固定化酶与固定化细胞技术讲稿.ppt

关于固定化酶与固定化细胞技术第一页，讲稿共八十三页哦2.酶在应用中受到的限制因素：酶在应用中受到的限制因素：1.酶作为酶作为:生物生物催化剂的优点催化剂的优点稳定性差，易失活稳定性差，易失活反应速度随时间减慢（反应速度随时间减慢（3分钟内吸光度的变化）分钟内吸光度的变化）回收困难（淀粉酶水解废弃淀粉）回收困难（淀粉酶水解废弃淀粉）经济上不合算：经济上不合算：多不能重复使用。多不能重复使用。一些酶价格昂贵（漆酶用于木板粘合）一些酶价格昂贵（漆酶用于木板粘合）反应专一性强。反应专一性强。催化效率高（比一般催化剂高催化效率高（比一般催化剂高107-1013倍）。倍）。反应条件温和（常温常压）。反应条件温和（常温常压）。第二页，讲稿共八十三页哦（1）人工合成酶：人工合成酶：应用化学合成法合成具有像酶那样应用化学合成法合成具有像酶那样活性的催化剂。这是有机合成和聚合化学中的最新技术。活性的催化剂。这是有机合成和聚合化学中的最新技术。但距实际应用还有很大距离。但距实际应用还有很大距离。（2）酶的人工酶的人工“改性改性”、“修饰修饰”：酶和细胞固定化酶和细胞固定化是其中的一类。其它如基因工程、化学修饰等方法。是其中的一类。其它如基因工程、化学修饰等方法。3.克服上述限制性因素的途径：克服上述限制性因素的途径：第三页，讲稿共八十三页哦难得的报道：人工合成脂肪酶获得成功 随着生物产业的发展，人类对环境逐步认识，酶的广泛用途越来越得到人类的重视，尤其脂肪酶，在日化洗涤剂领域、医药美容领域、能源领域生物柴油生产中显得无可替代的优势。一般脂肪酶生产主要来源于发酵微生物生产法获得，产量受到限制，成本较高，很难满足工业需求。关于人工合成脂肪酶在中国乃至世界未曾有过相关报道。经过不懈努力，我公司通过人工合成的手段获得成功，实属国际首例。经检验它不仅具备生物酶的通性，具有生物酶的全效功能，而且其催化性能、环境要求、毒化耐性各项指标远远高于普通生物酶。生产成本不足普通酶的三分之一，而且不受产量的局限，可大规模投入生产。石家庄市华北联化科技有限公司 第四页，讲稿共八十三页哦第一节第一节固定化酶固定化酶（ImmobilizedEnzyme）一、发展概况一、发展概况(1)1916，Nelson和和Griffin发现蔗糖酶结合于骨炭末上仍具有活力，发现蔗糖酶结合于骨炭末上仍具有活力，但未引起人们重视。但未引起人们重视。(2)1950前，研究不多，不超过前，研究不多，不超过10篇相关论文。有目的开展固定化研究始篇相关论文。有目的开展固定化研究始于于50年代。年代。1953，Grubhofer和和Schloith将聚氨基聚苯乙烯树脂重氮将聚氨基聚苯乙烯树脂重氮化后与淀粉酶、蛋白酶结合化后与淀粉酶、蛋白酶结合最早固定化酶最早固定化酶(3)60年代进展较快：固定化酶投入工业化生产。年代进展较快：固定化酶投入工业化生产。(4)70年代为快速发展时期。年代为快速发展时期。固定化酶：固定化酶：连接于某种载体上或者限制在一定空间范围内、连接于某种载体上或者限制在一定空间范围内、能连续使用的酶。能连续使用的酶。第五页，讲稿共八十三页哦二、制备固定化酶的原则二、制备固定化酶的原则1、保持酶原有专一性、高效催化能力和常温常压下起催化反应、保持酶原有专一性、高效催化能力和常温常压下起催化反应的特点。制备尽可能在温和条件下进行（低温、最适的特点。制备尽可能在温和条件下进行（低温、最适pH、水溶液、水溶液中）。中）。2、能回收、贮藏和反复使用酶和载体结合牢固性问题。、能回收、贮藏和反复使用酶和载体结合牢固性问题。3、有一定机械强度，以利于机械化、自动化操作。、有一定机械强度，以利于机械化、自动化操作。4、酶与载体结合部位应避开活性中心及与维持酶高级结构有关的基团。、酶与载体结合部位应避开活性中心及与维持酶高级结构有关的基团。且在制备过程尽可能保护这些基团。且在制备过程尽可能保护这些基团。5、最小的空间位阻：载体尽可能地不阻碍与底物的接近。、最小的空间位阻：载体尽可能地不阻碍与底物的接近。6、稳定性：载体不与底物、产物和反应液发生化学反应。、稳定性：载体不与底物、产物和反应液发生化学反应。7、易与产物分离，便于回收和重复使用。、易与产物分离，便于回收和重复使用。8、尽量降低成本。、尽量降低成本。第六页，讲稿共八十三页哦三、固定化酶的制备方法三、固定化酶的制备方法物理法物理法:吸附法、包埋法吸附法、包埋法化学法化学法:交联法、化学共价法交联法、化学共价法综合法综合法:逆胶束包囊法逆胶束包囊法（一）吸附法（一）吸附法采用固体吸附剂将酶吸附在它的表面使之固定的采用固体吸附剂将酶吸附在它的表面使之固定的方法。方法。第七页，讲稿共八十三页哦（1）无机吸附载体：）无机吸附载体：矿物质和其它无机载体。矿物质和其它无机载体。