应用免疫组织化学方法评价组织芯片的可靠性.pdf
第26卷第4期2 0 0 5年8月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)Journal of Xian Jiaotong University(Medical Sciences)Vol.26No.4Aug.2005应用免疫组织化学方法评价组织芯片的可靠性杨 军1,苏宝山1,王康敏1,赵世平1,强 磊1,王一理2,司履生2(西安交通大学:1.第二医院病理科,陕西西安 710004;2.生命科学与技术学院癌症研究所,陕西西安 710061)摘要:目的 探讨组织芯片技术在免疫组化试验中的可靠性和提高组织芯片可信性的方法。方法 选择82例人乳腺癌标本石蜡蜡块,利用传统制片技术和自行研制的专用器具分别制作常规石蜡切片和组织芯片,采用免疫组化技术检测雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的表达。结果 采用自行研制的专用器具制备组织芯片,所得样本的可分析率均在92.9%以上,且随着对同一标本取材数量的增加,其可分析标本率也明显上升。采用传统方法检测的82例乳腺癌标本中ER和PR的阳性率分别为61%和58.5%;采用组织芯片技术,一式一份取材,其阳性率分别为51.9%和50.0%,一式两份方式取材,其阳性率分别为53.8%和53.8%,采用一式三份方式取材,其阳性率分别为57.1%和60.7%,且三种不同取材方式的检测结果与传统制片法之间并无统计学差异(P 0.75)。结论 在采用统一制备标准并保证组织芯片质量的前提下,挖取直径1.5mm的组织样本制备组织芯片,尽管组织芯片技术与传统方法检测的结果的一致率仍随着对同一标本取材次数的增加而提高,但是三种不同取材方式的检测结果之间并无统计学差异。因此,一式一份取材制备组织芯片完全可替代传统制片技术用于免疫组织化学乃至原位杂交、荧光原位杂交技术的研究,且可保证组织芯片的可信性和高通量特征。关键词:组织芯片;乳腺癌;雌激素受体;孕激素受体;免疫组化中图分类号:R73 文献标识码:A 文章编号:167128259(2005)0420399204Evaluation of the reliability of tissue chip with immunohistochemistryby detecting ERand PR expression in human breast cancerYang Jun,Su Baoshan,Wang Kangmin,Zhao Shiping,Qiang Lei,Wang Yili,Si Lsheng(1.Department of Pathology,Second Hospital of Xian Jiaotong University,Xian 710004;2.Institute ofTumor Research,College of Life Science and Technology,Xian Jiaotong University,Xian 710061,China)ABSTRACT:ObjectiveTo explore the reliability of tissue chip(tissue microarray)and the methods to improvethe reliability.MethodsA total of82formalin2fixed,paraffin2embedded tissue blocks of breast cancer specimenswere retrieved,along with their corresponding hematoxylin and eosin(H&E)2stained slide,from the archives of theDepartment of Pathology,Second Hospital of Xian Jiaotong University.Patent tissue micoarrayer was used toprepare tissue chip.Immunohistochemistry was performed to analyze the expression of estrogen receptor(ER)andprogesterone receptor(PR)on the tissue chip.ResultsMore than92.9%tissue samples on the tissue chip wereanalyzed.The more core samples were punched from each original block,the more specimens could be analyzed.The positive rate of the expression of ER and PR on conventional tissue section were61%and58.5%respectively.When one core sample was punched from each original block,the positive rate of the expression of ER and PR onthe tissue chip were51.9%and50.0%respectively.When two core samples were punched from each original block,the positive rate were53.8%and53.8%respectively.When three core samples were punched from each originalblock,the positive rate