动物细胞工程制药 (4)讲稿.ppt

关于动物细胞工程制药关于动物细胞工程制药(4)第一页，讲稿共七十一页哦第一节第一节 概述概述第二节第二节 动物细胞的形态和生理特性动物细胞的形态和生理特性第三节第三节 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得第四节第四节 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法第六节第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式动物细胞大量培养的方法和操作方式第七节第七节 动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器第八节第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求动物细胞产品的纯化方法和质量要求第九节第九节 动物细胞制药的前景与展望动物细胞制药的前景与展望第二页，讲稿共七十一页哦培养细胞的种类培养细胞的种类 原代细胞培养原代细胞培养 传代细胞培养传代细胞培养培养基不同培养基不同 液体培养液体培养 固体培养固体培养培养容器和方式不同培养容器和方式不同 静止培养静止培养 旋转培养旋转培养 微载体培养微载体培养 中空纤维培养中空纤维培养 固定化培养固定化培养第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法第三页，讲稿共七十一页哦一、细胞分离一、细胞分离1、离离心心分分离离法法：主主要要用用于于从从含含有有细细胞胞的的体体液液，如如血血液液、羊羊水、胸腹水中分离细胞，水、胸腹水中分离细胞，8001000 r/min离心离心510min2、消消化化分分离离法法：将将生生物物体体的的组组织织块块剪剪碎碎用用消消化化液液消消化化，使使组组织织松松散散成成细细胞胞悬悬液液用用缓缓冲冲液液洗洗涤涤、离离心心、去去除除残残留的消化液留的消化液获得所需细胞获得所需细胞第四页，讲稿共七十一页哦消消化化液液的的用用途途：取取材材进进行行原原代代培培养养时时需需要要将将组组织织块块消消化化解解离离形形成成细细胞胞悬悬液液；传传代代培培养养时时将将贴贴壁壁细细胞胞从从瓶瓶壁壁上上消消化化下下来。来。常常用用的的消消化化液液：胰胰蛋蛋白白酶酶、乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸（EDTA）、胰胰酶酶-柠柠檬檬酸酸盐盐、胰胰酶酶-EDTA、胶胶原原酶酶、链链酶酶蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜蛋蛋白酶等白酶等第五页，讲稿共七十一页哦二、细胞计数二、细胞计数1、自动细胞计数器计数、自动细胞计数器计数原原理理：让让一一定定体体积积的的细细胞胞悬悬液液流流经经一一个个小小孔孔，并并在在两两个个电电极极间间通通过过，此此时时通通过过的的细细胞胞就就会会对对电电极极间间的的电电流流产产生生干干扰扰而而使使电电压压发发生生改改变变，这这样样就就会会在在电电子子计计数数器器上上形形成成一个信号被记录下来。一个信号被记录下来。优点：优点：计数速度快计数速度快缺缺点点：无无法法分分辨辨活活细细胞胞和和死死细细胞胞，误误将将细细胞胞结结团团记记录录为单个细胞，使计数值偏低为单个细胞，使计数值偏低第六页，讲稿共七十一页哦2、血球计数板计数、血球计数板计数第七页，讲稿共七十一页哦酚蓝染色：死细胞呈蓝色酚蓝染色：死细胞呈蓝色苯胺黑染色：负染色法，细胞本身不染色苯胺黑染色：负染色法，细胞本身不染色2、血球计数板计数、血球计数板计数第八页，讲稿共七十一页哦3、结晶紫染色细胞核计数法、结晶紫染色细胞核计数法原理：原理：结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。细胞数。第九页，讲稿共七十一页哦4、MTT染色计数法染色计数法MTT：3-(4，5-二甲基噻唑二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。原理：原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不可溶转变为不可溶性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜（性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜（DMSO）。）。MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在490nm处测处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。定其吸光值，可间接反映活细胞数量。