高岭土高岭土：胰凝乳蛋白酶：胰凝乳蛋白酶皂土皂土：过氧化氢酶、核糖核酸酶过氧化氢酶、核糖核酸酶氧化铝：葡萄糖氧化酶氧化铝：葡萄糖氧化酶二氧化硅（覆盖卵磷脂二氧化硅（覆盖卵磷脂/脑磷脂）：酸性磷酸酯酶、脑磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖变位酶。磷酸葡萄糖变位酶。不锈钢：直径不锈钢：直径100-200粒子，以氧化钛处理，可粒子，以氧化钛处理，可吸附吸附-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（17mg/g载体）。载体）。1、载体类型、载体类型第八页，讲稿共八十三页哦9高岭土性质：良好粘结性 粒度和细度 较强结合能力 离子吸附性及交换性 瓷土，现在世界上都把它叫做“高岭土”，在很久很久以前，高岭村有一家姓盛的穷苦夫妻，日子苦得就像黄连一样。盛家夫妻心地却特别善良。有一年冬天，天气寒冷，屋檐下躺着个白发苍苍的老公公，盛家妻子端来了一碗热开水，送到那老公公跟前，请他喝下暖暖身子。妻子借来米，男人生火熬粥，一会儿工夫，一大碗香喷喷，热腾腾的米粥端到了老公公的面前。老公公见了，也不客气，一口气就把粥喝了下去。我没有什么好报答你们，我走后，可到村后东南面的松山顶上一口气挖它个九九八十一锄，老公公早已不见踪影。软乎乎得就像糯米粉一样：“松山顶上的石头，可以拿来做瓷器，做成的瓷器能跟玉器一样的值钱哩！”将挖起的土石做成一个个碗和杯的坯子来，放进窑里一烧，果然个个晶莹洁白，真象玉器一样。从此，高岭村的穷人们在盛家夫妻的带领下，改行挖土建窑烧瓷器了。松山因地处高岭，就改名叫高岭山，山上的瓷土，就叫做高岭土了。第九页，讲稿共八十三页哦10皂土：膨润土、火山黏土。皂土是由天然膨润土精制而成的无机矿物凝胶。膨润土一般是指主要由蒙脱土组成的一种黏土岩。皂土的主要有效成分即为蒙脱土，含量大约90%。蒙脱石是由两个硅氧四面体夹一层铝氧八面体膨润土组成的2:1型晶体结构，由于蒙脱石晶胞形成的层状结构存在某些阳离子如Cu、Mg、Na、K等,且这些阳离子与蒙脱石晶胞的作用很不牢固，易被其它阳离子交换，故具有较好的离子交换性。第十页，讲稿共八十三页哦（2）有机吸附载体）有机吸附载体纤维素粉：糖苷水解酶纤维素粉：糖苷水解酶火棉胶火棉胶：木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖：木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖-6-磷磷酸脱氢酶（酸脱氢酶（70mg酶蛋白酶蛋白/cm2）)（3）离子交换剂作为吸附载体）离子交换剂作为吸附载体CM-纤维素、纤维素、DEAE（二乙胺基乙基）（二乙胺基乙基）-纤维素、纤维素、DEAE-葡聚糖。葡聚糖。人工合成的阴离子、阳离子交换树酯。由苯乙烯、人工合成的阴离子、阳离子交换树酯。由苯乙烯、二乙烯合成的聚合物。二乙烯合成的聚合物。阳离子型：磺酸、磷酸、阳离子型：磺酸、磷酸、-COOH、酚基等基团、酚基等基团阴离子型：阴离子型：季胺、仲胺、伯胺基团。季胺、仲胺、伯胺基团。第十一页，讲稿共八十三页哦火棉胶：火棉胶：硝化棉溶液；硝化纤维素：用一种天然胶或合成胶增塑的硝化棉溶液；硝化纤维素：用一种天然胶或合成胶增塑的树脂与之相结合树脂与之相结合,通过溶剂蒸发而干燥后制成的材料。通过溶剂蒸发而干燥后制成的材料。对眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。经呼吸道和消化道进入人对眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。经呼吸道和消化道进入人体，影响中枢神经系统。人接触后有咽喉痛、头痛、嗜睡、体，影响中枢神经系统。人接触后有咽喉痛、头痛、嗜睡、精神迟钝、腹痛、呕吐、皮肤及眼结膜充血、疼痛。本品极精神迟钝、腹痛、呕吐、皮肤及眼结膜充血、疼痛。本品极易燃。遇明火、高热、氧化剂或胺能引起燃烧爆炸。长期贮易燃。遇明火、高热、氧化剂或胺能引起燃烧爆炸。长期贮存能自燃。存能自燃。CM-纤维素 CMcellulose 即羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose）为阳离子交换纤维素之一。第十二页，讲稿共八十三页哦2、影响因素、影响因素(1)pH：pH变化影响载体和酶蛋白的电荷，从而影响酶的变化影响载体和酶蛋白的电荷，从而影响酶的吸附。一般在蛋白的等电点时可达最大吸附。吸附。一般在蛋白的等电点时可达最大吸附。(2)盐：影响复杂。一般会阻止吸附。盐：影响复杂。一般会阻止吸附。实际上已被用来洗脱从实际上已被用来洗脱从低盐溶液吸附的酶。个别情况可促进蛋白的吸附于原来不吸附低盐溶液吸附的酶。