低产蛋白酶A啤酒酵母的选育及在啤酒中试酿造中的应用.pdf

新疆农业大学硕士学位论文低产蛋白酶A啤酒酵母的选育及在啤酒中试酿造中的应用姓名：张卓申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：傅力;王德良20080501摘要纯生啤酒泡沫稳定性是纯生啤酒质量保证的难题，啤酒酵母自身分泌的蛋白酶A是影响啤酒泡沫稳定性的关键物质。本论文采用诱变选育的方法筛选低产蛋白酶A 的突变菌株，拟从根本上解决蛋白酶A 对啤酒泡沫稳定性的影响。本研究采用了H e N e 激光，亚硝酸、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯(E M S)多种理化诱变方法，确定各种诱变方法的最佳实验条件并且比较了以上几种诱变方法的诱变效果。结果表明：连续使用亚硝基胍和E M S 的诱变效果最好，筛选出1 0 株突变株，其中5 株菌株的荧光强度下降率大于1 5；单独使用亚硝基胍和E M S 诱变的效果次之，亚硝基胍诱变得到4 株突变株，荧光强度下降大于1 0 的有2 株，E M S 诱变得到2株突变株，荧光强度的下降率均大于1 0；亚硝酸诱变的效果再次之，得到的2 株突变株，荧光强度下降率低于1 0 9 6；激光诱变对筛选低蛋白酶A 菌株无效果。对通过上述各种诱变方法选育出的1 8 株突变株进行发酵性能及遗传稳定性实验，通过综合评价其发酵性能，双乙酰还原能力，异戊醇、异丁醇、正丙醇、乙酸乙酯等风味物质的含量、蛋白酶A 活力及遗传稳定性能，最终得到一株发酵性能良好、蛋白酶A活力降低率高、遗传稳定性好的突变株G M 2 3 5 进行中试试验。中试试验表明突变株G M 2 3 5 在I O O L 罐发酵9 天，与出发菌株H 相比突变株G M 2 3 5 的降糖能力、双乙酰还原能力略强，啤酒各项风味物质含量中正丙醇含量略高，异丁醇、异戊醇、活性戊醇、乙酸乙酯的含量均低于出发菌株，突变株G M 2 3 5 中试生产的啤酒泡沫更为细腻、持久。突变株的各项发酵性能均优于出发菌株H，且发酵终止时蛋白酶A 活力明显低于出发菌株，酶活降低率为1 9 3 1，具有很好的工业应用前景。关键词：啤酒酵母、蛋白酶A、诱变选育、中试研究A BS T R A C TT h es t a b i l i 付o fd r a f tb e e rf o a mi sac r i t i c a lc h a r a c t e rt h a tr e f l e c t sb e e rq u a l i t y A l t h o u g ht h e r ea r em 删，f a c t o f st h a tP O s i t i v e l ya n dn e g a t i v e l yi n f l u e n c ef o a ms t a b i l i t y，t h em o s ti m p o r t a n tn e g a t i v e 缸t o ri sp r o t e i n 猫eA B r e w i n gy e a s te x c r e t e sp r o t e i n a s eAi n t ot h ew o r td u r i n gf e m e n t a t i o n P r o t e i n a S eAd i m i n i s h e st h eh y d r o p h o b i c i t yo ff o a m-p o s i t i v ep o l y p e p t i d e sa n dr e d u c e sb e e rf o a ms t a b i l i t y T h e 咖d ym a i n l y 矗l l s e s0 nb r e e d i n go fb r e w i n gy e a s to ft h el o wa b i l i t yt oe x c r e t ep r o t e i n a s eAd u r i n gw o r tf e m e n t a t i o n M 觚ym u t a g e n e s i sm e t h o d s，i n c l u d i n gH e-N el a s e rp h y s i c sm u t a g e n e s i