灵敏度高；灵敏度高；MTT有致癌性，有致癌性，DMSO极易渗透皮肤。极易渗透皮肤。第十页，讲稿共七十一页哦三、细胞传代三、细胞传代悬浮细胞的传代悬浮细胞的传代：加入一倍或几倍的生长液，然后分：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶种两只或多只培养瓶贴壁细胞的传代贴壁细胞的传代：先消化再分种：先消化再分种第十一页，讲稿共七十一页哦贴壁细胞传代的注意事项贴壁细胞传代的注意事项消化前确定细胞有无污染消化前确定细胞有无污染加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可消化时间不宜过长，室温静置消化时间不宜过长，室温静置2-5min终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基分分种种数数量量取取决决于于细细胞胞数数和和细细胞胞特特性性，多多数数以以20-30万万个个/ml，每次每次1传传2或或1传传3为宜；为宜；已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次次二倍体细胞每次传代时应写上传代次数二倍体细胞每次传代时应写上传代次数传代后每天或隔一天换液，传代后每天或隔一天换液，3-5d传代一次传代一次第十二页，讲稿共七十一页哦四、细胞的冻存和复苏四、细胞的冻存和复苏1、细胞的冻存、细胞的冻存采用液氮低温（采用液氮低温（-196）冻存：加保护剂如）冻存：加保护剂如甘油甘油和和二甲亚砜二甲亚砜；冷冻速度以冷冻速度以1/min的速度下降为宜的速度下降为宜注意事项注意事项：冻存前一天换液培养；冻存前一天换液培养；细胞密度以细胞密度以1-2106个个/ml为宜；为宜；冻存用培养基应与实际使用的一致，冻存用培养基应与实际使用的一致，DMSO过滤除菌；过滤除菌；检查安踣的密封性；检查安踣的密封性；标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。第十三页，讲稿共七十一页哦2、细胞的复苏、细胞的复苏（总的要求是（总的要求是快融快融）注意事项注意事项：操作中注意防护，戴面罩和手套；操作中注意防护，戴面罩和手套；从从液液氮氮中中取取出出后后，立立即即丢丢入入37-40温温水水的的搪搪瓷瓷杯杯中中，并并搅搅动动加速融化；加速融化；用乙醇消毒安踣外表；用乙醇消毒安踣外表；尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；隔天观察细胞生长情况，再换液一次。隔天观察细胞生长情况，再换液一次。第十四页，讲稿共七十一页哦一、动物细胞大规模培养的方法一、动物细胞大规模培养的方法二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式第六节第六节 动物细胞大量培养的方法和动物细胞大量培养的方法和操作方式操作方式第十五页，讲稿共七十一页哦一、动物细胞大规模培养的方法一、动物细胞大规模培养的方法依细胞种类：依细胞种类：原代培养原代培养 传代培养传代培养依培养基：依培养基：液体培养液体培养 固体培养固体培养第十六页，讲稿共七十一页哦依培养容器和方式：依培养容器和方式：静止培养、旋转培养、静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养搅拌培养、微载体培养 中空纤维培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养固定床或流化床培养从生产实际分为：从生产实际分为：悬浮培养悬浮培养 贴壁培养贴壁培养 贴壁贴壁-悬浮培养悬浮培养第十七页，讲稿共七十一页哦1、悬浮培养、悬浮培养 即即让让细细胞胞自自由由地地悬悬浮浮于于培培养养基基内内生生长长繁繁殖殖。适适用用于于一一切切种种类类的的非非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。优优点点：操操作作简简便便，培培养养条条件件比比较较单单一一，传传质质和和传传氧氧较较好好，容容易易扩扩大大培培养养规规模模，在在培培养养设设备备的的设设计计和和实实际际操操作作中中可可借借鉴鉴细细菌菌发发酵酵的的经经验验；可可连连续续收收集集部部分分细细胞胞进进行行移移植植继继代代培培养养，传传代代时时无无需需消消化化分分散散，免免遭遭酶酶类类、EDTA及及机机械械损损害害；细细胞胞收收率率高高，并并可可连连续续测测定定细细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。缺点：缺点：细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低第十八页，讲稿共七十一页哦培培养养过过程程中中，为为确确保保细细胞胞呈呈单单颗颗粒粒均均匀匀悬悬浮浮状状态态，需需采采用用搅搅拌拌或或气气升升式式反反应应器器，以以较较低低搅搅拌拌速速度度及及一一定定速速度度通通入入含含5%CO2的的无无菌菌空空气气，保保持持细细胞胞悬悬浮浮状状态态并并维维持持培培养养液液溶溶解氧和解氧和pH。