were57.1%and60.7%respectively.However,there was no statistic difference betweenthe values using the above three methods(P 0.75).ConclusionWith the same preparation standard and qualityof tissue chips,when1.5mm core tissue samples were punched from the original blocks to prepare tissue chips,therewere no statistic difference among the positive rate by using the three methods in punching core samples,althoughthe positive coincidence rate between the expression of ER and PR on conventional tissue section and tissue chip wason the rise with the increase of the number of core tissues punched from one original block.It could be concluded收稿日期:2004210228 修回日期:2005203210基金项目:陕西省科技攻关项目(No.2001K102G2)、西安市科技研究发展计划资助项目(No.YG200120)作者简介:杨军(19722),男(汉族),主治医师.研究方向:肿瘤生物学.西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第26卷that tissue chip technique could substitute for conventional tissue section technique in immunohistochemistry,in situhybridization(ISH)and fluorescence in situ hybridization(FISH),and one core tissue punched from each originalblock could ensure the reliability and high2throughput characters of tissue microarray technique.KEY WORDS:tissue chip(tissue microarray);breast carcinoma;ER;PR;immunohistochemistry 自1998年K ononen1报道组织微阵列(tissue mi2croarray)技术,也称为组织芯片(tissue chip)技术以来,作为一项重要的组织学研究手段,组织芯片技术已经被广泛应用于包括肿瘤生物学在内的各个领域,并将会与其他技术一起在后基因组时代的功能基因组学研究领域发挥巨大作用。但是,对于组织芯片技术的可靠性的顾虑严重制约了组织芯片技术的发展,依旧使众多学者感到疑惑。本研究我们将通过同时采用传统制片技术和组织芯片技术对82例乳腺癌标本中雌激素受体(es2trogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone recep2tor,PR)的检测,评价组织芯片技术的可靠性,并为提高组织芯片可信性,探索可行的技术方法。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本来源 本研究所采用的82例乳腺癌标本和2例正常乳腺组织均来自西安交通大学第二医院病理科活检标本,均经10%(体积分数)甲醛固定,石蜡包埋,HE切片并确诊。1.1.2 主要设备 本研究室自行研制并由辽宁朝阳恒泰科技发展有限责任公司生产的HT21组织芯片制备系统(已获得国家专利,ZL 00262393.5、ZL00207528.8、ZL02139474.1)和传统病理制片的所有设备(如病理取材器械、组织处理仪、包埋框、石蜡切片机、染色机等等)。1.1.3 试剂 本实验所用ER抗体、PR抗体(鼠抗人单克隆抗体)和S2P试剂盒均购自北京中山生物技术公司。1.2 方法1.2.1 组织芯片的制备 将入选的82例标本随机分为3组:第1组28例标本,一式一份取材,每例标本挖取1例样本,共28份样本;第2组26例标本,一式两份取材,每例标本挖取2例样本,共52份样本;第3组28例标本,一式三份取材,每例标本挖取3例样本,共84份样本。因此,从82例标本中共挖取164份样本;此外,从2例正常乳腺组织标本石蜡蜡块中挖取4份样本作为正常对照(质控点)。同时,用传统制片方法制备上述82例乳腺癌标本和2例正常乳腺组织的常规石蜡切片,并将其列为第4组(对照组)。按照本研究室研制的HT21组织芯片制备仪和制备方法制备67规格(行 列)的组织芯片(1点为质控点,为正常乳腺组织,实际容量为41份组织样本/张)。其制备方法如下:利用毛胚制备器制备带有阵列孔的石蜡蜡块毛胚;在光学显微镜下对82例乳腺癌标本石蜡蜡块的HE切片进行观察,选择合适区域,并保证肿瘤实质成份至少占取得组织样本面积的50%以上;利用专用组织挖取针挖取蜡块内组织,挖取出的组织呈圆柱形,直径1.5 mm,长23 mm;将其每41例样本为一组依次包埋于制备好的同一蜡块毛胚中,并编号;利用专用包埋器进行包埋。对制备好的多组织蜡块进行石蜡切片,厚5m,裱于涂有1 g/L多聚赖氨酸的载玻片上,烤干,制备组织芯片一式两份,共8张。