个别情况可促进蛋白的吸附于原来不吸附的惰性支持物上。的惰性支持物上。(3)温度：随温度升高而增加吸附量。但酶失活会加速温度：随温度升高而增加吸附量。但酶失活会加速(4)载体：与载体表面积、多孔度、载体预处理有关。载体：与载体表面积、多孔度、载体预处理有关。颗粒颗粒越小则吸附越好。多孔载体与孔的大小和表面积有关。另外载体的预处越小则吸附越好。多孔载体与孔的大小和表面积有关。另外载体的预处理是极为重要的：有的载体会影响酶的结合量、有的会引起酶变性、有理是极为重要的：有的载体会影响酶的结合量、有的会引起酶变性、有的会降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有较高的酸性而易使酶变性，的会降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有较高的酸性而易使酶变性，需要用缓冲液进行予处理。需要用缓冲液进行予处理。第十三页，讲稿共八十三页哦3、吸附法优缺点、吸附法优缺点(1)优点优点操作简单操作简单;可充分选择不同电荷、不同形状的载体可充分选择不同电荷、不同形状的载体;酶的纯化和固定化可在吸附过程中一步完成酶的纯化和固定化可在吸附过程中一步完成;酶使酶使用过程的失活可重新活化用过程的失活可重新活化;载体可再生载体可再生(2)缺点缺点pH、温度、离子强度、时间等多因素对固定化酶影响复杂，、温度、离子强度、时间等多因素对固定化酶影响复杂，不同酶、不同载体的情况各不相同。不同酶、不同载体的情况各不相同。最适酶量的选择是最适酶量的选择是经验性经验性的。的。吸附程度和固定化酶的活力间不一定平行。吸附程度和固定化酶的活力间不一定平行。酶与载体结合力不强，易导致催化力丧失和污染反应产酶与载体结合力不强，易导致催化力丧失和污染反应产物。物。第十四页，讲稿共八十三页哦4、方法举例、方法举例第十五页，讲稿共八十三页哦酶的发酵生产酶的发酵生产 Aspergillus oryzae3042扩大曲扩大曲40-50小时发酵小时发酵6倍冷蒸馏水抽提倍冷蒸馏水抽提2次次压滤压滤酶液（亮黄色）酶液（亮黄色）测活力。（测活力。（25M/小时小时/ml）载体予处理：载体予处理：DEAE-sephadex25溶胀溶胀0.05mol/LNaOH处理处理洗涤。洗涤。固定化固定化：酶液调节：酶液调节pH7.0-7.0与载体混合（载与载体混合（载体湿重：酶液体湿重：酶液=1g：60ml）4-7冷库搅拌吸附过冷库搅拌吸附过夜夜吸去上清液吸去上清液用蒸馏水和用蒸馏水和0.15Mol/L醋酸钠水醋酸钠水溶液洗涤溶液洗涤水洗涤后水洗涤后4备用。备用。米曲霉氨基酰化酶米曲霉氨基酰化酶第十六页，讲稿共八十三页哦（二）共价结合法（二）共价结合法在酶蛋白分子上功能团与固相支持物表面上的反应在酶蛋白分子上功能团与固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接而使酶固定的方法。基团之间形成化学共价键连接而使酶固定的方法。固固定化酶研究中最活跃的一大类方法定化酶研究中最活跃的一大类方法可供共价结合于载体的功能团包括可供共价结合于载体的功能团包括：氨基氨基：N端端-氨基、赖氨酸残基的氨基、赖氨酸残基的-氨基氨基羧基羧基：C端羧基、门冬端羧基、门冬-羧基、谷氨酸羧基、谷氨酸-COOH巯基巯基：半胱氨酸：半胱氨酸-SH羟基羟基：酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸的：酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸的-OH苯环苯环：苯丙氨酸、酪氨酸：苯丙氨酸、酪氨酸咪唑基咪唑基：组氨酸：组氨酸吲哚基吲哚基：色氨酸：色氨酸第十七页，讲稿共八十三页哦在进行一种酶的固定时，首先要考虑酶的氨基酸组成、活在进行一种酶的固定时，首先要考虑酶的氨基酸组成、活性中心的氨基酸、立体结构及专一化学修饰对酶活性性中心的氨基酸、立体结构及专一化学修饰对酶活性和影响。实际上，共价偶联中最普遍使用的基团是：和影响。实际上，共价偶联中最普遍使用的基团是：氨基、羧基、和苯环氨基、羧基、和苯环。共价偶联反应应注意的问题共价偶联反应应注意的问题：(1)共价结合的功能基团不影响酶的催化活性。共价结合的功能基团不影响酶的催化活性。(2)反应尽可能温和反应尽可能温和(3)最好能在水溶液中进行最好能在水溶液中进行(4)较高的反应专一性：只对某一类功能基团有很较高的反应专一性：只对某一类功能基团有很高的专一性，而对其它基团或才水溶液几乎无副高的专一性，而对其它基团或才水溶液几乎无副反应。反应。