s，a n dn i t r i t e，N T G，E M Sc h e m i c a im u t a g e n e s i s，w e r eu s e da n dt h eo p t i m a le x p e r i m e n tc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d T 1 1 em u t a t i o ne 骶c t so fc o n t i n u o u su s e dN T Ga n dE M Sw a st h eb e s ta m o n gt h e s em u t a g e n s T h e nt h ec o m b i n a t i o nN T Ga n dE M Sw e r e 州a n do b t a i n e das t r a i t r-G M 2 3 5w i t hg o o df e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c ea n dl o wp r o t e a s eAl e v e r G M 2 3 5W a sa p p l i e dt os c a l i n g-u pf e r m e n t a t i o n T h es c a l i n g-u pf e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c ea n df l a v o ro fm u t a n tG M 2 3 5w e r eb e 做rt h 锄o r i g j n a ls t r a i n，a n dp r o t e i n a s ev i t a l i t yr e d u c e db y1 9 3 1，u n d e rc o n d i t i o n so f1 0 0 Lf e r m e n t o rf o r9d a y s B o t ht h ea b i l i t yo fd e c l i n eo fs u g a rc o n c e n t r a t i o na n dr e d u c i n gp o w e ro fd i a c 2 t y lw e r es l i g h t l ys t r o n g e r N p r o p y la l c o h o lw a ss l i g h t l yh i g h e r,w h i l ei s o b u t a n o l，i s o a m y la l c o h o l，a c t i v e 锄y la l c o h o Ia n da c e t i d i n t h ew e r ea l ll o w e r B e e rf o a mf r o mm u t a n tG M 2 3 5f e r m e n t a t i o nW a sm o r ed e l i c a t ea n dl a s t e dI o n g e rt h a no r i g i n a ls t r a i n T h em u t a n tG M 2 3 5i sas t r a i nw i t hg o o da p p l i c a t i o np r o s p e c ti nt h eb e e rb r e w i n g K e yw o r d s：S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e，p r o t e a s eA，M u t a g e n e s i sa n db r e e d i n g,s c a l i n g-u pf e 咖e n t a t i o nI I独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：涨牟-时间：力略年月E l关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：我阜导师签名：谗右时间：徊万年6 月厂日时间：知D 脾月乡日新疆农业大学硕j|：学位论文第一章文献综述1 1 国内外纯生啤酒发展概况啤酒是世界性饮料酒，历史悠久，很受广大消费者喜爱。