡红细胞沉淀管内，加入鸡红细胞沉淀管内，1min内加入离心管中，边滴边摇晃内加入离心管中，边滴边摇晃（此过程必须在（此过程必须在37 水浴箱中进行）水浴箱中进行）。静置静置1min后，加入后，加入9mlHanks液，轻轻液，轻轻吹打混匀，在吹打混匀，在37 水浴箱中放置水浴箱中放置10min。吸弃上清液，使沉淀物松散，置吸弃上清液，使沉淀物松散，置37水浴箱中维持。水浴箱中维持。现在学习的是第12页，共25页离心（离心（1000r/min）5min,吸弃上清吸弃上清液，加入液，加入1ml不含血清的不含血清的1640培养液，培养液，混匀后取混匀后取1滴悬液制成临时装片。滴悬液制成临时装片。用质量分数为用质量分数为0.12%的次甲基蓝染色。镜检。的次甲基蓝染色。镜检。离心（离心（1000r/min）5min,吸弃上清液，吸弃上清液，加入加入3ml含小牛血清的含小牛血清的1640培养液，轻轻吹培养液，轻轻吹打混匀，置打混匀，置37 水浴箱中温育水浴箱中温育30min。现在学习的是第13页，共25页注意事项：注意事项：1、注意、注意PEG浓度和作用时间等，即在制备鸡红细胞浓度和作用时间等，即在制备鸡红细胞沉淀物时，一定不要有残留的液体存在，并且要在沉淀物时，一定不要有残留的液体存在，并且要在37 水浴锅中于水浴锅中于15min内全部滴完内全部滴完PEG，这样融合的效果，这样融合的效果最好；最好；2、制备、制备50%PEG完后，需置于完后，需置于37 恒温水浴箱中备用，恒温水浴箱中备用，以防冷却后会形成结晶；以防冷却后会形成结晶；现在学习的是第14页，共25页讨论：讨论：经过小组成员内部讨论和查阅资料，我们对细胞经过小组成员内部讨论和查阅资料，我们对细胞融合实验的选材有了补充：我们也可以用蟾蜍血红细融合实验的选材有了补充：我们也可以用蟾蜍血红细胞进行这项实验，并且蟾蜍血红细胞也易取得。同时胞进行这项实验，并且蟾蜍血红细胞也易取得。同时也可做蟾蜍血红细胞与鸡血红细胞的融合实验，但实也可做蟾蜍血红细胞与鸡血红细胞的融合实验，但实验试剂需要改变：验试剂需要改变：1、Alsver液：液：葡萄糖葡萄糖2.05g，柠檬酸钠，柠檬酸钠0.8g，氯，氯 化钠化钠0.42g，加重蒸水至，加重蒸水至100mL即可。即可。现在学习的是第15页，共25页4、Ringer溶液：溶液：二氯化钠二氯化钠0.25g，氯化钾，氯化钾0.42g,氯化钠氯化钠6.5g,溶于溶于1000mL重蒸水中。重蒸水中。3、GKN液：液：氯化钠氯化钠8g,氯化钾氯化钾0.4g,磷酸氢二钠磷酸氢二钠 1.77g,磷酸二氢钠磷酸二氢钠0.69g,葡萄糖葡萄糖2g，酚红，酚红0.01g,溶于溶于1000mL重蒸水中。重蒸水中。2、0.85%生理盐水：生理盐水：0.85g氯化钠溶于氯化钠溶于100mL重蒸水重蒸水中。中。现在学习的是第16页，共25页5、50%PEG混合液：混合液：称取少许称取少许PEG（Mv=4000）放入刻）放入刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，待冷却至度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，待冷却至50 时，放入预热至时，放入预热至50 的等体积的的等体积的GKN液，混匀。液，混匀。（注（注意使用前配置）意使用前配置）但从上述过程看来，实际配制过程较为繁琐，因此，但从上述过程看来，实际配制过程较为繁琐，因此，我们还是选择鸡血红细胞进行实验。我们还是选择鸡血红细胞进行实验。现在学习的是第17页，共25页细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定实验原理实验原理 一、分离细胞质与细胞核一、分离细胞质与细胞核.破碎细胞破碎细胞细胞破碎的方法细胞破碎的方法机械法机械法高速组织捣碎机高速组织捣碎机玻璃匀浆器玻璃匀浆器研钵研钵物理法物理法超声匀浆器超声匀浆器冻融法冻融法化学法化学法自溶法自溶法酶处理酶处理表面活性剂处理法表面活性剂处理法现在学习的是第18页，共25页现在学习的是第19页，共25页细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同一细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心，将细胞各种组分分用不同介质和不同转速的离心，将细胞各种组分分级分离出来级分离出来(cell fractionation)。.离心技术离心技术组织细胞匀浆组织细胞匀浆分级分离分级分离分析分析现在学习的是第20页，共25页离离 心心 方方 法法差速沉降离心法差速沉降离心法速率区带离心法速率区带离心法等密度区带离心法等密度区带离心法密度梯度区密度梯度区带离心法带离心法 现在学习的是第21页，共25页差速离心法差速离心法differential centrifugation原理：由低速到高速逐渐沉降将不同大小的颗粒分离。原理：由低速到高速逐渐沉降将不同大小的颗粒分离。加速加速 低速低速高速高速 差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为差较大（一般为1010倍）的颗粒。倍）的颗粒。现在学习的是第22页，共25页二、细胞核的鉴定二、细胞核的鉴定 本次试验细胞选择的是小白鼠的本次试验细胞选择的是小白鼠的肝细胞肝细胞，这，这是因为肝细胞分裂旺盛。是因为肝细胞分裂旺盛。鉴定试剂：鉴定试剂：甲苯胺蓝甲苯胺蓝细胞来源：细胞来源：现在学习的是第23页，共25页 甲苯胺蓝甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染属于醌亚胺染料类料类,这类染料一般含有两个发色团这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基一个是胺基,一个是醌型一个是醌型苯环苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还还含有两个助色团含有两个助色团,为碱性染料为碱性染料,因此可以和组织细胞的酸性因此可以和组织细胞的酸性物质结合而使其染色。即可染细胞核使之呈蓝色。物质结合而使其染色。即可染细胞核使之呈蓝色。另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈易染性紫红色，因此可用于肥大细胞的检遇到甲苯胺蓝可呈易染性紫红色，因此可用于肥大细胞的检测，例如色素性荨麻疹。测，例如色素性荨麻疹。现在学习的是第24页，共25页实验步骤：实验步骤：1、颈椎脱臼法颈椎脱臼法处死小白鼠。迅速开腹取肝，在盛有生理盐处死小白鼠。迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤。水的小烧杯中反复洗涤。2、称取湿重约、称取湿重约1g的肝组织，量取的肝组织，量取8ml预冷的匀浆缓冲液预冷的匀浆缓冲液（0.25mol/L蔗糖蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液）并加入烧杯中，氯化钙溶液）并加入烧杯中，尽量剪碎肝组织。尽量剪碎肝组织。3、将剪碎的肝组织倒入匀浆器匀浆将剪碎的肝组织倒入匀浆器匀浆（匀浆器下段浸（匀浆器下段浸 入入盛有冰块的小烧杯中保持低温）盛有冰块的小烧杯中保持低温），捣毁组织，直至看，捣毁组织，直至看不到明显的组织块。不到明显的组织块。现在学习的是第25页，共25页