第十八页，讲稿共八十三页哦载体选择时的注意问题：载体选择时的注意问题：(1)理化性质：应是亲水性质的，疏水载体往往对酶有理化性质：应是亲水性质的，疏水载体往往对酶有变性的作用。变性的作用。(2)有尽能大的表面积：较细颗粒、多孔载体。有尽能大的表面积：较细颗粒、多孔载体。(3)机械强度和稳定性机械强度和稳定性(4)具备在温和条件下与酶结合的功能团。具备在温和条件下与酶结合的功能团。常用载体：常用载体：(1)天然高分子材料：纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚糖天然高分子材料：纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚糖凝胶、胶原及其衍生物。凝胶、胶原及其衍生物。(2)合成高聚物：尼龙、多聚氨基酸、乙烯合成高聚物：尼龙、多聚氨基酸、乙烯-顺丁烯顺丁烯二酸酐共聚物等。二酸酐共聚物等。(3)无机支持物：多孔玻璃、金属氧化物等。无机支持物：多孔玻璃、金属氧化物等。第十九页，讲稿共八十三页哦第二十页，讲稿共八十三页哦按载体连接的基团类型分为：按载体连接的基团类型分为：(1)苯氨基载体苯氨基载体(2)羧基载体羧基载体(3)酯族氨基载体酯族氨基载体(4)硅烷化无机载体硅烷化无机载体载体表面获得反应基的反应类型载体表面获得反应基的反应类型：苯氨基：苯氨基：重氮法重氮法、异硫氰酸法、异硫氰酸法羧基：羧基：叠氮法叠氮法、酰氯法、活化酯法、酸酐法、酰氯法、活化酯法、酸酐法羧基、氨基：羧基、氨基：缩合法缩合法氨基：氨基：戊二醛活化法戊二醛活化法含羟基化合物：含羟基化合物：溴化氰法溴化氰法活泼卤素、二硫化合物、醛基高聚物活泼卤素、二硫化合物、醛基高聚物：直接与酶偶联直接与酶偶联其它：其它：硅烷化法硅烷化法、金属鳌合法、四元缩合反应、金属鳌合法、四元缩合反应第二十一页，讲稿共八十三页哦1、重氮法、重氮法原理：原理：带带芳氨基侧链芳氨基侧链的聚合物用的聚合物用亚硝酸亚硝酸处理，形成处理，形成重氮重氮盐盐，在中性偏碱性条件处（，在中性偏碱性条件处（pH8-9），亲电子的芳族重氮），亲电子的芳族重氮离子攻击活泼的芳香环，如酪氨酸的酚基、组氨酸的咪唑离子攻击活泼的芳香环，如酪氨酸的酚基、组氨酸的咪唑基，形成相应的偶氮衍生物。而与基，形成相应的偶氮衍生物。而与-NH2(N端端-氨基、氨基、赖氨酸残基的赖氨酸残基的-氨基氨基)的反应，须在过量重氮盐存在的反应，须在过量重氮盐存在下形成下形成双偶氮化合物双偶氮化合物。第二十二页，讲稿共八十三页哦pH8-9芳族重氮基具有疏水性，趋向于吸附蛋白分子上芳族重氮基具有疏水性，趋向于吸附蛋白分子上疏水性的酪氨酸集中区域。疏水性的酪氨酸集中区域。第二十三页，讲稿共八十三页哦重氮法常用的载体有：重氮法常用的载体有：带苯氨基的珠状带苯氨基的珠状聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺带苯氨基的带苯氨基的多孔玻璃多孔玻璃间氨基苯甲氧基间氨基苯甲氧基纤维素纤维素对氨基苯对氨基苯纤维素纤维素。ABSE-多糖（对氨基苯磺酰乙基多糖（对氨基苯磺酰乙基)制备过程：制备过程：第二十四页，讲稿共八十三页哦例：例：ABSE-纤维素固定化胰蛋白酶纤维素固定化胰蛋白酶（1）碱性纤维素制备：）碱性纤维素制备：24g干甘蔗芒杆纤维素，加干甘蔗芒杆纤维素，加48ml12%NaOH溶液，溶液，0搅拌搅拌1h，15倍水稀释后过滤。倍水稀释后过滤。（2）活化剂配制：）活化剂配制：对对-硫酸酯乙砜基苯胺硫酸酯乙砜基苯胺24g，加，加60ml蒸蒸馏水，馏水，40搅拌，加搅拌，加1mol/LNa2CO3溶液调节溶液调节pH至至6.5（约（约48ml），离心去沉淀，得到对），离心去沉淀，得到对-硫酸酯乙砜基苯胺硫酸酯乙砜基苯胺溶液。溶液。（3）ABSE纤维素制备：纤维素制备：加碱性纤维素、活化剂溶液于反应加碱性纤维素、活化剂溶液于反应器，热水浴保持温度达器，热水浴保持温度达60，立即用，立即用0.5MNaOH调节至调节至pH13,温度升至温度升至80,维持维持pH13保温保温45min。以。以2L0.05MNaOH洗涤洗涤3次次,再以水洗涤再以水洗涤3次。得次。得ABSE-纤维素（约纤维素（约75g）第二十五页，讲稿共八十三页哦（4）偶联酶：）偶联酶：A.配制酶液配制酶液:20mg胰蛋白酶溶于胰蛋白酶溶于16ml0.05MCaCl2-0.03ml正丁胺正丁胺(保护剂保护剂)混合液混合液(预先以预先以1MHCl调至调至pH9.5)；B.ABSE-纤维素处理：纤维素处理：取取5gABSE-纤维素，加纤维素，加10ml蒸馏水，蒸馏水，冰水浴冰水浴，边搅拌边加，边搅拌边加1MHCl、5%NaNO2各各2.5ml，摇匀，冰浴，摇匀，冰浴15min抽滤，取出抽滤，取出滤饼，迅速用预冷的滤饼，迅速用预冷的0.05MHCl和蒸馏水各洗涤和蒸馏水各洗涤三次。