这种传统产品随着科技进步、人民生活水平和文化水平的提高，以及消费意识和消费知识的增加而不断发展，越来越多的消费者追求健康时尚、口感新鲜、自然、卫生、安全营养、有益于健康的饮品，纯生啤酒就是人们所喜欢的一种营养饮品。纯生啤酒利用低温膜过滤技术，在无菌条件下把发酵液中的酵母菌及其它可能的微生物全部过滤，然后在无菌操作环境中把啤酒灌装到经严格消毒灭菌的啤酒瓶中而生产的不经任何加热杀菌的无菌啤酒。纯生啤酒没有经过加热、未受到加热所导致啤酒加速氧化，保持了新鲜啤酒的营养成分和风味物质，因而纯生啤酒的口味更纯正、营养更丰富、更加受到消费者青睐。自从1 9 6 7 年日本S u n t o r y 采用M i l l i p o r e 大盘式膜过滤并用于纯生啤酒除菌过滤，成为全球第一家生产瓶装和听装纯生啤酒厂家，到1 9 9 7 年1 0 月，日本K i r i n所有生产线均采用膜过滤生产纯生啤酒，至此整个日本啤酒市场均为纯生啤酒。1 9 9 6 年，珠江啤酒集团公司根据对国内外啤酒市场和技术的了解，购买了国内第一条瓶装纯生啤酒生产线，结合珠江啤酒的工艺特点及产品特性，开发生产了瓶装无菌纯生啤酒系列，填补了国内这一啤酒品种的空白。近几年来，国内众多有实力啤酒企业纷纷进军“纯生市场，这是中国啤酒业可喜的飞跃，它标志着中国啤酒业正走向风味稳定性竞争的新阶段，标志着中国啤酒酿造技术划时代的进步，拉近了我国与国外啤酒行业的距离。从啤酒行业产品创新的角度看，纯生啤酒己代表了我国啤酒业的发展方向。尽管我国内啤酒总产量连续四年位居世界第一，但是由于纯生啤酒的酿造是啤酒界的一次革命，从原料、工艺、设备均与传统酿造啤酒有着巨大的区别，突出的特点就是无菌酿造、设备价值昂贵、生产成本加大，因而纯生啤酒是高科技产品，也由于以上原因限制纯生啤酒在国内的进一步发展。与日本、美国、德国相比较，我们国内纯生占啤酒总产量的比例依然很小，日本啤酒基本都是纯生啤酒；啤酒故乡德国纯生啤酒产销量已占全部产销量的5 0 以上；美国纯生啤酒的市场份额则已经到了3 0；2 0 0 6 年我国啤酒产量达到3 5 0 0 万吨，而纯生啤酒产量大约占啤酒总产量的5。我国作为世界第一的啤酒生1低产蛋白酶A 酵母荫株的选育及中试酿造的研究l 量皇罾曼曼舅曼曼!曼!曼曼曼量产大国，随着整体技术装备和技术管理水平的不断提升，和人们生活水平的提高、消费观念的转变以及啤酒酿造技术的进步，纯生啤酒在啤酒总产量的比重将持续上升。1 2 影响纯生啤酒质量的主要问题一纯生啤酒泡沫的稳定性啤酒的泡沫稳定性(f o a ms t a b i l i t y)又称为啤酒的泡持性，即泡沫的存在时间，指啤酒注入杯中，自泡沫形成至泡沫崩溃所持续的时间。按照欧洲酿酒协会的定义，纯生啤酒泡沫的性能包括起泡性、泡沫稳定性、泡沫挂杯和泡沫的外观等密切相关的几个方面n 1。因此纯生啤酒泡沫的质量是泡沫的稳定性、挂杯性、白皙度等一系列内在关联特性的总和。其中泡沫的稳定性是其他特征存在的前提和基础，是啤酒泡沫质量的关键。根据国家标准G B 4 9 2 7-2 0 0 1 的要求，优级纯生啤酒的泡持性应该大于2 0 0 秒。当前纯生啤酒已经成为啤酒行业更新换代的方向性产品，同时作为啤酒企业的高科技产品，呈现出良好的发展态势。然而纯生啤酒泡沫稳定性方面却存在明显的缺陷，即随着货架时间的延长，啤酒泡沫稳定性逐渐下降(如图卜l 所示)。纯生啤酒泡沫稳定性的衰减问题已经成为影响中国，乃至世界范围内纯生啤酒发展的最大障碍。与此同时由于其泡沫的衰减，影响消费者对产品的认可程度，影响啤酒生产企业的经济效益和社会效益，已经成为制约纯生啤酒发展的“瓶颈”。纯生啤酒泡沫的稳定性是当今世界纯生啤酒质量保证的难题，每两年一次的国际顶尖啤酒酿造大会一欧洲酿酒大会(E u r o p e a nB r e w e r yC o n v e n t i o n)自9 0 年代以来连续有一个部分专门关于啤酒泡沫稳定性的最新研究动态报道和讨论瞳1，因此如何提高纯生啤酒泡沫稳定性将成为啤酒行业及相关科研人员的研究热点。