不不同同细细胞胞悬悬浮浮条条件件不不同同。为为使使细细胞胞不不致致凝凝集集、成成团团或或沉沉淀淀，在在配配制制培培养养基基的的基基础础盐盐溶溶液液中中不不加加钙钙和和镁镁离离子子。间间歇歇或或连连续续更更换换部部分分培培养养液液，可可维维持持pH值值，若若使使用用HEPES缓缓冲冲盐溶液可不必连续通入含盐溶液可不必连续通入含5%CO2的空气。的空气。第十九页，讲稿共七十一页哦悬浮培养的反应器悬浮培养的反应器第二十页，讲稿共七十一页哦2、贴壁培养、贴壁培养 是是必必须须让让细细胞胞贴贴附附在在某某种种基基质质上上生生长长繁繁殖殖的的培培养养方方法法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。优点：优点：适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养缺缺点点：操操作作麻麻烦烦，需需要要合合适适的的贴贴附附材材料料和和足足够够的的面面积积，传传代代或或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。第二十一页，讲稿共七十一页哦3、贴壁、贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）悬浮培养（假悬浮培养）微载体培养微载体培养包埋和微囊培养包埋和微囊培养结团培养结团培养第二十二页，讲稿共七十一页哦（1）微载体培养）微载体培养 将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法，或浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法，或称微珠培养法。称微珠培养法。制备微载体的材料主要有：制备微载体的材料主要有：葡聚糖葡聚糖 明胶明胶 玻璃玻璃 纤维素纤维素等等第二十三页，讲稿共七十一页哦微载体培养的优点：微载体培养的优点：既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。第二十四页，讲稿共七十一页哦理想微载体需具备的条件理想微载体需具备的条件微载体表面性质与细胞有良好的微载体表面性质与细胞有良好的相容性相容性；微载体的材料无毒性；微载体的材料无毒性；微载体的材料是微载体的材料是惰性惰性材料；材料；材料比重为材料比重为1.030-1.045 g/ml；粒径粒径60-250 m（溶胀后），大小均一；（溶胀后），大小均一；具有好的光学透明性；具有好的光学透明性；基质的性质是软性的；基质的性质是软性的；可耐可耐120 高温，便于采用高压蒸汽灭菌高温，便于采用高压蒸汽灭菌原料充分，制作简便，价格低廉，可反复使用原料充分，制作简便，价格低廉，可反复使用第二十五页，讲稿共七十一页哦从从固固 体体 微微 载载 体体发发 展展 到到多多 孔孔 微微 载载 体体（porous microcarrier）或或多多孔孔微微球球：极极大大增增大大了了供供细细胞胞贴贴附附的的比表面积，同时适用于悬浮细胞的培养。比表面积，同时适用于悬浮细胞的培养。第二十六页，讲稿共七十一页哦（2）包埋和微囊培养）包埋和微囊培养包包埋埋法法：将将细细胞胞包包埋埋于于琼琼脂脂、琼琼脂脂糖糖、胶胶原原及及血血纤纤维维等海绵状基质中等海绵状基质中微微囊囊法法：由由包包埋埋法法衍衍生生而而来来，将将包包埋埋的的颗颗粒粒经经液液化化处处理而成为微囊理而成为微囊可可用用于于包包埋埋细细胞胞的的载载体体材材料料：人人工工合合成成的的高高分分子子聚聚合合物物（聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺、环环氧氧树树脂脂、聚聚氨氨基基甲甲酸酸酯酯、聚聚乙乙烯烯醇醇等等）、糖糖类类（如如纤纤维维素素、琼琼脂脂、琼琼脂脂糖糖、K-卡卡拉拉胶胶、海海藻藻酸酸钙钙、壳聚糖等壳聚糖等）、蛋白质蛋白质（如胶原、明胶、纤维蛋白等如胶原、明胶、纤维蛋白等）第二十七页，讲稿共七十一页哦包埋或微囊培养法的优点包埋或微囊培养法的优点包包埋埋或或包包裹裹在在载载体体或或微微囊囊内内的的细细胞胞可可获获得得保保护护，避避免免了剪切力的损害。了剪切力的损害。可以获得较高的细胞密度，一般都在可以获得较高的细胞密度，一般都在107-108 个个/ml以上。以上。当当控控制制微微囊囊膜膜的的孔孔径径后后，可可使使产产品品浓浓缩缩在在微微囊囊内内，从从而而有有利利于下游产物的纯化。于下游产物的纯化。可采用多种生物反应器进行大规模培养。可采用多种生物反应器进行大规模培养。第二十八页，讲稿共七十一页哦包埋或微囊培养培养装置包埋或微囊培养培养装置第二十九页，讲稿共七十一页哦中空纤维培养器优点中空纤维培养器优点第三十页，讲稿共七十一页哦（3）结团培养）结团培养利利用用细细胞胞本本身身作作为为基基质质，相相互互贴贴附附后后，再再用用悬悬浮浮的方法培养，可获得高密度的细胞。