基因探针分子杂交技术.ppt

基因探基因探针分子分子杂交技交技术现在学习的是第1页，共29页目录v简介简介v基本原理基本原理v分类分类v历史及发展历史及发展v主要应用主要应用现在学习的是第2页，共29页基因探针v基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或或RNA)。FISH现在学习的是第3页，共29页基因探针分析的基本原理v两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互补的碱基序列补的碱基序列,或者说具有一定的同源性或者说具有一定的同源性,就可以就可以特异性结合特异性结合,形成双链杂种分子形成双链杂种分子,这种结合称为核这种结合称为核酸分子杂交。酸分子杂交。v如果用已知核酸如果用已知核酸(通常是通常是DNA)DNA)片段作为探针片段作为探针,通过通过与未知核酸与未知核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)样品进行杂交试验样品进行杂交试验,根据两根据两者杂交状况的分析者杂交状况的分析,就可以确定它们同源性程度就可以确定它们同源性程度,检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。这检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。这便是核酸探针分析的基本原理。便是核酸探针分析的基本原理。现在学习的是第4页，共29页分子杂交技术的分类v根据其检测对象不同，可分为根据其检测对象不同，可分为检测对象检测对象探针探针Southern杂交杂交DNA核酸核酸Northern杂交杂交RNA核酸核酸Western杂交杂交蛋白质蛋白质抗体抗体v根据探针来源的不同，可分为根据探针来源的不同，可分为来源来源基因组探针基因组探针（genomicprobe）基因组基因组cDNA探针探针（cDNAprobe）mRNA寡核苷酸探针寡核苷酸探针（OligonucleotidesProbe）人工合成人工合成现在学习的是第5页，共29页基本操作程序印迹（blotting）将样品在凝胶将样品在凝胶上分离，然后上分离，然后将样品通过将样品通过“影印影印”的方式的方式转移到固相支转移到固相支持物上（如滤持物上（如滤膜）。膜）。杂交将已印迹有样将已印迹有样品的滤膜与带品的滤膜与带有放射性标记有放射性标记或其它标记的或其它标记的探针进行杂交。探针进行杂交。结果检测通过放射自显通过放射自显影或显色反应，影或显色反应，判断样品中是判断样品中是否有与探针同否有与探针同源的分子。源的分子。现在学习的是第6页，共29页Southern杂交检测样品检测样品DNA的处理的处理电泳分离及变性处理电泳分离及变性处理转移并固定到滤膜上转移并固定到滤膜上探针的制备及杂交探针的制备及杂交检测与分析检测与分析现在学习的是第7页，共29页检测样品DNA的处理v提取检测样品的基因组提取检测样品的基因组DNAv用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段片段现在学习的是第8页，共29页电泳分离及变性处理v琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段片段v变性处理变性处理v通常DNA变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性v在在0.4MNaOH碱性条件下变性碱性条件下变性凝胶凝胶0.4MNaOH现在学习的是第9页，共29页转移并固定到滤膜上v通过毛细管虹吸法，将凝胶上的通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝酸转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将DNA固定在滤膜上固定在滤膜上。现在学习的是第10页，共29页转移的方法v毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法现在学习的是第11页，共29页探针的制备v一、探针的合成 PCR、化学合成等方法v二、探针的标记 同位素：3H、3535S、3232P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等现在学习的是第12页，共29页地高辛：地高辛：可以与可以与可以与可以与dCTPdCTPdCTPdCTP连接成地高辛连接成地高辛连接成地高辛连接成地高辛-dCTPdCTPdCTPdCTP 原理：原理：原理：原理：地高辛地高辛地高辛地高辛 +抗地高辛抗体抗地高辛抗体抗地高辛抗体抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）（带有荧光素或酶的标记）（带有荧光素或酶的标记）（带有荧光素或酶的标记）现在学习的是第13页，共29页现在学习的是第14页，共29页杂交v预杂交：预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。