22 5 02 0 0仓1 5 0菱1 0 0赠5 00l234567891 01 11 21 3时间(周)口纯生啤酒口普通啤酒图卜1 同一批次纯生啤酒和普通啤酒贮藏期间的泡沫稳定性F i g 1 一lF o a ms t a b i l i t yt r a c k i n go f p u r ed r a f tb e e ra n do r d i n a r yb e e rw i t ht h es a m eb a t c h薪疆农q k 大学硕士学位论文1 3 影响纯生啤酒泡沫的稳定性的主要因素一蛋白酶A影响啤酒泡沫稳定性的因素很多，包括蛋白酶A、蛋白质、类黑素、多糖、二氧化碳、异一Q 一酸、金属离子、水、酒精等啤酒成分对泡沫均有影响口1。由于纯生啤酒生产工艺的特殊性，即与熟啤酒相比较纯生啤酒未经过巴氏杀菌，因此啤酒中残留的蛋白酶是造成纯生啤酒存放过程中泡沫衰减的一个主要因素。一般说来，啤酒酿造过程中蛋白酶主要有两个来源。其一是来源于麦芽，在大麦发芽时会有自然蛋白酶产生，它可以降解蛋白质产生足够的有泡沫稳定性的多肽；其二是来源于酵母，酵母含有多种蛋白酶，主要包括蛋白酶A、蛋白酶B，羧肽酶Y 和S(C P Y、C P S)、氨肽酶C o 和氨肽酶I、二肽酰氨肽酶等H 1。由于来自麦芽的蛋白酶经麦汁煮沸后即失去活性，因此不会对啤酒泡沫稳定性产生影响。来自酵母的蛋白酶根据其水解部位分为两大类，蛋白内切酶(蛋白酶A 和蛋白酶B)和蛋白外切酶(羧肽酶和氨肽酶)。由于与泡沫有关的蛋白分子较大，分子量4 0 k 道尔顿的Z 4 蛋白、Z 7 蛋白和分子量为1 7 k 道尔顿的脂类转移蛋白乜1，因此作用于这些蛋白的酵母蛋白酶不会是仅能水解小分子量的蛋白外切酶。而蛋白酶B 在p H=5 左右时甚至在低于5 0*(2 的温度下也极不稳定很快失去活性；并且羧肽酶及蛋白酶B 的最适p H 均偏碱性(p H 8)，在酸性条件下尤其是啤酒环境中(p H 4 5)这两种酶基本没有活性，因此对纯生啤酒泡沫产生影响的只可能是酵母蛋白酶A。随着研究手段提升和研究工作进一步深入，蛋白酶A 对纯生啤酒泡沫稳定性的负面影响已被进一步证实睁1 3 1。大量的研究证实啤酒泡沫稳定性的变化是从酵母细胞的细胞膜渗漏处的胞内蛋白水解酶所引起的，不同啤酒中蛋白酶A 含量见图卜2；尤其是在有压力条件下，这种蛋白酶从活酵母细胞中渗漏的观点，已被大多数人认同。与此同时在纯生啤酒储藏前期，泡沫的衰减主要是由于蛋白酶A 所导致的，在储藏后期，啤酒泡沫稳定性的衰减主要由蛋白酶A 的前驱物所导致n 4 1。低产蛋6 酶A 酵母菌株的选育及中试酿造的研究。昌oR鹕避裔蕾。彳菌0 幽。i i i 1。冒圉圄0 二9 雷：羹冒。6 豳3 图Y 幽。i i 冒1A B CDE F 6I tIJK L MN 0 Pq不同品牌啤酒图1-2 各种不同市场销售的啤酒中蛋白酶 活力F i g 1-2B e e rp r o t e i n a s eAv i t a l i t yf r o md i f f e r e n tm a r k e t图中字母代码为A J 为日本的品牌K 与L 为德国品牌M 为丹麦品牌N-一p 为美国品牌Q 为中国品牌F 为热杀菌啤酒J 与L 为含酵母的啤酒D、E、P 为冰啤酒。1 4 酵母蛋白酶A 的研究概况早在二十世纪之前人们就已在酵母中发现了蛋白酶，在二十世纪二十年代开始对酶特性进行了研究。在二十世纪七十年代，发现了八种酵母蛋白酶：蛋白酶A 和B，羧肽酶Y 和S，三种氨基肽酶和一个单一的二肽酶。在八十年代中期，由于生色底物测定技术的发展，已知的酵母蛋白酶数量已增加到约4 0 种n 钉。蛋白酶A 是酵母中第一个受到研究的酶，它是一种酸性蛋白酶，其特性与哺乳动物猪胃蛋白酶、组织蛋白酶D 和E 以及人的血管紧张肽原酶相似n 引，由于这些酶氨基酸数目大约为3 2 7，并且序列同缘性都大于4 0，活性中心保守序列A s p 3 3 _-T h r q l yS e r 及A s p 2 1 8-_ T h r G 1 y S e r 中天冬氨酸侧链参与了催化作用，因此这几种酶都叫做天冬氨酸蛋白酶7 1。蛋白酶A 能催化细胞内蛋白质水解，特别是在氮缺乏、孢子形成时，蛋白酶A 通过水解蛋白质为孢子，新蛋白合成提供氨基酸来源n 刀。在液泡中，酵母蛋白酶A 参与多种酶的转录后加工。通过对蛋白酶A 编码基因P E P 4 突变体(如插入突变、无义突变、错义突变)的研究n 螂1 发现，酵母蛋白酶A 不仅参与自身的加工成熟过程，还参与液泡中其它液泡酶的成熟激活过程，如蛋白酶B 前体及其酶原被蛋白酶A 切割后进一步对羧肽酶Y 前体进行加工，蛋白酶A 也可以直接切割羧肽酶Y 前体并使其成熟。