的方法培养，可获得高密度的细胞。优优 点点：操作简便，节省了用于微载体的成本。：操作简便，节省了用于微载体的成本。第三十一页，讲稿共七十一页哦二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式分批式操作分批式操作补料补料-分批（或流加式）操作分批（或流加式）操作（细菌生产中常用）（细菌生产中常用）半连续式操作半连续式操作连续式操作连续式操作（个别情况下用于悬浮细胞的培养）（个别情况下用于悬浮细胞的培养）灌流式操作灌流式操作第三十二页，讲稿共七十一页哦1、分批式操作、分批式操作A.将将细细胞胞和和培培养养基基一一次次性性加加入入反反应应器器内内进进行行培培养养，此此后后细细胞胞不不断断增增长长，产产物物不不断断形形成成和和积积累累，最最后后将将条条件件培培养养基基，即即经经培培养养已已含含有有细细胞胞产产物物的的培培养养基基，或或连连同同细细胞胞一一并并取出，培养结束。取出，培养结束。B.先先将将细细胞胞和和培培养养基基加加入入反反应应器器，待待细细胞胞生生长长至至一一定定密密度度后后，向向反反应应器器内内加加入入诱诱导导剂剂或或病病毒毒等等，经经一一段段时时间间作作用用后后，将将反应物取出。反应物取出。第三十三页，讲稿共七十一页哦2、半连续式操作、半连续式操作定定义义：当当细细胞胞和和培培养养基基一一起起加加入入反反应应器器后后，在在细细胞胞增增长长和和产产物物形形成成过过程程中中，每每间间隔隔一一段段时时间间，取取出出部部分分培培养养物物，或或单单纯纯是是条条件件培培养养基基，或或连连同同细细胞胞、载载体体一一起起，然然后后补补充充同同样样数数量量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。优优点点：操操作作简简便便，生生产产效效率率高高，可可长长期期进进行行生生产产，反反复复收收获获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。第三十四页，讲稿共七十一页哦3、灌流式操作、灌流式操作定义：定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。但细胞留在反应器内，使细胞处于断地补充新鲜培养基。但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。一种不断的营养状态。第三十五页，讲稿共七十一页哦细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，有害代谢废物浓度低；有害代谢废物浓度低；可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于有利于产品质量产品质量的提高；的提高；培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，生产生产成本成本明显降低。明显降低。灌流式操作的优点灌流式操作的优点第三十六页，讲稿共七十一页哦一、动物细胞生物反应器的类型一、动物细胞生物反应器的类型二、动物细胞生物反应器的检测控制系统二、动物细胞生物反应器的检测控制系统三、培养条件的控制三、培养条件的控制第七节第七节 动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器第三十七页，讲稿共七十一页哦生物反应器必备条件生物反应器必备条件制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性无毒性的的生物反应器的结构必须使之具有良好的生物反应器的结构必须使之具有良好的传质传质、传热传热和和混合混合的性能的性能密封性能密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染污染对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，能保持环境质量的均一控制的精确度高，能保持环境质量的均一第三十八页，讲稿共七十一页哦可长期连续运转可长期连续运转容容器器加加工工制制造造时时要要求求内内面面光光滑滑，无无死死角角，以以减减少少细细胞胞或或微生物的沉积微生物的沉积拆拆装装、连连接接和和清清洁洁方方便便，耐耐高高压压蒸蒸汽汽消消毒毒，便便于于操操作作维修维修设备成本尽可能低设备成本尽可能低生物反应器必备条件生物反应器必备条件第三十九页，讲稿共七十一页哦按规模大小可分为：按规模大小可分为：实验室规模：实验室规模：20L，用于培养工艺的研究，用于培养工艺的研究;中试规模：中试规模：20100L，提供一定量的产品，供纯，提供一定量的产品，供纯化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步的工艺优化实验的工艺优化实验;生产规模：生产规模：100L，用于生产，提供产品。