1.2.2 免疫组化染色 同时应用SP法对上述传统石蜡切片和组织芯片进行免疫组化染色:切片经脱蜡、水化,加3%(体积分数)H2O2处理10 min,微波抗原修复(0.01 mol/L、p H 6.0柠檬酸盐缓冲液),5%(体积分数)正常山羊血清室温封闭10 min,加一抗,371 h,加生物素标记的第二抗体,3710 h,加辣根过氧化物酶复合物3710 h,DAB显色,苏木素复染,酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片.以TBS替代一抗作为阴性对照,正常乳腺组织作为阳性对照。1.2.3 结果判断 显微镜下观察,细胞核内出现深浅不一的棕黄色颗粒为阳性,阳性细胞 10%记为ER、PR阳性。对于组织芯片上的组织样本,如果为坏死出血组织或无肿瘤实质,或脱片者,则计为不可分析样本。第1组一式一份取材制备的组织芯片按照上述方法观察;第2组一式两份取材和第3组一式三份取材制备的组织芯片中只要一份样本出现阳性即判该标本为阳性。1.2.4 统计学处理 计数各组的阳性标本数和其与对照组标本检测结果一致的标本数,分别计算其阳性率和一致率,并采用精确概率法和2检验进行统计学处理,P0.75)。表2 组织芯片法与传统制片法比较ER在乳腺癌标本中的表达Table 2Comparison of positive rate of ER in mammary cancer with traditional method and tissue chipGroupingSample numberPositive numberNegative numberTotal numberPositive rate(%)Coincidence rate(%)114132751.988.9(24/27)214122653.892.3(24/26)316122857.196.4(27/28)450328261.0100.0(82/82)Total946916357.796.3(157/163)2=0.900 35,0.900 P 0.750表3 组织芯片法与传统制片法比较PR在乳腺癌标本中的表达Table 3Comparison of positive rate of PR in mammary cancer with traditional method and tissue chipGroupingSample numberPositive numberNegative numberTotal numberPositive rate(%)Coincidence rate(%)113132650.092.3(24/26)214122653.896.2(25/26)317112860.7100.0(28/28)448348258.5100.0(82/82)Total927016257.098.1(159/162)2=0.857 97,0.900 P 0.750104西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第26卷3 讨 论由于组织芯片中的微组织样本均来源于原始供体蜡块,是活检组织的活检,挖取组织能否代表供体标本信息,成为这一技术是否可靠的理论基础,也是实验者所关心焦点问题。组织样本的大小决定了其所包含组织细胞的数量。K ononen等1制作的组织芯片,其组织样本的直径为0.6 mm,在理论上,0.6 mm直径的组织样本可包含6001300个以上细胞,足可反映原组织结构的信息。Hoos等2发现,无论应用组织芯片技术还是传统制片方法,Ki267,p53和pRB蛋白在59例纤维细胞瘤中的表达均无差异。Mucci等3对50例前列腺肿瘤中CGA和SYN这样的呈异质性表达的神经内分泌指标的观察,及Garcia等4对淋巴瘤的研究等一系列对比性研究均证实组织芯片技术具有与传统方法同样的敏感性和准确性,可以替代传统制片技术用于肿瘤生物学的研究。然而,也有学者发现采用这一技术仍会出现一定的偏倚5。因而,有学者建议,将组织样本的直径增加到2.0 mm6,并采取一式二份7,甚至至少一式三份的方式挖取组织方可保证组织芯片的有效性、可行性8。因此,在本研究中,我们同时采用组织芯片技术和传统组织切片方法,并尝试采用一式一份、一式两份和一式三份三种取材方式制备组织芯片,通过对82例乳腺癌标本中ER、PR表达的检测,探讨不同取材方式对组织芯片可靠性的影响,以验证组织芯片技术在免疫组化技术中的可靠性。研究结果显示,采用三种不同取材方式制备的组织芯片与传统制片法制备的常规石蜡切片检测82例乳腺癌标本中ER、PR表达的阳性率之间均无统计学差异(P 0.75,表2、3)。因此,采用一式一份的取材方式即可保证组织芯片技术的可靠性。但是,本实验结果也证实,尽管不同取材方式在检测ER、PR表达的阳性率之间并无统计学差异,但随着对同一标本取材次数的增加,组织芯片技术与传统方法在检测乳腺癌中ER、PR表达的一致率却分别从采用一式一份取材时的88.9%、92.3%提高到一式两份方式取材时的92.3%、96.2%和一式三份方式取材时的96.4%和100%。这一结果所得组织芯片技术与传统高技术的一致率可能较一些学者报道的要高2,3。其原因可能与以下几个因素有关,首先在本研究中我们使用的自行研制HT21组织芯片制备系统采用了已获国家专利的一次制胚成型和负压包埋技术,因而制备的组织芯片质量较高,其可分析标本率在92.6%以上。同时,在挖取组织时,利用光学显微镜对供体石蜡蜡块的HE切片观察,并采用同一标准,选择合适组织结构的区域,并确保肿瘤实质成份至少占取得组织样本面积的50%以上,有效减少了因挖取的组织样本内出现坏死组织或无癌组织等因素导致的可分析样本丢失,其次,本研究在采用同一制备标准并保证组织芯片质量的前提下,挖取直径1.5 mm的组织样本制备组织芯片,因而组织芯片上每一组织样本理论上均包含4 00020 000个细胞,较 此 前Kononen等1-3多 数 学 者 选 用 直 径0.6 mm挖取针挖取的组织样本,具有更为丰富的组织学信息。