另外，氨肽酶I、核糖核酸酶、碱性磷酸酶、海藻糖酶的成熟激活都与蛋白酶A 有关n 羽。基4；乌历幻惦m50新疆农业大学硕卜学位论文!Il l 量曼篡曼曼曼曼鼍量曼曼量曼曼曼曼蔓皇笪曼曼舅曼量量曼曼曼鼍曼曼曼曼曼曼笪曼曼曼曼曼曼笪曼!曼曼曼曼曼曼曼曼曼!曼曼曼曼曼蔓皇!曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量于蛋白酶A 对其它酶原前体的激活作用，因此对于正常的酵母细胞生长代谢而言，蛋白酶A 是必不可少的。一些啤酒研究人员认为液泡中蛋白酶A 并非由活酵母细胞中分泌出来的，而是由于酵母细胞自溶所释放出来。然而根据M a d d o x 与H o u g h 证明：通过活酵母细胞释放出细胞内水解酶蛋白酶A，活细胞释放蛋白酶A 部分原因是由于发酵过程的压力所导致晗1 1。在正常代谢途径下，蛋白酶A 酶原应该按照指定的途径从高尔基体输送到液泡中，而酵母在逆境条件下，如发酵条件下，通过一些错误的途径，蛋白酶A 酶原从酵母活细胞内输送到胞外乜幻。图1-3 显示了活酵母向胞外释放蛋白酶A 的机理。赢尔基体【lC，雨r：=j细胞膜蛋白酶A 酶原C，f r _ 一蛋白酶A 活化形式陌#竺蛋白酶A 的酶原图1-3 酵母细胞分泌蛋白酶A 到胞外和降解泡沫活性蛋白的模式图F i g 1 3t h es c h e m eo fy e a s tc e l le x c r e t e sp r o t e a s eAw h i c hd e g r a d et h ef o a ma c t i v ep r o t e i ni ne x t r a c e l l u l a r所有酵母液泡内酶原的活化取决于蛋白酶A，而蛋白酶A 本身也是以酶原的形式合成。这个4 0 5 个氨基酸的前驱物经输送到内质网时，进行糖基化，其中2 2 个疏水性氨基酸被水解脱落；而转运经过高尔基体复合体时，酶原的碳链端受到修正，同时前驱物产生一个大约5 0 k D a 的酶原前体形式(p r o P r A)；当酶原前体形式由内涵体进入液泡时，切除掉5 4 个氨基酸而产生一个分子量为4 2 k D 的成熟蛋白酶。以前的研究表明：蛋白酶A 能够自动活化，然而这个蛋白酶A 的酶原的活化大体上与其它已知的蛋白酶酶原活化没有相似性。为了研究为什么蛋白酶A 的活化在液泡中出现如此之快，而不是在前期阶段，研究人员将该酶原纯化后研究导致自动活化与活化的相应机理的条件；结果表明自动活化是由于酸性p H 所诱发，其活化速率随着离子强度的增加而增加。动力学的数据证明：自动活化主要通过一个双分子的产物催化机理而进行的，即一个蛋白酶A 分子催化一个酶原分子；上述的自动活化由酸性p H 所诱发与离子强度的依赖性以及产物催化机理在体内同样适应。因为在缺乏蛋白酶A 的条件下，缓慢的活化有助于阻止酶原到液泡前的活化。然而，酶原到液泡后，酸性p H、高离子强度和已经存在5低产蛋n 酶A 酵母菌抹的选育及中试酿造的研究!mo!m,m 量曼曼鼍曼曼曼曼量曼曼曼皇舅量曼的活性蛋白酶A 大大加速了酶原的活化。催化的自动活化可能是通用的机理1。1 5 降低蛋白酶A 活力提高纯生啤酒泡沫稳定性研究进展酵母分泌的蛋白酶以及对泡沫的负面影响已经引起国内外许多研究者的研究兴趣，尤其在国内纯生啤酒超高速发展的情况下，残留在啤酒中的蛋白酶A 的活性问题更引起人们重视。既然蛋白酶A 活性对啤酒泡沫稳定性影响巨大，通常可以考虑通过以下三种途径来降低蛋白酶A 的影响n 引，提高纯生啤酒泡沫稳定性：第一种途径是限制酶的产生和分泌。长时间以来，酵母研究者否认活性酵母会分泌蛋白水解酶，认为该酶的存在仅是酵母自溶的一个反映。进一步的研究证实，释放至啤酒中的蛋白酶的量与酵母的活力有关，而不仅仅是自溶的酵母才释放蛋白酶A。低活力的酵母可产生高浓度的蛋白酶A，意味着啤酒的泡沫质量差，这就要求在实际生产中人们应在啤酒成熟后立即将酵母从酒液中分离出来。K o n d o 等瞵1 建议降糖结束后立即用离心的方法分离酵母，并将上清酒液降至冷储温度(T：A 颠换而导致突变。烷化剂的作用还可引起D N A 分子中磷酸和糖之间的共价键断裂，而造成突变。H 7 1亚硝基胍是一种非常有效的诱变剂，素有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，具有较好的诱变效果。