三次。(重氮化重氮化)C.偶联：偶联：滤饼投入胰蛋白酶液中，立即用滤饼投入胰蛋白酶液中，立即用2MTris液调液调pH至至7.5-7.8，搅拌，搅拌1h，抽滤。，抽滤。D.洗涤：洗涤：固定化酶以固定化酶以50ml3%NaCl搅拌洗涤搅拌洗涤3次，水洗次，水洗涤涤2次后，悬浮于次后，悬浮于0.05MCaCl2溶液中，冰箱保溶液中，冰箱保存备用。存备用。第二十六页，讲稿共八十三页哦2、叠氮法、叠氮法将载体上将载体上羧基羧基活化成活化成叠氮化合物叠氮化合物，可以与酶分子上，可以与酶分子上的的-NH2、-OH、-SH发生共价结合。发生共价结合。这是最早、也是经常使用的一种共价结合的方法。这是最早、也是经常使用的一种共价结合的方法。该类方法所使用的该类方法所使用的载体载体有：有：CM-纤维素、纤维素、CM-Sephadex、聚门冬氨酸、生物胶、聚门冬氨酸、生物胶CM-100等等。第二十七页，讲稿共八十三页哦反应原理反应原理即即CM载体在酸或三氟化硼催化下以载体在酸或三氟化硼催化下以甲醇酯化甲醇酯化，然后用，然后用水合肼肼解水合肼肼解，再通过，再通过亚硝酸活化亚硝酸活化成叠氮化合物。可成叠氮化合物。可与酶与酶-NH2基反应形成肽键基反应形成肽键而偶联（而偶联（pH7.5-8.5，高聚叠氮化，高聚叠氮化合物易结合合物易结合-NH2基）。基）。第二十八页，讲稿共八十三页哦3、溴化氰法、溴化氰法带带-OH基基的的多糖载体多糖载体，通过溴化氰活化后连接酶，通过溴化氰活化后连接酶.具有连位具有连位-OH基的高聚物（纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖基的高聚物（纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）都可用此法。凝胶等）都可用此法。反应原理：反应原理：第二十九页，讲稿共八十三页哦多糖在高多糖在高pH（10-11.5）用）用CNBr活化，在稍低活化，在稍低pH条件下条件下连接蛋白游离氨基。连接蛋白游离氨基。亚氨基碳酸盐亚氨基碳酸盐对蛋白的氨基的亲核对蛋白的氨基的亲核反应十分敏感，生成反应十分敏感，生成N-取代异脲取代异脲、N-取代亚胺碳酸酯取代亚胺碳酸酯、N-取代氨基甲酸酯取代氨基甲酸酯的衍生物。的衍生物。实际连接过程很简单，即载体先与实际连接过程很简单，即载体先与CNBr短时间反应，洗短时间反应，洗去未反应去未反应CNBr，投入酶液即发生连接。，投入酶液即发生连接。该法优点：该法优点：1）可应用不同的载体；）可应用不同的载体；2）酶连接量高；）酶连接量高；3）固）固定化活力高。定化活力高。注意问题：注意问题：CNBr有毒，称量、溶解及活化反应均就在通有毒，称量、溶解及活化反应均就在通风橱内进行。过量试剂可在风橱内进行。过量试剂可在pH11条件下，用过量漂白粉条件下，用过量漂白粉处理一晚后弃去。处理一晚后弃去。第三十页，讲稿共八十三页哦HCl（盐酸）稀：比较酸，感觉嘴里滑溜溜的，典型的呕吐物感，微辣。浓：极度的酸，吐掉以后回味苦，然后整个嘴里发凉，10分钟后好转。H2SO4（硫酸）稀：淡淡的酸味，回味感觉油腻，微热，甜，无任何不适感。较浓的（40%左右的）：超烫，感觉喝烫稀饭了，然后微甜感和痛感并存，持续2天才退（98%的纯正浓硫酸不敢喝）。HNO3（硝酸）稀：先是苦，然后整条舌头麻了，然后痛，起了白斑，持续疼痛，3-4天后消退，同时嘴里感觉大吸了一口汽车尾气。浓：不敢喝（猜测是浓硫酸的加强版）。NaOH（氢氧化钠）稀：基本上同浓Na2CO3（我尝过，咸），多一些辣感（对蛋白质腐蚀性强的都会有辣感）。浓：含在嘴里十分的辣(可能是已经反应起来了)然后舌头烧坏,呈黄色,肉腐烂，1个月不能说话,口里有赤痛感而且舌头麻木 有辛辣感半年后出院,说话变得不准,味觉几乎消失,嘴部留下疤痕（这东西对蛋白质的反应不是闹着玩的）。CuSO4（硫酸铜）一开始没味道，吐出后回味淡淡的苦涩（我的确尝过）。BaCl2（氯化钡）：极苦咸，大约相当于MgCl2的加强版CCl4（四氯化碳）这个最恐怖了，整个嘴里感到烧塑料的味道，极浓郁，吐掉以后出现说不出的怪异甜味，直感觉全身松软（的确，闻起来还可以，尝起来就郁闷了）。Na2O2（过氧化钠）一般的咸（Na盐基本都这个味道）。无水酒精嘴里完全没味道，之后花露水的味道在鼻子里挥之不去。FeCl3）（氯化铁）凉，然后酸，与硬币放嘴里感觉差不多（Fe盐都这味道）。AgNO3（硝酸银）没味道。稀Br2（溴）水溶液极其浓重味道，感觉像汽车尾气与松节油混合的味（只能如此形容）Hg(NO3)2（硝酸汞）很淡的味道，有点像味精和醋混合了。H2O2（双氧水）特辣，赶紧吐了，之后就没什么事情了。还有一个百度知道里面的：极其微量的氰化物是苦的，宝贵资料啊。