此外,在对一式多份取材制备的组织芯片的结果判读时,考虑到组织芯片技术是活检组织的活检,理论上存在漏检的可能,因而只要一份样本出现阳性,即便其余样本为阴性,也判该标本为阳性。所以,本研究所获得的组织芯片技术与传统组织切片技术的一致率也较高。可见,在提高组织芯片质量、降低脱片率的前提下,采用同一标准,挖取直径1.5 mm的组织样本,一式一份取材即可保证组织芯片技术在免疫组化技术中的可靠性。但是,由于组织芯片技术是活检组织的活检,是为进行高通量分析不同组织标本中同一指标的表达而设计的。所以,在保证组织芯片技术的可靠性和有效性以及组织芯片技术的实用性的同时应兼顾组织芯片技术本身的高通量特征,即保证组织芯片技术的高效率同样是十分重要9。因而,在提高组织芯片质量、尽量降低脱片率、保证足够高的可分析样本率的前提下,采用同一标准,挖取直径1.5 mm的组织样本,一式一份,完全可以保证组织芯片技术在免疫组化染色中的可靠性和高通量特征。但是在具体实践中仍建议应同时兼顾组织芯片的高通量特性和组织芯片的可信性以及组织芯片技术的实用性,依据实际情况采用适宜的取材数量以保证实验结果的可信性。参考文献:1 Kononen J,Bubendorf L,Kallioniemi A,et al.Tissue microar2rays for high throughput molecular profiling of tumor specimenJ.Nat med,1998,4:844-847.2 Hoos A,Urist MJ,Stojadinovic A,et al.Validation of tissuemicroarrays for immunohistochemical profiling of cancer speci2mens using the example of human fibroblastic tumors J.Am JPathol,2001,158(4):1245-1251.3Mucci NR,Akdas G,Manely S,et al.Neuroendocrine expres2sion in metastatic prostate cancer:evaluation of high throughputtissue microarrays to detectheterogeneous protein expressionJ.Hum Pathol,2000,31(4):406-414.(下转第408页)204西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第26卷(上接第357页)3Suzu S,Kimura F,Tanaka2Douzono M,et al.Antitumor immu2nity induced by irradiated tumor cells producing macrophage col2ony2stimulating factor J.Int JHematol,2001,73(3):378-382.4William SS,Alosoo TR,Mayhew E,et al.Arrest of human lungtumor xenograft growth in severe combind immunodeficiencymice using Doxorubiom encapsulated in sterically stabilized lim2posomes J.Cancer Res,1993,53(10):3964-3967.5鞠佃文,曹雪涛,王宝梅,等.大肠杆菌CD自杀基因与GM2CSF基因联合转移对小鼠白血病的治疗作用 J.中华血液学杂志,1998,19(6):294-298.6Renkvist N,Castelli C,Robbins PF,et al.A listing of humantumor antigens recognized by T cells J.Cancer Immunol Im2munother,2001,50:3-15.7刘英.肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞和肿瘤免疫治疗J.中国实验血液学杂志,2004,12(2):244-248.8Anichini A,Vegetti C,Mortarini R.The paradox of T cell2me2diated antitumor immunity in spite of poor clinical outcome in hu2man melanoma J.Cancer Immunol Immunother,2004,53(10):855-864.9 Hu HM,Poehlein CH,Urba WJ,et al.Development of antitu2mor immune responses in reconstituted lymphopenic hosts J.Cancer Res,2002,62(14):3914-3919.10Ge Q,Hu H,Eisen HN,et al.Naive to memory T2cell differ2entiation during homeostasis2driven proliferation J.MicrobesInfect,2002,4(5):555-558.