免疫学检测技术 (3)讲稿.ppt

关于免疫学检测技术(3)第一页，讲稿共四十一页哦 免免免免疫疫疫疫学学学学诊诊诊诊断断断断第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测第二页，讲稿共四十一页哦 抗原抗体反应的原理抗原抗体反应的原理物质基础：抗原的物质基础：抗原的抗原决定基抗原决定基与抗体与抗体的的抗原结合部位抗原结合部位之间的结构互补性。之间的结构互补性。两者相互结合，在适宜条件下，出现可两者相互结合，在适宜条件下，出现可见反应。见反应。第三页，讲稿共四十一页哦 一、抗原抗体反应的一、抗原抗体反应的特点及其影响因素特点及其影响因素1、特异性、特异性2、可见性（比例适合）、可见性（比例适合）3、可逆性、可逆性第四页，讲稿共四十一页哦1.特异性特异性抗原A抗原C抗原B特异性反应交叉反应无反应第五页，讲稿共四十一页哦2、抗原抗体反应的可见性、抗原抗体反应的可见性抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象适合比例性适合比例性抗体含量抗原含量前带后带等价带第六页，讲稿共四十一页哦网格学说（网格学说（lattice theorylattice theory）抗体过剩抗原过剩抗体抗体比例合适第七页，讲稿共四十一页哦3.可逆性可逆性亲和力（亲和力（亲和力（亲和力（affimityaffimity）与亲合力（）与亲合力（）与亲合力（）与亲合力（avidityavidity）抗体抗原之间的结合力大小。抗体抗原之间的结合力大小。抗体抗原之间的结合力大小。抗体抗原之间的结合力大小。结合力大则亲和力强结合力大则亲和力强，不易解离，反之则然。，不易解离，反之则然。K（亲和常数）=Ag+AbAg Ab第八页，讲稿共四十一页哦应应 用用1、利用已知抗原检测未知抗体、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤伤寒病、流行性乙型脑炎、寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。病等。（2）检测自身抗体）检测自身抗体诊断自身免疫病：诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节、类风湿性关节炎等炎等2、利用已知抗体检测未知抗原、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原：）检测药物半抗原：确认运动员是否服用兴奋剂确认运动员是否服用兴奋剂第九页，讲稿共四十一页哦二、二、抗原或抗体的检测方法抗原或抗体的检测方法 凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应补体参与的抗原抗体反应补体参与的抗原抗体反应免疫标记技术免疫标记技术第十页，讲稿共四十一页哦第十一页，讲稿共四十一页哦 （一）（一）凝集反应（凝集反应（agglutinationagglutination）颗颗粒粒性性抗抗原原（红红细细胞胞、细细菌菌、乳乳胶胶颗颗粒粒等等）与与抗抗体体特特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。异性结合，形成肉眼可见的凝集块。1 1、直接凝集、直接凝集、直接凝集、直接凝集(direct agglutination)(direct agglutination)玻片凝集、试管凝集玻片凝集、试管凝集玻片凝集、试管凝集玻片凝集、试管凝集2 2、间接凝集（、间接凝集（、间接凝集（、间接凝集（indirect agglutinationindirect agglutination）3 3、抗球蛋白试验（、抗球蛋白试验（、抗球蛋白试验（、抗球蛋白试验（CoombsCoombs试验）试验）试验）试验）抗原与单价抗体（不完全抗体）结合不出现凝集抗原与单价抗体（不完全抗体）结合不出现凝集块，再加入抗球蛋白后即形成凝集块。块，再加入抗球蛋白后即形成凝集块。用于检测抗用于检测抗用于检测抗用于检测抗RhRh抗体以诊断新生儿溶血性贫血。抗体以诊断新生儿溶血性贫血。抗体以诊断新生儿溶血性贫血。抗体以诊断新生儿溶血性贫血。血细胞凝集实验及补体血细胞凝集实验及补体结合实验结合实验第十二页，讲稿共四十一页哦第十三页，讲稿共四十一页哦（二）沉淀反应（二）沉淀反应（precipitationprecipitation）1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）：常用于测定）：常用于测定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。等。可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合，与相应抗体结合，与相应抗体结合，与相应抗体结合，形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。