分子杂交及基因芯片技术讲稿.ppt

分子杂交及基因芯片技术第一页，讲稿共三十八页哦4.1SouthernBlotting1977年，Southern发明了一种检测DNA分子的方法，将琼脂糖凝胶电泳上的DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜上，再进行同源杂交，寻找有同源性的DNA分子。杂交过程Southern印记转移分子杂交Edwin Southern 第二页，讲稿共三十八页哦Southern 印记转移印记转移目的目的DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳0.4 mol/L NaOH 变性成单链变性成单链 1.5 M NaCl、1M Tris（pH7.4）中）中和，保持单链和，保持单链通过毛细管渗吸、电转移、真空等方通过毛细管渗吸、电转移、真空等方法法 转移至硝酸纤维素膜或者尼龙膜转移至硝酸纤维素膜或者尼龙膜紫外线照射固定紫外线照射固定DNA第三页，讲稿共三十八页哦转移buffer：6SSC(orSSPE)时间:1kb15kb18hr一般情况hr滤纸凝胶滤膜吸水纸玻璃板重物支持物500g第四页，讲稿共三十八页哦预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点变性鱼精DNA；3-12小时让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针混合滤膜、探针、杂交液；6-12小时通过显影检查目的DNA所在的位置X光片上曝光;1-2天 杂交杂交第五页，讲稿共三十八页哦第六页，讲稿共三十八页哦探针是一段核酸片段，对它进行标记以后，可以通过分杂交来探测核酸样品中与之同源的片段。探针种类（单双链）探针标记物放射线：、非放射线：地高辛（）4.2分子探针第七页，讲稿共三十八页哦探针检测放射性：光片显色地高辛：酶联免疫法探针标记方法均匀标记切口平移标记随机引物标记扩增标记末端标记末端补平末端置换末端转移第八页，讲稿共三十八页哦切口平移标记切口平移标记DNA polymerase I第九页，讲稿共三十八页哦随机引物随机引物Klenow Fragment第十页，讲稿共三十八页哦扩增标记扩增标记Tag polymerase第十一页，讲稿共三十八页哦末端补平末端补平KlenowFragmentT4/T7polymeraseAGGTTCTGC-55-TCGAGTACAGGTTCTGC-35-TCGAGTAC3-AGCTCATGTCCAAGACG-3dNTP*3端标记端标记第十二页，讲稿共三十八页哦末端置换末端置换t4polynucleotidekinaseT4多聚核苷酸激酶T4polynucleotidekinase5端标记端标记第十三页，讲稿共三十八页哦末端转移末端转移末端转移酶末端转移酶TerminalTransferase3端标记端标记第十四页，讲稿共三十八页哦地高辛（）显地高辛（）显色原理色原理Roche 公司（德国）公司（德国）dUTP 11C DNA/RNA-DIGDIGAntiboy-ALP底物是5-溴-4-氯-3吲哚酚磷酸盐(BCIP)浓紫色沉淀浓紫色沉淀第十五页，讲稿共三十八页哦M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（DNA/Hind）；1-3，苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的总DNA分别经KpnPst、Pst和Kpn 酶切。以cry1Aa 杀虫晶体蛋白基因中的728bp片段作探针，通过随机引物标记的方式，用DIG标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。第十六页，讲稿共三十八页哦第十七页，讲稿共三十八页哦4.NorthernBlotting类似于Southernblotting用于检测RNA的分子杂交技术，用于分析总RNA或mRNA在操作的过程中包括的提取、电泳过程等等，要时刻注意避免的降解，具体的操作请参考分子克隆实验指南以及最新的文献。第十八页，讲稿共三十八页哦Northern blot 检测上皮因子在人体不同器官的表达情况检测上皮因子在人体不同器官的表达情况 第十九页，讲稿共三十八页哦4.WesternBlottingWestern杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。基本原理同其它blot方式，关键区别在于探针性质：抗体(antibody)1.单克隆抗体(monoclonalantibody)：并非都适合，由于靶蛋白已变性。2.多克隆抗体抗体为混合物，对其特异性，亲和力及浓度都一无所知对由SDS/还原剂变性处理的目标蛋白是否还能识别应做预备实验。第二十页，讲稿共三十八页哦简要步骤简要步骤SDS-PAGE蛋白质转移：电转移封闭背景：脱脂奶粉5%第一抗体与靶蛋白结合：免疫球蛋白二级免疫反应：羊抗兔免疫球蛋白抗体显色反应：辣根过氧化物酶（HRP,horseradishperoxidase）与3.3-二氨基联苯胺作用形成棕色沉淀，钴或镍可加深颜色。碱性磷酸酶（ALP,alkaliphosphatase）地高辛标记显色一致。与BCIP/NBT作用显紫色。