张搏润陌朝等采用硫酸-K,酯和亚硝基胍对酵母菌进行诱变，2 4耨秘农业大学硕十学位论文共得到3 2 株营养缺陷型菌株，致死率为9 9 5，诱变率为1 7，诱变效果良好。石贵阳脚1 以啤酒酵母为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍处理后，得到两株可应用于大容积发酵罐絮凝性较好的突变株株。C a y oR a m o s 等侣L 删通过亚硝基胍诱变啤酒酵母，获得一株抗苏氨酸酵母菌株，并可以应用于工业生产。这些都说明亚硝基胍的确实有较强的诱变作用，在啤酒酵母诱变选育研究中作为诱变剂大量使用。2 5 4E M S 诱变E M S 也属于烷化剂，所以其诱变作用机理与亚硝基胍类似。E M S 有强烈倾向去乙酰化鸟嘌呤并且对第七位上的腺嘌呤也有作用。在下一步的复制中由于乙基化的碱基不仅容易被其他碱基对取代，而且能自发的脱离D N A 丝，因而造成了嘌呤缺口。在下一步复制中将会插入一个错误的碱基，因而造成一个遗传性的碱基对的取代。洲H a r u oM o m o s e 等砸利用E M S 诱变酿酒酵母S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 产生变异多产蛋氨酸的菌株。S u s a nAH e n r y 等隋2 1 对酿酒酵母菌S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 采用E M S 诱变，脂肪酸饥饿培养的方法，可以出选育抗药、温度敏感、营养缺陷型酵母菌株。通过E M S 诱变，从啤酒酿造生产菌株中筛选分离得到一株发酵液中双乙酰含量优于亲株的新菌株，其双乙酰含量比亲株降低了4 2 7，该菌株的其它发酵性能的测定结果表明其保持了亲株的优良性状，且遗传性状稳定嘟1。2 6 本章小结(1)H e-N e 激光诱变，无论是滤纸片法还是试管法，对于筛选低产蛋白酶A 的啤酒酵母菌株没有效果，所以H e-N e 激光诱变不适用于选育低产蛋白酶A 的突变株。(2)亚硝酸诱变酵母菌株的最佳条件是：0 1 m o l L 亚硝酸钠，使用p H 4 5、l m o l L醋酸缓冲液稀释，亚硝酸钠最终浓度0 0 2 5 m o l L，诱变处理l O m i n。得到2 株突变株N L 3 0 和N L 3 8 蛋白酶A 活力较出发菌株低，荧光强度的下降率分别为9 3 0 和7 1 0。(3)亚硝基胍诱变酵母菌株的最佳条件是：用0 2 m o l L 磷酸缓冲液(p H 6 0)溶解，亚硝基胍最终浓度为l m g m L，处理2 0 r a i n。得到4 株突变株G H 4 5、G H 4 6、G H 6 5、G H 6 9 的蛋白酶A 活力较出发菌株低，荧光强度的下降率分别为1 5 8 8、1 0 0 0、8 5 6 低产蛋白酶A 酹母荫株冉勺逸胃及中试限透的研究和2 8 1。(4)E M S 诱变酵母菌株的最佳条件是：诱变最终浓度最终浓度3 0“L m L，诱变处理3 0 m i n。得到突变株E H 7 8 和E H 8 8 蛋白酶A 活力较出发菌株低，荧光强度下降率分别为1 3 9 7 和2 0 6 5。(5)连续采用亚硝基胍和E M S 诱变对于筛选低产蛋白酶A 的啤酒酵母菌株有很好的效果，有1 0 株突变株G M 0 5、G M I O、G M l 5、G M 9 6、G M l 6 1、G M l 6 9、G M 2 0 1、G M 2 3 5、G M 2 3 7、G M 2 3 9 蛋白酶A 活力较低，荧光强度的下降率分别为：2 0 3 9、1 8 6 6、1 8 1 6、1 8 8 7、1 2 1 8、1 4 1 4、6 5 4、6 2 7、7 9 4 和1 9 8 3。(6)比较这几种诱变方法的诱变效果发现，连续使用亚硝基胍和E M S 的诱变效果最好，筛选出l O 株突变株，其中7 株菌株的荧光强度下降率大于1 0，有5 株菌株的荧光强度下降率大于1 5；单独使用亚硝基胍和E M S 诱变的效果次之，亚硝基胍诱变得到4 株突变株，荧光强度下降大于1 0 的有2 株，E M S 诱变得到2 株突变株，荧光强度的下降率均大于1 0；亚硝酸诱变的效果再次之，得到的2 株突变株，荧光强度下降率低于1 0；激光诱变对筛选低蛋白酶A 菌株无效果。