沉淀环沉淀环沉淀环沉淀环抗体混于琼脂凝抗体混于琼脂凝抗体混于琼脂凝抗体混于琼脂凝胶中制板胶中制板胶中制板胶中制板环的直径与抗原含量环的直径与抗原含量环的直径与抗原含量环的直径与抗原含量成正相关成正相关成正相关成正相关单向免疫扩散及免疫电泳单向免疫扩散及免疫电泳第十四页，讲稿共四十一页哦1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）：常用于测定）：常用于测定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。等。第十五页，讲稿共四十一页哦（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术第十六页，讲稿共四十一页哦 用用用用标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性的敏感性的敏感性的敏感性荧光素荧光素荧光素荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧异硫氰酸荧光素（黄绿色荧异硫氰酸荧光素（黄绿色荧异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、光）、藻红蛋白、光）、藻红蛋白、光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧罗丹明（红色荧罗丹明（红色荧罗丹明（红色荧光）光）光）光）放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素：125125I I、131131I I酶：酶：辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶硷性磷酸酶免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（IFAIFA）放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（RIARIA）酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（EIAEIA）免疫标记技术免疫标记技术液相（液相（液相（液相（ELISAELISA）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）第十七页，讲稿共四十一页哦流式细流式细胞仪胞仪第十八页，讲稿共四十一页哦临床应用vT、B细胞及其亚群的鉴定细胞及其亚群的鉴定v血清中自身抗体的检测血清中自身抗体的检测v组织中组织中Ig及补体组分的检测及补体组分的检测v肿瘤抗原的检定肿瘤抗原的检定v细菌和病毒的快速检定细菌和病毒的快速检定v特异的组织固定抗体检测特异的组织固定抗体检测第十九页，讲稿共四十一页哦2.酶免疫分析酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)酶免疫分析分类：非非 均均 相相 酶酶 免免 疫疫 测测 定定(heterogeneous enzyme immunoassay)均相酶免疫测定均相酶免疫测定(homogeneous enzyme immunoassay)常用标记酶：HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。非非均均相相酶酶免免疫疫测测定定(heterogeneous(heterogeneous enzyme enzyme immunoassay)immunoassay)是是目前应用最广泛，又分为目前应用最广泛，又分为：固相酶免疫测定固相酶免疫测定：琼脂糖珠(Sepharose 4B)作为载体的DASS体系 聚苯乙烯及其他固相支持物的酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 液相酶免疫测定液相酶免疫测定 第二十页，讲稿共四十一页哦v9）酶联免疫斑点试验）酶联免疫斑点试验第二十一页，讲稿共四十一页哦第二节第二节 免疫分子的免疫分子的常用检测方法常用检测方法第二十二页，讲稿共四十一页哦v血清免疫球蛋白的定量测定血清免疫球蛋白的定量测定（IgG、IgM、IgA）单向免疫扩散、免疫比浊法单向免疫扩散、免疫比浊法v细胞因子检测 生物学方法：生物活性测定 免疫学方法：ELISA 分子生物学方法：PCR第二十三页，讲稿共四十一页哦 第三节淋巴细胞的测定第三节淋巴细胞的测定第二十四页，讲稿共四十一页哦一、免疫细胞的分离与纯化一、免疫细胞的分离与纯化(一一)淋巴细胞的分离：淋巴细胞的分离：外周血葡聚糖外周血葡聚糖外周血葡聚糖外周血葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法泛影葡胺密度梯度离心法泛影葡胺密度梯度离心法泛影葡胺密度梯度离心法白膜层白膜层白膜层白膜层单核细胞单核细胞单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞B BT T吸附分离吸附分离吸附分离吸附分离过尼龙毛柱分离过尼龙毛柱分离过尼龙毛柱分离过尼龙毛柱分离第二十五页，讲稿共四十一页哦细胞免疫功能的检测淋巴细胞的分离1500rpm,20度,30min第二十六页，讲稿共四十一页哦二、免疫细胞功能测定第二十七页，讲稿共四十一页哦 T T细胞增生细胞增生(转化转化)试验试验 T T细胞介导的细胞毒试验原理细胞介导的细胞毒试验原理 T T细胞功能的体内检测法细胞功能的体内检测法 流式细胞术流式细胞术 T T分泌细胞因子功能测定分泌细胞因子功能测定（一）（一）T T细胞功能测定细胞功能测定免疫荧光测定及荧光免疫分选免疫荧光测定及荧光免疫分选第二十八页，讲稿共四十一页哦（1）T细胞增殖试验（淋转）细胞增殖试验（淋转）丝裂原、抗丝裂原、抗CD3单克隆抗体等能非特异地激活单克隆抗体等能非特异地激活T细细胞，使之发生转化增殖，计算淋巴母细胞转化率胞，使之发生转化增殖，计算淋巴母细胞转化率（正常值（正常值6580%）。形态学观察法形态学观察法 3H-TdR渗入法：用液体闪烁仪测定样品的渗入法：用液体闪烁仪测定样品的射线放射活性射线放射活性 MTT法法第二十九页，讲稿共四十一页哦放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋淋巴巴细细胞胞转转化化试试验验原原理理示示意意第三十页，讲稿共四十一页哦51Cr释放法释放法 凋亡细胞检查法：凋亡细胞检查法：TUNEL法（法（TdT dependent dUTP-biotin nick end labeling）、）、FACS测定法测定法（2）淋巴细胞介导的细胞毒试验（）淋巴细胞介导的细胞毒试验（LMC）检测检测CTL、NK、LAK、TIL杀伤靶细胞功能杀伤靶细胞功能第三十一页，讲稿共四十一页哦放射性测定细细胞胞毒毒试试验验原原理理示示意意细细靶细胞效应细胞分离上清第三十二页，讲稿共四十一页哦（3）细胞因子检测：）细胞因子检测：鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾病状鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。态的细胞免疫功能。IL-2、IL-2R、rIFN、TNF等检测等检测ELISA法法 生物活性测定法生物活性测定法 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）法）法第三十三页，讲稿共四十一页哦（2）抗体形成细胞测定）抗体形成细胞测定 溶血空斑试验溶血空斑试验 （hemolytic forming cell assay，HFC）计算计算HFU/ml（二）（二）B细胞功能测定细胞功能测定（1）B细胞增殖试验：细胞增殖试验：LPS、SPA刺激，检查抗体形刺激，检查抗体形成细胞的数目成细胞的数目（3）ELISPOT法法检查特异抗体形成细胞检查特异抗体形成细胞第三十四页，讲稿共四十一页哦第四节第四节 免疫学检测方法的应用免疫学检测方法的应用 评估与选择 特异性（specificity）敏感性（sensitivity）第三十五页，讲稿共四十一页哦特异性（特异性（specificity）用该试验检查非患者时出现阴性结果用该试验检查非患者时出现阴性结果的可能性。的可能性。敏感性（敏感性（sensitivity）用该试验检查某病患者时出现阳性结果用该试验检查某病患者时出现阳性结果的可能性。的可能性。第三十六页，讲稿共四十一页哦 特异性特异性=真阴性真阴性/（真阴性（真阴性+假阳性）假阳性）100%100%敏感性敏感性=真阳性真阳性/（真阳性（真阳性+假阴性）假阴性）100%100%第三十七页，讲稿共四十一页哦表表 免疫学测定方法敏感性比较免疫学测定方法敏感性比较测定方法测定方法敏感性（每升）敏感性（每升）单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验1 12mg2mg双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验1mg1mg火箭电泳火箭电泳0.5mg0.5mg对流电泳对流电泳0.1mg0.1mg免疫电泳免疫电泳5 510mg10mg凝集试验凝集试验1g1g被动血凝试验被动血凝试验1g1g血凝抑制试验血凝抑制试验0.1g0.1g补体结合试验补体结合试验0.1g0.1g放射免疫分析法放射免疫分析法1pg1pg酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验1ng1ng定量免疫荧光分析定量免疫荧光分析1pg1pg第三十八页，讲稿共四十一页哦临床应用临床应用v感染性疾病感染性疾病v免疫缺陷病免疫缺陷病v免疫学监测免疫学监测第三十九页，讲稿共四十一页哦本章小结本章小结1 1、凝集反应与沉淀反应、凝集反应与沉淀反应2 2、免疫标记技术的概念与应用、免疫标记技术的概念与应用3 3、免疫细胞的检测、免疫细胞的检测第四十页，讲稿共四十一页哦感谢大家观看26.09.2022第四十一页，讲稿共四十一页哦