微生物检验第四章细菌耐药检验 (2).ppt

微生物检验第四章细菌耐药检验现在学习的是第1页，共31页2.肠球菌的天然耐药肠球菌的天然耐药对一、二、三、四头孢菌素、克林霉素、对一、二、三、四头孢菌素、克林霉素、磺胺类、氨基糖苷类（高浓度除外）天然磺胺类、氨基糖苷类（高浓度除外）天然耐药。耐药。可选范围：青霉素、氨苄西林、万古霉素、可选范围：青霉素、氨苄西林、万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、头孢硫脒等。替考拉宁、利奈唑胺、头孢硫脒等。现在学习的是第2页，共31页3.3.链球菌天然耐药链球菌天然耐药肺炎链球菌对第一代喹诺酮类药物耐药，并对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星敏感性低。链球菌对氨基糖苷类天然耐药或对水平耐药。4.4.李斯特菌天然耐药李斯特菌天然耐药对磺胺类、杆菌肽、多粘菌素、头孢菌素类天然耐药。现在学习的是第3页，共31页细菌的常见耐药机制 细菌耐药机制主要有四种：1.产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；2.抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋解旋酶、酶、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶的改变等；的改变等；3.细菌膜的通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通道蛋细菌膜的通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通道蛋白丢失；白丢失；4.细菌主动外排系统的过度表达。细菌主动外排系统的过度表达。在上述耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。现在学习的是第4页，共31页-内酰胺酶 内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中；检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。现在学习的是第5页，共31页超广谱-内酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制；ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。现在学习的是第6页，共31页超广谱-内酰胺酶（ESBLs）稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL：头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC2mg/mL或头孢泊肟MIC8mg/mL 现在学习的是第7页，共31页超广谱-内酰胺酶（ESBLs）纸片法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL（筛选阳性）：头孢泊肟17mm头孢他啶22mm头孢噻肟27mm头孢曲松25mm氨曲南 27mm现在学习的是第8页，共31页超广谱-内酰胺酶（ESBLs）纸片法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差5mm时，即可判断该菌产ESBL。现在学习的是第9页，共31页超广谱-内酰胺酶（ESBLs）稀释法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。现在学习的是第10页，共31页AmpC酶的特征AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的型内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。与ESBLs不同的是，AmpC酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。现在学习的是第11页，共31页AmpC酶的检测方法头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法；除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpC Disk、头孢西丁琼脂基础法等。现在学习的是第12页，共31页碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的-内酰胺酶，主要分布于-内酰胺酶A、B、D类中。根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类：一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类-内酰胺酶；另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类-内酰胺酶。