v杂交：杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。现在学习的是第15页，共29页v洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。精确控制杂交及洗涤条件（如温度及盐浓度），在同源序列中即使有一对碱基错配也可检出。这技术已应用于遗传病（基因病）的临床诊断。安装杂交管杂交炉现在学习的是第16页，共29页检测与分析v1 1、放射自显影：适用于放射性同位素标记的、放射自显影：适用于放射性同位素标记的探针探针v2 2、比色或、比色或化学发光化学发光检测：适于非同位素标记的检测：适于非同位素标记的探针探针v通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的是否存在与探针同源的DNADNA分子及其分子量。分子及其分子量。现在学习的是第17页，共29页Northern杂交v1 1、检测对象为、检测对象为RNARNA。v2 2、与、与SouthernSouthern杂交不同的是：杂交不同的是：1 1）不需要限）不需要限制性核酸酶切；制性核酸酶切；2 2）变性方法不是碱变性，而）变性方法不是碱变性，而是采用化学试剂变性法。是采用化学试剂变性法。v3 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知的特、主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异异mRNAmRNA的表达水平，或比较不同组织或细胞的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。的同一基因的表达情况。现在学习的是第18页，共29页Western杂交v1 1、基本原理和基本过程与、基本原理和基本过程与SouthernSouthern杂交基杂交基本相同本相同v2 2、检测对象为蛋白质（或酶）、检测对象为蛋白质（或酶）v3 3、SDS-PAGE SDS-PAGE 电泳分离电泳分离v4 4、用用“抗体抗体-抗原抗原”免疫反应或免疫反应或“DNA-DNA-proteinprotein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。现在学习的是第19页，共29页历史及发展v1969年，Gall和Pardue（YaleUniversity）等首次将同位素探针同位素探针用于原位杂交实验，获得成功。1987年，染色体原位抑制杂交法的创建，使FISH技术得以迅速发展。随后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素等非放射性物质标记探针，创立了双色双色FISH技术。技术。1990年，Nederlof等用3种荧光素成功探测出了3种以上的靶位DNA序列，从而宣告了多色多色FISH技术技术的问世。vSouthern印迹杂交（Southernblot）是1975年由英国爱丁堡大学的E.M.Southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。v蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治斯塔克（GeorgeStark）。在尼尔伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的分析生物化学（AnalyticalBiochemistry）中首次被称为WesternBlot。v发展：基因芯片技术、生物传感器等。现在学习的是第20页，共29页分子杂交技术的主要应用v1.1.基因工程和分子生物学研究基因工程和分子生物学研究v2.2.检测病原微生物及寄生虫检测病原微生物及寄生虫v3.3.普查和诊断遗传性疾病普查和诊断遗传性疾病 v4.4.法医物证学法医物证学现在学习的是第21页，共29页基因工程和分子生物学研究 作为生物技术核心的基因工程作为生物技术核心的基因工程(重组重组DNADNA技技术术)是是7 70 0年代兴起的、按人们意愿定向改造生年代兴起的、按人们意愿定向改造生物遗传性状的技术。物遗传性状的技术。其主要步骤是取得目的其主要步骤是取得目的DNA,DNA,与载体与载体DNADNA体体外重组外重组,将重组将重组DNADNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞,筛选能够筛选能够表达重组表达重组DNADNA的细胞加以传代扩增。