放射自显影125I第二十一页，讲稿共三十八页哦蛋白质印记转移蛋白质印记转移+-第二十二页，讲稿共三十八页哦杂交示意图杂交示意图第二十三页，讲稿共三十八页哦海拉癌细胞株蛋白海拉癌细胞株蛋白CDK7CDK7的的Western BlotWestern Blot检测检测第二十四页，讲稿共三十八页哦4.5其他分子杂交原位杂交(colonyinsituhybridization)细菌从平板影印到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落原位裂解释放DNA，将DNA烘干固定于膜上与标记探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与平板上的菌落对位。斑点杂交(dothybridization)是将被检标本点到膜上，烘烤固定。第二十五页，讲稿共三十八页哦4.6基因芯片技术u定义：通过平面微加工技术在固体芯片定义：通过平面微加工技术在固体芯片表面构建微流体分析单元和系统，以实表面构建微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。组分的准确、快速、大信息量的检测。第二十六页，讲稿共三十八页哦4.6.1生物芯片技术的历史u1989年英国科学家Southern申请了有关在固体表面进行DNA杂交的专利。这是有关基因芯片的第一个专利。u1992年世界上第一块原位合成基因芯片在美国Affymetrix公司诞生。u1995年世界上第一块微矩阵基因芯片在美国斯坦福大学实验室诞生。u1997年世界上第一张全基因组芯片酵母芯片完成(斯坦福大学Brown实验室)。它含有6116个基因。第二十七页，讲稿共三十八页哦TheFullYeastGenomeonaChip第二十八页，讲稿共三十八页哦4.6.2生物芯片的特征与优点微型化高通量高通量提高信息量提高信息量平行化平行化提高信息的可比性提高信息的可比性微量化微量化降低待检样品用量降低待检样品用量自动化自动化提高工作效率提高工作效率低成本低成本可迅速普及推广可迅速普及推广第二十九页，讲稿共三十八页哦4.6.3基因芯片的分类u根据分析对象可分为：根据分析对象可分为：细胞固定技术细胞固定技术DNA芯片技术芯片技术蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术u根据芯片制作材料及方法可分为：根据芯片制作材料及方法可分为：ArrayMicroarraychipMicroelectronic array第三十页，讲稿共三十八页哦Arrayu用尼龙膜作固体支撑表面，将目标基因用尼龙膜作固体支撑表面，将目标基因 DNA排列在膜的表排列在膜的表面并固定。面并固定。u杂交方法与常规杂交方法与常规Southern杂交相同。即杂交相同。即mRNA反转录反转录32P或或33P标记的标记的cDNA作探针进行杂交。作探针进行杂交。u 这种方法经典，稳定，但密度低，这种方法经典，稳定，但密度低，812cm的膜可点的膜可点4384=1536个基因。个基因。第三十一页，讲稿共三十八页哦Expression decreasedExpression increasedBMinghui 63 leaf:no pathogen inoculationMinghui 63 leaf:inoculated withMagnaporthe grisea,V86013 for 5 daysAAB第三十二页，讲稿共三十八页哦Microarrayu用经特殊处理的玻璃片（载玻片）作固体支持表面，将目用经特殊处理的玻璃片（载玻片）作固体支持表面，将目标基因标基因 DNA 排列在玻片表面并固定。排列在玻片表面并固定。u探针采用多色荧光标记。探针采用多色荧光标记。u其特点是，密度高、制作方便，是目前应用最广泛的基因其特点是，密度高、制作方便，是目前应用最广泛的基因芯片之一。芯片之一。u1cm2可以固定可以固定3000-10000个点。个点。第三十三页，讲稿共三十八页哦DNAchip（Affymetrix公司)u在玻璃或朔料表面经光化学处理，运用固相合成技术在固体表面在玻璃或朔料表面经光化学处理，运用固相合成技术在固体表面直接合成各种不同的寡聚核苷酸（一般为直接合成各种不同的寡聚核苷酸（一般为20bp）。）。u探针采用多色荧光标记。探针采用多色荧光标记。u其特点是，密度可高达其特点是，密度可高达40万个寡核苷酸万个寡核苷酸/1.6cm2。第三十四页，讲稿共三十八页哦 原位合成芯片示意图原位合成芯片示意图原位合成芯片示意图原位合成芯片示意图第二十轮合成第二十轮合成AAGcGT第一轮合成第一轮合成AGAGcT第二轮合成第二轮合成cGTTG GcGTcGTTGGAGAAGAAAccGGGccTTGGAAcT第三十五页，讲稿共三十八页哦Microelectronicarrayu运用集成电路控制电极，使电极与目标运用集成电路控制电极，使电极与目标DNA分子结合。分子结合。u自动化程度高，具有极高的发展前景。自动化程度高，具有极高的发展前景。u制作工艺复杂、点样密度低。制作工艺复杂、点样密度低。Nanogen公司公司第三十六页，讲稿共三十八页哦第三十七页，讲稿共三十八页哦4.6.4水稻基因芯片实例u标记的方法通常是在反转录的底物中加入标记基团的核苷酸标记的方法通常是在反转录的底物中加入标记基团的核苷酸单体，通过反转录将标记分子掺入单体，通过反转录将标记分子掺入cDNA分子探针中。分子探针中。u标记底物：标记底物：dUTP 替代物替代物Cy3、Cy5Cy3-AP3-dUTP:Ex.550nmEm.570nmCy5-AP3-dUTP:Ex.649nmEm.670nm第三十八页，讲稿共三十八页哦