现在学习的是第13页，共31页 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a，这种蛋白对甲氧西林和其他的-内酰胺类抗生素亲和力下降，从而导致对这些抗生素的耐药。SCCmec主要由mec复合物和ccr复合物两部分组成。根据不同mec复合物和ccr复合物的组合，可以将SCCmec分成不同的型别，目前已发现8种SCCmec型。耐甲氧西林葡萄球菌现在学习的是第14页，共31页耐甲氧西林葡萄球菌的检测MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。对于金黄色葡萄球菌，MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。现在学习的是第15页，共31页甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS）MRS检测药物纸片法稀释法金黄色葡萄球菌1mg 苯唑西林路邓葡萄球菌1mg 苯唑西林金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌30mg 头孢西丁除路邓以外的凝固酶阴性葡萄球菌1mg 苯唑西林30mg 头孢西丁现在学习的是第16页，共31页凝固酶阴性葡萄球菌中苯唑西林MIC结果的报告策略*苯唑西林苯唑西林苯唑西林苯唑西林 MIC(MIC(g/ml)g/ml)进行进行进行进行 mecmecA A 或或或或 PBP2a PBP2a 或或或或头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散0.250.254.04.00.5-2.00.5-2.0报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报报告苯告苯告苯告苯唑唑西林耐西林耐西林耐西林耐药药阴性阴性阴性阴性阳性阳性阳性阳性报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药报告苯唑西林耐药*检测无菌部位感染的检测无菌部位感染的 非表皮葡萄球菌菌株非表皮葡萄球菌菌株现在学习的是第17页，共31页克林霉素诱导耐药葡萄球菌红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。*或其他大环内酯类现在学习的是第18页，共31页机制机制机制机制耐药基因耐药基因耐药基因耐药基因红霉素红霉素红霉素红霉素克林霉素克林霉素克林霉素克林霉素核糖体修饰核糖体修饰核糖体修饰核糖体修饰-药物不能结合药物不能结合药物不能结合药物不能结合于靶位于靶位于靶位于靶位ermermR RS*S*R RR R结构性结构性结构性结构性泵泵泵泵-药物被泵出药物被泵出药物被泵出药物被泵出msrmsrA AR RS Sermerm=erythromycin ribosome methylase=erythromycin ribosome methylasemsrAmsrA=macrolide streptogramin resistance=macrolide streptogramin resistance*需要诱导来显示耐药性需要诱导来显示耐药性 红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制现在学习的是第19页，共31页诱导性克林霉素耐药（诱导性克林霉素耐药（erm介导）介导）葡萄球菌-“D试验”患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药无克林霉素诱导（无克林霉素诱导（msrA介导）介导）真的克林霉素敏感真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感报告克林霉素敏感“D”阳性阳性阴性阴性15 15 26 mm26 mm现在学习的是第20页，共31页葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法4.04.0g/ml g/ml 红霉素红霉素 0.50.5 g/ml g/ml 克林霉素克林霉素No growthNo growth=无诱导性克林霉素耐药无诱导性克林霉素耐药生长生长=诱导性克林霉素耐药诱导性克林霉素耐药现在学习的是第21页，共31页对于红霉素耐药，克林霉素敏感的葡萄球菌，需检测诱导性克林霉素耐药注意试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐药株)；对于CoNS，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌；大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的；大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA 基因型)；克林霉素可以口服给药。