这中间筛的细胞加以传代扩增。这中间筛选步骤选步骤,就可以用就可以用DNADNA探针进行菌落或噬菌体原探针进行菌落或噬菌体原位杂交来完成。位杂交来完成。现在学习的是第22页，共29页基因工程和分子生物学研究v分子生物学研究中凡涉及核酸的定位、定量及序分子生物学研究中凡涉及核酸的定位、定量及序列分析等方面的工作列分析等方面的工作,诸如染色体基因定位诸如染色体基因定位,基因突基因突变及不同种属间基因变异的研究变及不同种属间基因变异的研究,细胞细胞中中DNADNA的转的转录过程的研究录过程的研究,以及探讨病毒、肿瘤基因和细胞癌以及探讨病毒、肿瘤基因和细胞癌变之间可能存在的关系等变之间可能存在的关系等,都需要应用分子探针技都需要应用分子探针技术。术。现在学习的是第23页，共29页检测病原微生物及寄生虫v对于人体或环境中存在的细菌、病毒微生物对于人体或环境中存在的细菌、病毒微生物,现行检现行检测方法既费时又不够准确。如果用特异的测方法既费时又不够准确。如果用特异的DNADNA探针检探针检测微生物包含的核酸片段测微生物包含的核酸片段,不但灵敏快速不但灵敏快速,而且特异而且特异性强性强,甚至可以分析同种异株间的区别。甚至可以分析同种异株间的区别。DNADNA探针推探针推广至微生物检验上广至微生物检验上,对于诊断传染病、开展流行病学对于诊断传染病、开展流行病学研究将有重要意义。研究将有重要意义。现在学习的是第24页，共29页检测病原微生物及寄生虫乙型肝炎是危害我国人民健康的大敌乙型肝炎是危害我国人民健康的大敌,现在已现在已开发开发DNADNA探针法检测乙肝病毒探针法检测乙肝病毒DNADNA的技术的技术,比现行的比现行的免疫学检验结果更灵敏可靠免疫学检验结果更灵敏可靠,是普查乙肝传染的强是普查乙肝传染的强有力手段有力手段,该技术正在国内普及推广。该技术正在国内普及推广。此外此外,DNA,DNA探针还可以应用于对利什曼原虫病、探针还可以应用于对利什曼原虫病、疟原虫病等寄生虫感染疾病的诊断。疟原虫病等寄生虫感染疾病的诊断。现在学习的是第25页，共29页普查和诊断遗传性疾病人类和动物的遗传性疾病是由于基因人类和动物的遗传性疾病是由于基因DNADNA的缺陷经遗传引起的。目前已知的三千多种的缺陷经遗传引起的。目前已知的三千多种遗传性疾病中遗传性疾病中,只有很少一部分可以通过检测只有很少一部分可以通过检测基因的表达产物基因的表达产物(蛋白质或酶蛋白质或酶)的改变予以诊断。的改变予以诊断。用用DNADNA探针可以在探针可以在DNADNA水平分析基因结构的水平分析基因结构的缺陷缺陷,突破依靠基因的蛋白产物进行诊断的局突破依靠基因的蛋白产物进行诊断的局限。限。现在学习的是第26页，共29页普查和诊断遗传性疾病v对于因为基因内点突变或基因部分缺失、重排对于因为基因内点突变或基因部分缺失、重排或插入而引起的遗传性疾病或插入而引起的遗传性疾病,可以用可以用DNADNA探针进探针进行行SouthernSouthern印渍杂交直接加以分析诊断。印渍杂交直接加以分析诊断。v对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传性疾对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传性疾病病,则需要用则需要用DNADNA探针技术分析限制性片段长度探针技术分析限制性片段长度多态性多态性,以此作为遗传标志作出分析诊断。以此作为遗传标志作出分析诊断。v总之总之,DNA,DNA探针技术有助于开展产前诊断或遗传探针技术有助于开展产前诊断或遗传咨询、携带者普查咨询、携带者普查,为防治遗传性疾病开辟了新为防治遗传性疾病开辟了新路。路。现在学习的是第27页，共29页法医物证学v人类染色体中存在许多分散的具有串联重复单位人类染色体中存在许多分散的具有串联重复单位的微小卫星区。利用人体卫星区的微小卫星区。利用人体卫星区DNADNA作探针检测不作探针检测不同个体的卫星区同个体的卫星区,产生相应的产生相应的DNADNA指纹图谱指纹图谱,这是这是由由JeffeysJeffeys等在等在19851985年首创年首创,随后几年中迅速获得随后几年中迅速获得发展完善的发展完善的DNADNA指纹图谱法新技术。指纹图谱法新技术。（NatureNature，19851985）v法医学中进行个人识别法医学中进行个人识别,可以对犯罪现场的血迹或可以对犯罪现场的血迹或衣物上残留的体液干斑进行衣物上残留的体液干斑进行DNADNA指纹测定指纹测定,经核对经核对指纹档案便可判断案情。指纹档案便可判断案情。vDNADNA指纹图谱法还可用于亲权鉴定、血液种属区别指纹图谱法还可用于亲权鉴定、血液种属区别和性别鉴定等工作。和性别鉴定等工作。现在学习的是第28页，共29页现在学习的是第29页，共29页