(编辑 卓选鹏)(上接第367页)6Stafford2Johnson DB,Hamilton B H,Dong Q,et al.Vascularcomplications of liver transplantation:evaluation with gadolini2um2enhanced MR angiography J.Radiology,1998,207(1):153-160.7Egawa H.Application of interventional radiology for stenosis ofvascular anastomosis in living2donor liver transplantation J.Nippon Geka Gakkai Zasshi,2004,105(6):364-368.8Ferraz2Neto B H,Sakabe D,Buttros DA,et al.Portal vein an2eurysm as late complication of liver transplantation:a case re2port J.Transplant Proc,2004,36(4):970-971.9 Zanotelli ML,Vieira S,Alencastro R,et al.Management ofvascular complications after pediatric liver transplantation J.Transplant Proc,2004,36(4):945-946.10Fulcher AS,Turner MA.Orthotopic liver transplantation:eval2uation with MR cholangiography J.Radiology,1999,211(3):715-722.11Lee KW,Joh J W,Kim SJ,et al.High hilar dissection:newtechnique to reduce biliary complication in living donor livertransplantation J.Liver Transpl,2004,10(9):1158-1162.12Sherman S,Jamidar P,Shaked A,et al.Biliary tract complica2tionsafterorthotopic livertransplantation.Endoscopicap2proach to diagnosis and therapy J.Transplantation,1995,60(5):467-470.13Sawyer RG,Punch JD.Incidence and management of biliarycomplications after291liver transplants following the introduc2tion of transcystic stenting J.Transplantation.1998,66(9):1201-1207.14Chen GH,Lu MQ,Cai CJ,et al.Clinical study of adjuvant in2dividualized chemotherapy for hepatocellular carcinoma afterliver transplantation J.Zhonghua Waike Zazhi,2004,42(17):1040-1043.15 Yuan YF,Cui B K,Zhang YQ,et al.Preliminary Study on Or2thotopic Liver Transplantation for Treatment of Advanced Hep2atocellular Carcinoma Without Extra2hepatic Metastasis2A Re2port of10cases J.Ai Zheng,2004,23(9):981-984.(编辑 卓选鹏)(上接第402页)4Garcia J F,Camacho FI,Morente M,et al.Hodgkin and Reed2Sternberg cells harbor alterations in the major tumor suppressorpathways and cell2cycle checkpoints:analyses using tissue mi2croarrays J.Blood,2003,101(2):681-689.5Merseburger AS,Kuczyk MA,Serth J,et al.Limitations of tis2sue microarrays in the evaluation of focal alterations of bcl22andp53in whole mount derived prostate tissues J.Oncol Rep,2003,10(1):223-228.6 Kim WH.Tissue array technology for translational research.From gene discovery to application J.Exp Mol Med,2001,33(1Suppl):135-148.7 Hoos A,Urist MJ,Stojadinovic A.Validation of tissue microar2rays for immunohistochemical profiling of cancer specimens usingthe example of human fibroblastic tumors J.Am J Pathol.2001,158(4):1245-1251.8Gulmann C,Butler D,Kay E,et al.Biopsy of a biopsy:valida2tion of immunoprofiling in gastric cancer biopsy tissue microar2rays J.Histopathology,2003,42(1):70-76.9杨军,苏宝山,王康敏,等.组织芯片研究领域中的几个基本问题J.中华病理学杂志,2002,23(6):76-77.(编辑 卓选鹏)804