现在学习的是第22页，共31页万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌（VISA）耐药是由于：耐药是由于：耐药是由于：耐药是由于：增厚的细胞壁增厚的细胞壁增厚的细胞壁增厚的细胞壁检测检测检测检测困难；表型不稳定困难；表型不稳定困难；表型不稳定困难；表型不稳定菌落形态菌落形态菌落形态菌落形态不典型金葡菌不典型金葡菌不典型金葡菌不典型金葡菌万古霉素敏感万古霉素敏感万古霉素中介万古霉素中介细胞壁细胞壁现在学习的是第23页，共31页当有以下一个或多个情况时菌株可疑为当有以下一个或多个情况时菌株可疑为VISA-內酰胺类药物的內酰胺类药物的MIC降低降低达托霉素达托霉素MIC升高升高菌落形态不典型（一些为微小菌落）菌落形态不典型（一些为微小菌落）肉汤中生长迟缓（如血培养）肉汤中生长迟缓（如血培养）凝固酶反应微弱凝固酶反应微弱/延迟延迟经过几次次代经过几次次代培养后：培养后：菌落回复为典型形态菌落回复为典型形态万古霉素万古霉素MIC降低并且菌株变为万古霉素敏感降低并且菌株变为万古霉素敏感现在学习的是第24页，共31页万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（VRSA）耐药是由于耐药是由于耐药是由于耐药是由于 从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（VREVRE）中获得）中获得）中获得）中获得vanAvanA基因基因基因基因 美国报道例数美国报道例数美国报道例数美国报道例数 9 9个患者个患者个患者个患者检测检测检测检测 大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测菌落形态菌落形态菌落形态菌落形态 典型金葡菌典型金葡菌典型金葡菌典型金葡菌现在学习的是第25页，共31页纸片扩散法折点纸片扩散法折点葡萄球菌葡萄球菌-万古霉素万古霉素CLSI CLSI 文件文件文件文件SusceptibleSusceptible敏感敏感敏感敏感IntermediateIntermediate中介中介中介中介ResistantResistant耐药耐药耐药耐药M100-S18 2008M100-S18 2008 1515-New!New!新新新新M100-S19 M100-S19 2009*2009*-CLSI M100-S19.Table 2C.CLSI M100-S19.Table 2C.对于金黄色葡萄球菌对于金黄色葡萄球菌*假如抑菌圈假如抑菌圈 7 mm7 mm，用用MICMIC法检测万古霉素法检测万古霉素（若有需要）（若有需要）万古霉素纸片扩散法仅在检测携带万古霉素纸片扩散法仅在检测携带万古霉素纸片扩散法仅在检测携带万古霉素纸片扩散法仅在检测携带van-Avan-A金葡菌（金葡菌（金葡菌（金葡菌（VRSAVRSA）时可信；需确证没有抑菌圈）时可信；需确证没有抑菌圈）时可信；需确证没有抑菌圈）时可信；需确证没有抑菌圈 (6 mm)(6 mm)纸片扩散法不能鉴别纸片扩散法不能鉴别纸片扩散法不能鉴别纸片扩散法不能鉴别VSSAVSSA和和和和VISAVISA 纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌现在学习的是第26页，共31页肠球菌肠球菌高水平氨基糖苷类耐药筛查高水平氨基糖苷类耐药筛查纸片扩散法120 g 庆大霉素;300 g 链霉素 10 mm=无高水平氨基糖苷类耐药MIC筛查庆大霉素:500 g/ml 链霉素:1000 g/ml(肉汤)2000 g/ml(琼脂)现在学习的是第27页，共31页肠球菌氨基糖苷类修饰酶 链霉素 庆大霉素 妥布霉素 阿米卡星/丁胺卡那6-AAD +-3APH -+2”APH/6AAC -+6AAC*-+*在所有屎肠球菌中均发现+=+=酶可以修饰药物；药物无协同性酶可以修饰药物；药物无协同性-=-=酶不能修饰药物；药物有协同性酶不能修饰药物；药物有协同性现在学习的是第28页，共31页万古霉素耐药肠球菌（VRE）表型VRE屎肠球菌中居多屎肠球菌中居多vanA-高水平耐药高水平耐药(MIC 256 g/ml)vanB-中等水平耐药中等水平耐药(MIC 16-256 g/ml)低水平万古霉素耐药低水平万古霉素耐药vanC-(MIC 2-16 g/ml)vanC天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌菌株不引起院内爆发，菌株不引起院内爆发，vanC基因不易于传播基因不易于传播纸片扩散法实验可能检测不出纸片扩散法实验可能检测不出现在学习的是第29页，共31页快速快速MGPMGP实验，孵育实验，孵育3-53-5小小时；甲基化时；甲基化-a-D-a-D-葡糖苷酸化葡糖苷酸化黄色黄色阳性阳性阴性阴性铅黄肠球菌的黄色色素铅黄肠球菌的黄色色素VRE现在学习的是第30页，共31页肺炎链球菌 新的青霉素折点(g/ml)敏感敏感敏感敏感中介中介中介中介耐药耐药耐药耐药青霉素注射青霉素注射青霉素注射青霉素注射 (非脑膜炎非脑膜炎非脑膜炎非脑膜炎)224 4 8 8青霉素注射青霉素注射青霉素注射青霉素注射 (脑膜炎脑膜炎脑膜炎脑膜炎)0.060.06-0.10.12 2青霉素青霉素青霉素青霉素 (口服青霉素口服青霉素口服青霉素口服青霉素 V)V)0.060.060.12-10.12-1 2 2CLSI M100-S19.Table 2G.CLSI M100-S19.Table 2G.现在学习的是第31页，共31页