，用于生产，提供产品。动物生物反应器动物生物反应器第四十页，讲稿共七十一页哦一、动物细胞生物反应器的类型一、动物细胞生物反应器的类型搅拌罐式生物反应器搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器气升式生物反应器透析袋或膜式生物反应器透析袋或膜式生物反应器中空纤维生物反应器中空纤维生物反应器固定床或流化床式生物反应器固定床或流化床式生物反应器CellGen plus生物反应器生物反应器第四十一页，讲稿共七十一页哦1、搅拌罐式生物反应器、搅拌罐式生物反应器第四十二页，讲稿共七十一页哦2、气升式生物反应器、气升式生物反应器第四十三页，讲稿共七十一页哦3、透析袋或膜式生物反应器、透析袋或膜式生物反应器第四十四页，讲稿共七十一页哦4、中空纤维式生物反应器、中空纤维式生物反应器第四十五页，讲稿共七十一页哦5、固定床或流化床式生物反应器、固定床或流化床式生物反应器第四十六页，讲稿共七十一页哦6、CellGen plus生物反应器生物反应器第四十七页，讲稿共七十一页哦二、动物细胞生物反应器的检测控制系统二、动物细胞生物反应器的检测控制系统培培养养过过程程中中需需检检测测的的物物化化参参数数：有有些些需需要要在在线线检检测测，如如温温度度、pH、搅搅拌拌速速度度、溶溶氧氧等等；有有些些则则需需要要取取样样离离线线检检测测，如如活活细细胞胞数数、氨氨基基酸酸浓浓度度分分析析、葡葡萄萄糖糖乳乳酸酸和和铵铵离离子子的的检检测测等等，有有些些则则需需在在检检测测后后计计算算后后才才能能获获得得，如如细细胞胞的的群群体体倍倍增增时时间间、细细胞胞的的比比增增长长率率、葡葡萄萄糖糖消消耗耗率率、乳乳酸酸产产率率、生物反应器生产率等。生物反应器生产率等。第四十八页，讲稿共七十一页哦 动动物物细细胞胞对对搅搅拌拌引引起起的的剪剪切切力力和和气气泡泡很很敏敏感感，要要保保持所需的溶氧很困难，常采用的措施有：持所需的溶氧很困难，常采用的措施有：改变进气的组成：不同比例的改变进气的组成：不同比例的O2、N2、CO2和空气和空气加大通气流量加大通气流量适当提高转速适当提高转速在反应器外通气在反应器外通气加入血红蛋白加入血红蛋白适当提高罐压适当提高罐压第四十九页，讲稿共七十一页哦三、培养条件控制三、培养条件控制动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止污动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止污染，除反应器密封性能良好外，还需添加染，除反应器密封性能良好外，还需添加抗生素抗生素，培养过，培养过程还要求培养器、管道及接头处所用材质不可释放出对细程还要求培养器、管道及接头处所用材质不可释放出对细胞有毒害的物质。胞有毒害的物质。在分批培养时，随细胞生长，营养消耗，必然产生乳酸等在分批培养时，随细胞生长，营养消耗，必然产生乳酸等代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需要代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需要更换培养液更换培养液或或移植继代培养。移植继代培养。第五十页，讲稿共七十一页哦动动物物细细胞胞培培养养过过程程亦亦应应控控制制一一定定的的环环境境条条件件，如如培培养养温温度度、溶解氧、溶解氧、pH、罐压及搅拌速度。、罐压及搅拌速度。动动物物细细胞胞对对环环境境变变化化适适应应能能力力较较微微生生物物细细胞胞小小得得多多，故故条条件件控控制制精精密密度度要要求求更更高高。其其中中特特别别重重要要的的是是溶溶解解氧氧和和pH的的控制控制第五十一页，讲稿共七十一页哦Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺细胞和狂犬病毒的培养工艺第五十二页，讲稿共七十一页哦一、动物细胞产品常用的纯化方法一、动物细胞产品常用的纯化方法二、动物细胞产品的质量要求二、动物细胞产品的质量要求第八节第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求动物细胞产品的纯化方法和质量要求第五十三页，讲稿共七十一页哦下游纯化工作费钱、难度大下游纯化工作费钱、难度大成分复杂：成分复杂：工程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、工程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化性质常常和目的产物非常相似，因此很难将他们分离开性质常常和目的产物非常相似，因此很难将他们分离开作用于人体的药物纯度要求高：作用于人体的药物纯度要求高：由于产品多数用于人体，由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高第五十四页，讲稿共七十一页哦大大多多数数动动物物细细胞胞表表达达的的产产物物产产量量低低，生生物物活活性性不不稳稳定定，因因此此要要求求纯纯化化过过程程中中所所有有的的操操作作都都应应该该非非常常温温和和、精精细细，包包括括溶溶液液的的温温度度、pH和和盐盐离离子子强强度度等等都都需需要要严严格格控控制制，要要有有相相当当精密的设备和检测仪器。