乙酰水杨酸我试过有点酸，有点涩，最后有点苦尽甘来的那种感觉。我尝过溴化氢，一不小心吸进去的。味道上没什么感觉，但是非常呛，吸进去很少，但是咳了一整个下午，一直到吃晚饭都反胃，印象深刻啊 第三十一页，讲稿共八十三页哦4、硅烷化法、硅烷化法无机载体机械强度好、耐受有机溶剂的作用和微无机载体机械强度好、耐受有机溶剂的作用和微生物侵蚀能力强，可以再生，在广泛范围的生物侵蚀能力强，可以再生，在广泛范围的pH、压、压力、温度下载体不改变结构，同时来源丰富、力、温度下载体不改变结构，同时来源丰富、价格低廉。价格低廉。无机载体支持物表面采用硅烷化反应引入功能无机载体支持物表面采用硅烷化反应引入功能团，进一步可通过不同的化学反应制成带有团，进一步可通过不同的化学反应制成带有苯氨苯氨基、醛基基、醛基等基团成为活性载体。然后连接酶蛋白等基团成为活性载体。然后连接酶蛋白。载体载体：多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔氧化铝、磁性氧：多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔氧化铝、磁性氧化铁等化铁等第三十二页，讲稿共八十三页哦12第三十三页，讲稿共八十三页哦3第三十四页，讲稿共八十三页哦与支持物表面硅烷醇或与支持物表面硅烷醇或O-离子连接，相邻硅烷间还离子连接，相邻硅烷间还可以发生聚合。其产物烷胺基玻璃是带有有机功能可以发生聚合。其产物烷胺基玻璃是带有有机功能团（氨基）的无机载体。进一步可通过不同的化学团（氨基）的无机载体。进一步可通过不同的化学反应制成带有苯氨基、醛基等基团，成为活性载体。反应制成带有苯氨基、醛基等基团，成为活性载体。例如，乳酸脱氢酶可通过此法偶联与多孔玻璃。例如，乳酸脱氢酶可通过此法偶联与多孔玻璃。上述方法制备的固定化酶，其稳定性超过有机多上述方法制备的固定化酶，其稳定性超过有机多聚物作为载体的固定化酶。聚物作为载体的固定化酶。第三十五页，讲稿共八十三页哦利用多功能试剂进行酶蛋白分子间的交联，酶分子利用多功能试剂进行酶蛋白分子间的交联，酶分子与多功能试剂间形成共价键，得到立体交联的网架结构。与多功能试剂间形成共价键，得到立体交联的网架结构。（三）交联法（三）交联法常用的常用的交联剂有交联剂有：戊二醛戊二醛双重氮联苯胺双重氮联苯胺-2,2-二磺酸二磺酸1,5-二氟二氟-2,4-二硝基苯二硝基苯已二酰亚胺二甲酯。已二酰亚胺二甲酯。第三十六页，讲稿共八十三页哦戊二醛可直接参与酶蛋白分子的交联，便其作用机理不戊二醛可直接参与酶蛋白分子的交联，便其作用机理不完全清楚。实验证明，酶蛋白分子中的赖氨酸参与了反完全清楚。实验证明，酶蛋白分子中的赖氨酸参与了反应。可能过程如下：应。可能过程如下：第三十七页，讲稿共八十三页哦多功能试剂制备固定化酶，可进一步分为：多功能试剂制备固定化酶，可进一步分为：（1）单独与酶使用。）单独与酶使用。(交联酶法交联酶法)（2）辅助蛋白、酶与之共同使用。）辅助蛋白、酶与之共同使用。(酶辅助蛋白交酶辅助蛋白交联法联法)（3）酶吸附载体后再进行交联。）酶吸附载体后再进行交联。(吸附交联吸附交联)（4）先与载体反应，形成多功能基团载体，然后再）先与载体反应，形成多功能基团载体，然后再连接酶。连接酶。(载体交联法载体交联法)直接交联酶法虽然操作简便，但固定化颗粒太细，活力往往不高。直接交联酶法虽然操作简便，但固定化颗粒太细，活力往往不高。第三十八页，讲稿共八十三页哦（四）包埋法（四）包埋法将酶包裹于凝胶格子、或聚合物半透膜微胶囊中的将酶包裹于凝胶格子、或聚合物半透膜微胶囊中的方法。可分为凝胶包埋法和微胶囊化法。方法。可分为凝胶包埋法和微胶囊化法。1、凝胶包埋法（格子型）、凝胶包埋法（格子型）常用常用载体载体：海藻酸、海藻酸、K-角叉菜（卡拉胶）、琼脂角叉菜（卡拉胶）、琼脂、三醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。三醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。方法方法：混合单体、交联剂和酶（于缓冲溶液中进行），：混合单体、交联剂和酶（于缓冲溶液中进行），然后加入催化剂，系统开始聚合。然后加入催化剂，系统开始聚合。固定化酶成型可分为固定化酶成型可分为凝胶后成型凝胶后成型、边凝聚边成型边凝聚边成型两种。前者是在凝胶聚合后，将其切成小块，再经挤两种。前者是在凝胶聚合后，将其切成小块，再经挤压后形成不规则颗粒。后者是在聚合过程中使之聚合压后形成不规则颗粒。后者是在聚合过程中使之聚合成珠状。成珠状。第三十九页，讲稿共八十三页哦卡拉胶：鹿角菜胶、角叉菜胶。