新疆农娩大学硕+学位论文第三章低产蛋白酶A 突变株初筛方法的确定3 一前言本实验采用两种初筛方法进行筛选一羧肽酶Y 平板鉴定实验和酸变性血红蛋白平板实验，通过两种方法的筛选效果进行比较分析，得出操作简单有效，筛选分辨率高的实验方法作为该研究合适初筛方法。3 2 材料、试剂及仪器3 2 1 培养基液体培养基、完全培养基(Y P D)，同前。甘油培养基：2 甘油，2 蛋白胨，1 酵母浸粉，2 琼脂。3 2 2 实验试剂本章实验主要试剂见表3 一l。表3-1 主要试剂T a b 3 1M a i ne x p e r i m e n t a lr e a g e n t s3 2 2 实验仪器本章实验主要仪器见表3-2。低产蛋r|酶A 酵母甍拣的选育及中试酿造的研究表3-2 主要仪器T a b 3-2M a i ne x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t仪器名称产地A E L-1 6 0 电子分析天平2 2 0 V 2 0 0 0 W 万用电炉L D Z X 5 0 K B S 立式电热压力蒸汽灭菌器洁净工作台p H S _ 3 C 精密p H 计S H Z 8 2 恒温振荡器L R H-1 5 0 B 生化培养箱B C D 2 7 0 G T N S 三星冰箱微量取样器(1 m l，2 0 0 1 J L，2 0 9 L)S H I M A D Z UJ a p a n上海甲光仪器仪表有限公司上海申安医疗器械厂北京半导体设备一厂上海雷磁金坊市富华仪器有限公司广东省医疗器械厂三星电子中国代理服务部G I I，S o NF r a n c e3 2 3 主要试剂的配制(1)涂盖液(用于一个平板的量)：用玻璃或聚丙烯试管，取2 5 m L 的l m g m LN 一乙酰一D L 一苯丙氨酸一B 一萘酯(溶在二甲基甲酰胺中)与4 m L 的0 6 熔化琼脂混合，5 0 保温。(2)5 m g m LF a s tG a r n e tG B C(石榴红硫酸盐)：将G B C 溶在0 1 m o l LT r i s H C I(p H 7 4)中，现用现配。3 3 实验方法3 3 1 羧肽酶Y 平板鉴定实验(1)在Y P D 平板上培养菌落，2 8 培养2 -3 天，菌落可见；(2)小心把涂盖液加在平板表面使之完全覆盖细胞；(3)待琼脂凝固5-1 0 m i n 后，小心用新鲜F a s tG a r n e tG B C 溶液冲刷表面；(4)显色5 m i n 后，野生型菌株将变红，而羧肽酶Y 缺陷菌株将呈黄色或粉红色；(5)倒出F a s tG a r n e tG B C 溶液以便更好的观察颜色变化。嘲3 3 2 酸变性血红蛋白平板实验(1)将诱变菌液涂布于Y P D，每板约1 0 0 个菌落，2 8。C 培养2 3 天，菌落可新疆农业大学硕士学位论文见；(2)转移至甘油平板培养3-,4 天，激活蛋白酶A 酶活；(3)将l O m L 覆盖液(2 琼脂，0 3 酸变性血色蛋白p H=3，0 0 5 M 磷酸二氢钾p H=4 5，0 2 2 T r i t o nX 一1 0 0)均匀倒于平板，3 0 放置2 3 天；(4)每平板加入l 2 m L1 0 三氯醋酸平铺，没有水解圈的菌落缺乏水解血红蛋白能力，根据水解圈的大小评估其水解酸变性血色蛋白的能力。6 33 4 结果与分析对两种筛选实验的效果进行比较，羧肽酶Y 平板染色效果如图3-1，酸变性血红蛋白平板光圈的形状如图3 2。由图可以看出，羧肽酶Y 平板上红色与粉色菌落肉眼非常难以辨别，且其染色深浅还受所倒平板厚度干扰，染色结果不便于观察；而通过酸变性血红蛋白平板实验，根据水解圈的大小来判断菌株蛋白酶A 活力强弱，效果比较明显。图3-1 羧肽酶Y 平板染色结果F i g 3 1T h er e s u l to fc a r b o x y p e p t i d a s eYp l a t e图3-2 酸变性血红蛋白平板结果F i g 3-2T h er e s u l to fa c i d-d e n a t u r e dh e m o g l o b i np l a t e3 5 讨论酵母蛋白酶A(P r A)能自身加工成熟，所有液泡水解蛋白酶活性的激活都依赖于蛋白酶A 活性，如羧肽酶(C P Y)和蛋白酶B(P r B)都是典型的蛋白酶A 依赖型水解酶。