是从某些红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体，卡拉胶：鹿角菜胶、角叉菜胶。是从某些红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体，化学结构是由化学结构是由半乳糖半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐。由于硫酸酯结合形态的不同，可分盐。由于硫酸酯结合形态的不同，可分K型、型、I型、型、L型。在果冻，软糖，型。在果冻，软糖，冰激凌等食品工业应用广泛。冰激凌等食品工业应用广泛。海藻酸：来自海藻的由海藻酸：来自海藻的由D-甘露糖醛酸和甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸组成的多糖。可古洛糖醛酸组成的多糖。可抑制大鼠肠道对锶抑制大鼠肠道对锶(90Sr)吸收。除褐藻等海藻外，棕色固氮菌等细菌吸收。除褐藻等海藻外，棕色固氮菌等细菌亦产生藻酸类型的多糖亦产生藻酸类型的多糖。海藻酸为淡黄色粉末；无臭；几乎无味，。海藻酸为淡黄色粉末；无臭；几乎无味，在水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中不溶，在氢氧化碱溶液中溶解。在水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中不溶，在氢氧化碱溶液中溶解。有助悬、增稠、乳化、粘合等作用。可用为微囊囊材，或作为包衣有助悬、增稠、乳化、粘合等作用。可用为微囊囊材，或作为包衣及成膜的材料。及成膜的材料。第四十页，讲稿共八十三页哦以聚丙烯酰胺凝胶为例加以介绍：以聚丙烯酰胺凝胶为例加以介绍：（1）单体单体：丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸：丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸（2）双功能交联剂双功能交联剂：N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)（3）催化系统催化系统：碱催化系统：碱催化系统：TEMED（四甲基乙二胺）和过硫（四甲基乙二胺）和过硫酸胺系统；酸胺系统；-二甲基丙腈和过硫酸钾系统。二甲基丙腈和过硫酸钾系统。光催化：核黄素过硫酸胺系统光催化：核黄素过硫酸胺系统辐射、冰冻无氧辐射等。辐射、冰冻无氧辐射等。（4）珠状聚合包埋珠状聚合包埋过程：酶、保护剂、单体、交联剂、过程：酶、保护剂、单体、交联剂、聚合催化剂混合后，立即在疏水相（一种乳化剂，与聚合催化剂混合后，立即在疏水相（一种乳化剂，与水有同样密度）的有机溶剂中分散成珠状凝胶。水有同样密度）的有机溶剂中分散成珠状凝胶。第四十一页，讲稿共八十三页哦举例：制备珠状聚丙烯酰胺包埋举例：制备珠状聚丙烯酰胺包埋-半乳糖苷酶半乳糖苷酶酶液：酶液：酵母半乳糖苷酶酵母半乳糖苷酶100mg，溶于，溶于56ml磷酸缓冲液磷酸缓冲液（0.05M,pH7.3）。其中含）。其中含15-30%的单体、的单体、Bis5%。催化剂：催化剂：含含TEMED0.6ml、200mg过硫酸铵的缓冲液过硫酸铵的缓冲液4ml。疏水相：疏水相：1ml山梨聚糖倍半油酸与山梨聚糖倍半油酸与400ml甲苯甲苯-氯仿（氯仿（290：110）混合）混合.反应与成型：反应与成型：与与混合后迅速加到疏水相，搅拌分混合后迅速加到疏水相，搅拌分散。反应器为散。反应器为1L圆底烧瓶，一浆状搅拌器，圆底烧瓶，一浆状搅拌器，240rpm，反，反应器中保持氮气（应器中保持氮气（保护物料不受氧化，保持产品质量，还能保保护物料不受氧化，保持产品质量，还能保证安全）证安全）。4聚合反应聚合反应30min过滤、洗涤：过滤、洗涤：砂芯漏斗过滤；用砂芯漏斗过滤；用500ml缓冲液洗涤，再缓冲液洗涤，再在在0.1MNH4HCO3中搅拌洗涤中搅拌洗涤60min。过滤。过滤第四十二页，讲稿共八十三页哦2、微胶囊化法、微胶囊化法酶溶液被包裹在膜内，膜既能使酶存在于类似于细酶溶液被包裹在膜内，膜既能使酶存在于类似于细胞内的环境，又阻止了酶的脱落或直接与外环境接胞内的环境，又阻止了酶的脱落或直接与外环境接触。又分为触。又分为界面沉淀法界面沉淀法和和界面聚合法界面聚合法。（1）界面沉淀法）界面沉淀法某些高聚物在在某些高聚物在在水相和有机相的界面水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜（沉淀析上溶解度极低而形成皮膜（沉淀析出），从而将酶包裹的方法。出），从而将酶包裹的方法。酶溶液在与水互不相溶的有机相中酶溶液在与水互不相溶的有机相中乳化乳化，使用油溶性表面活性，使用油溶性表面活性剂，可剂，可形成形成油包水的微滴油包水的微滴。