羧肽酶为酵母P R C I 基因编码，在细胞中首先合成5 3 2 个氨基酸的前蛋白酶原，进入内质网切去2 0 个氨基酸的信号肽并在四个位点进行糖基化，生成p l C P Y，p l C P Y在高尔基体中进一步修饰生成p 2-C P Y 约6 9 k D a(p r o C P Y)，h i n d u 液泡，被蛋白酶A 切去N 端9 1 个氨基酸残基，形成活性酶体，最后被蛋白酶B 进一步力n-r，生成完全成熟构型的羧肽酶分子M。蛋白酶B 与蛋白酶A 是目前发现的两种液泡水解蛋白酶内切酶，涉及酵母体内糖质新生途径，激活生长途径的关键酶如壳质合成酶嘲1。蛋白酶B 也参与液泡酶的活化，但并不认为是必须的，主要是对蛋白酶A、羧肽酶成熟的最后一步进行修饰，生成完全成熟构型的酶分子，在蛋白酶B 缺陷菌株中蛋白酶A、羧肽酶酶体比完全成熟构型的酶分子多几个额外的氨基酸，但是催化活性并不受影响。鼍璺I 一=兰b 吒匕竺兰=竺bP 竺CoYIo。-。-_ _-_-。_。1。o _。一k _ _ _-_ _ _ _ _ _-J _ _ _ _-_-_-_ _ _ _ L J Ul旨置譬三雪主3 0厂p r oh mP r 8p r oC“11人一。b1 _戈1一人人人。岫予I L人I、口、人口一、口、口图3 3P r A、C P Y 与P r B 关系F i g 3-3T h er e l a t i o n s h i po fP r A，C P Ya n dP r B新疆农业大学硕t 学 奇论文蛋白酶A 缺陷菌株有三类表型：(1)P r A P r B+C p y+、(2)P r A P r B C p y+、(3)P r A P r B C p y 一 2 4 o 前两类羧肽酶表现为有催化活力，但是羧肽酶的活化依赖于蛋白酶A，说明此两种表型突变株在体内有一定的蛋白酶A 活力保证羧肽酶前体被加工成熟，但是在突变株中蛋白酶A 因为未知的因素导致其在体外没有活性或者很快被降解掉，所以无法检测到表现为P r A；第三种表型可以认为蛋白酶A 缺陷菌株完全失去蛋白酶A活力。基于上述观点，可以认为通过检测酵母羧肽酶活力可以间接筛选到蛋白酶A 缺陷菌株。通过观察菌落颜色，可以判断颜色浅或者粉色菌落为(1)或者(2)型，因为此两种突变菌株虽然在体内有一定的蛋白酶A 活力保证羧肽酶前体被加工成熟，但是与野生型(红色)比较，应表现为弱势；无色(黄色)菌落可以判断为(3)型，即体内蛋白酶A 完全失活。研究表明，蛋白酶A 功能缺失细胞，大量的液泡酶功能缺失，细胞在贫营养或者孢子形成时蛋白质降解水平显著下降，氨基酸供应不足，P r A-，P r B 一还会导致细胞死亡率上升，所以选育蛋白酶A 缺陷菌株时，应著眼于筛选(1)或者(2)型缺陷菌株，在保证其他酶活力，细胞正常功能的同时，尽可能确保胞外蛋白酶A 低水平、低活力。但从羧肽酶Y 平板实验的实际操作效果来看，未出现过无色(黄色)菌落，用肉眼观察染色平板上的红色与浅红或粉色菌落很难区分，且其染色深浅还受所倒平板厚度干扰，结果不好观察；筛选的1 0 5 株突变株中，有4 2 株不能完成三角瓶发酵实验，由此推测，从染色平板上挑选出的颜色较浅的菌落也有可能是经过诱变后影响了发酵性能的菌株而表现出的。蛋白酶A 是酵母中目前所知道的唯一在酸性p H 范围水解酸变性血色素(a c i d d e n a t u r e dh e m o g l o b i n)的酶嘲1，所以采用酸变性血红蛋白平板进行筛选，可以判定蛋白酶A 的存在与否及活力高低。3 6 本章小结酸变性血红蛋白平板实验是诱变选育低产蛋白酶A 菌株的最佳初筛方法。新疆农业夫学硕。j 二学位论文4 1 前言第四章突变菌株的发酵性能实验及中试试验实验通过对选育出低产蛋白酶A 活力的突变株进行发酵性能、低蛋白酶A 活力遗传稳定性等研究从而确定最佳的目的菌株，并对筛选出的最佳目的菌株进行中试酿造实验，评价其实用价值。4 2 材料、试剂及仪器4 2 1 实验材料与试剂本章主要实验材料与试剂见表4 1。表4-1 主要材料与试剂T a b 4 1M a i ne x p e r i m e n t a lm a t e r i a l sa n de x p e r i m e n t a lr e a g e n t s名称纯度等级产地澳麦麦芽苦花(青岛苦花)S a a z 香花邻苯二胺盐酸正丙醇磷酸氢二钾柠檬酸B r ij 3 5荧光底物M O C A c-A l a P r o-A l a-L y s P h e P h e叫b g l e u(D