再将溶于有机溶剂的高聚物加入搅拌着的乳化液中，然。再将溶于有机溶剂的高聚物加入搅拌着的乳化液中，然后加入一种不能溶解高聚物的有机溶剂，使后加入一种不能溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油高聚物在油-水界面上沉淀、析水界面上沉淀、析出、形成膜，最后转移入水相，制成固定化酶出、形成膜，最后转移入水相，制成固定化酶即所谓即所谓“人工细胞人工细胞”。第四十三页，讲稿共八十三页哦微囊直径与乳化的程度有关，乳化分散的好坏又与微囊直径与乳化的程度有关，乳化分散的好坏又与搅拌的速度搅拌的速度有关。有关。制作膜材料的高聚物：制作膜材料的高聚物：硝酸纤维素硝酸纤维素聚苯乙烯聚苯乙烯聚甲酯丙烯酸甲酯聚甲酯丙烯酸甲酯等等优点：条件温和，不引起酶的失活。优点：条件温和，不引起酶的失活。缺点：除去膜上有机溶剂比较麻烦。缺点：除去膜上有机溶剂比较麻烦。第四十四页，讲稿共八十三页哦举例：举例：界面沉淀法制备界面沉淀法制备“人工细胞人工细胞”材料：材料：10%血红蛋白溶液血红蛋白溶液(WhatmanNo42滤纸过滤滤纸过滤)酶液：酶液：悬浮于悬浮于10%血红蛋白溶液血红蛋白溶液有机相：有机相：100ml水饱和的乙醚加水饱和的乙醚加1mlSpan85（水（水-油乳化剂），用前配制。油乳化剂），用前配制。硝酸纤维素溶液：硝酸纤维素溶液：4%硝酸纤维素的乙醇硝酸纤维素的乙醇-乙醚乙醚（1：3）溶液，蒸发至原先重量的）溶液，蒸发至原先重量的20%，然后加乙醚至原，然后加乙醚至原体积，重新溶解。体积，重新溶解。苯甲酸正丁酯苯甲酸正丁酯-Span85溶液溶液：1mlSpan85加于加于100ml苯甲酸正丁酯（用前配制）。苯甲酸正丁酯（用前配制）。Tween20：50%和和1%的水溶液的水溶液（去乳化和洗涤）。（去乳化和洗涤）。磁力搅拌器、磁力搅棒、烧杯磁力搅拌器、磁力搅棒、烧杯第四十五页，讲稿共八十三页哦方法：方法：血红蛋白血红蛋白-酶液乳化：酶液乳化：25ml酶液加等体积有机溶液，立即酶液加等体积有机溶液，立即2600rpm磁磁力搅拌力搅拌5秒钟。秒钟。加成膜材料，乳化：加成膜材料，乳化：25ml硝酸纤维素溶液，继续磁力搅拌硝酸纤维素溶液，继续磁力搅拌60秒。秒。微囊沉降：微囊沉降：4放置放置45min。若全部沉降，去上清（约。若全部沉降，去上清（约4ml），否则），否则离心（离心（350g，5min）去上清。）去上清。成膜成膜：去大部分上清后，立即加苯甲酸正丁酯：去大部分上清后，立即加苯甲酸正丁酯-Span85溶液溶液30ml，1200rpm搅拌搅拌30秒。秒。4放置放置30min。微囊沉降完全，否则离心。微囊沉降完全，否则离心（350g，5min），去上清。），去上清。微囊转移至水相：微囊转移至水相：加加25ml50%Tween20，2900rpm搅拌分散搅拌分散30秒，秒，减至减至1200rpm，同时加入，同时加入25ml水，再搅拌水，再搅拌30秒，用秒，用200ml水稀释。水稀释。离心（离心（350g，5min），去上清。），去上清。洗涤：洗涤：1%Tween20反复洗涤，直到不再含有血红蛋白和苯甲酸正反复洗涤，直到不再含有血红蛋白和苯甲酸正丁酯气味。最后悬浮于丁酯气味。最后悬浮于0.9%NaCl溶液中溶液中第四十六页，讲稿共八十三页哦(2)界面聚合法：界面聚合法：化学制微囊的方法。在油化学制微囊的方法。在油-水界面发生水界面发生聚合反应聚合反应而成膜。而成膜。成膜材料：尼龙成膜材料：尼龙610、聚酰胺、聚脲等。、聚酰胺、聚脲等。主要过程主要过程:(以尼龙膜制备为例以尼龙膜制备为例)酶液与酶液与聚合单体聚合单体混合：酶溶于混合：酶溶于10%血红蛋白溶液，血红蛋白溶液，加已甲叉二胺水溶液。加已甲叉二胺水溶液。乳化：分散相为含乳化：分散相为含1%Span85的氯仿的氯仿-环已烷。环已烷。聚合：加溶于有机相的聚合：加溶于有机相的癸二酰氯癸二酰氯。去乳化、洗涤：去乳化、洗涤：Tween去乳化和洗涤，转移至水去乳化和洗涤，转移至水相。相。第四十七页，讲稿共八十三页哦第四十八页，讲稿共八十三页哦表表1固定化化酶制备方法及特性比较固定化化酶制备方法及特性比较特性制备方法离子交换吸附物理吸附共价结合交联法包埋法制备难易易易难难难（中）酶活力高低高中高底物特异性不变不变易变易变不变酶与载体结合能力中弱强强强再生性可能可能不可不可不可使用普遍性高低中中高成本低低高中中第四十九页，讲稿共八十三页哦50四、固定化载体材料新进展四、固定化载体材料新进展（1）传统载体材料的改性）传统载体材料的改性利用有机聚合物对传统无机载体材料改性修饰：利用有机聚合物对传统无机载体材料改性修饰：右旋糖苷对硅胶表面改性修饰可改善其表面的生物亲右旋糖苷对硅胶表面改