精密的设备和检测仪器。由由于于细细胞胞产产品品多多种种多多样样，它它们们的的氨氨基基酸酸组组成成、结结构构、相相对对分分子子质质量量大大小小和和等等电电点点等等都都不不尽尽相相同同，因因此此分分离离纯纯化化技技术术的的通通用用性性差差，必必须须根根据据每每一一种种产产品品的的特特点点研研究究开开发发出出适适合合于该产品的专用的分离纯化技术。于该产品的专用的分离纯化技术。第五十五页，讲稿共七十一页哦一、动物细胞产品常用的纯化方法一、动物细胞产品常用的纯化方法离心（低温离心）离心（低温离心）离子交换层析离子交换层析凝胶层析凝胶层析亲和层析亲和层析盐析和有机溶剂沉淀盐析和有机溶剂沉淀透析透析高压液相层析高压液相层析第五十六页，讲稿共七十一页哦盐析和有机溶剂沉淀盐析和有机溶剂沉淀盐盐析析：溶溶液液中中加加入入无无机机盐盐类类，破破坏坏蛋蛋白白质质分分子子周周围围的的水水化化膜膜，使使蛋蛋白白质质溶溶解解度度降降低低而而析析出出。最最常常用用的的中中性性盐盐有有硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠和和氯氯化化钠钠等等。调调节节盐盐浓浓度度和和pH常常同同时时使使用用。盐析时蛋白不易变性，结束后需要进行透析、超滤脱盐。盐析时蛋白不易变性，结束后需要进行透析、超滤脱盐。有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀：加加入入与与水水可可混混溶溶的的有有机机溶溶剂剂，如如乙乙醇醇、甲甲醇醇、丙丙酮酮等等，也也可可使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀。为为了了避避免免蛋蛋白白质质变变性性必必须须在在低低温下操作。温下操作。第五十七页，讲稿共七十一页哦透透 析析原原理理：蛋蛋白白质质分分子子较较大大，不不能能通通过过半半透透膜膜，可可以以据据此此将将蛋白质与相对分子质量较小的杂质分开。蛋白质与相对分子质量较小的杂质分开。第五十八页，讲稿共七十一页哦高压液相层析（高压液相层析（HPLC，high-pressure liquid chromatography）使使用用颗颗粒粒极极细细的的介介质质，在在高高压压下下分分离离蛋蛋白白质质或或其其他他分分子混合物的层析技术。子混合物的层析技术。柱柱效效比比经经典典柱柱色色谱谱柱柱高高。在在色色谱谱柱柱出出口口处处常常常常配配以以高高灵灵敏敏度度的的监监测测器器，以以及及自自动动描描记记、分分布布收收集集的的装装置置，并并用用计计算算机进行色谱条件的设定及数据处理。机进行色谱条件的设定及数据处理。第五十九页，讲稿共七十一页哦二、动物细胞产品的质量要求二、动物细胞产品的质量要求对工程细胞的要求：对工程细胞的要求：有细胞系的历史资料有细胞系的历史资料有细胞特性的资料有细胞特性的资料无无细细菌菌、真真菌菌、支支原原体体和和各各种种病病毒毒，包包括括反反转转录录病病毒毒等等外外来有害因子的污染来有害因子的污染第六十页，讲稿共七十一页哦生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求：生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求：对生产厂房、原材料和试剂的要求对生产厂房、原材料和试剂的要求对细胞培养的要求对细胞培养的要求对纯化过程的要求对纯化过程的要求第六十一页，讲稿共七十一页哦产品纯度产品纯度产品生物活性产品生物活性产品比活性：每毫克蛋白质中含有多少单位生物学活性产品比活性：每毫克蛋白质中含有多少单位生物学活性（U/mg）产品蛋白质性质的鉴定产品蛋白质性质的鉴定产品中杂质的检测产品中杂质的检测产品的稳定性产品的稳定性产品临床前的安全性和有效性评价产品临床前的安全性和有效性评价产品临床试验的安全性和有效性评价产品临床试验的安全性和有效性评价对产品的质量要求：对产品的质量要求：第六十二页，讲稿共七十一页哦一、改进表达载体，提高表达水平和产量一、改进表达载体，提高表达水平和产量二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本三、抑制细胞凋亡，延长培养周期三、抑制细胞凋亡，延长培养周期四、采用糖基化工程，提高产品质量四、采用糖基化工程，提高产品质量五、转基因动物的研究五、转基因动物的研究六、组织工程的研究六、组织工程的研究第九节第九节 动物细胞制药的前景与展望动物细胞制药的前景与展望第六十三页，讲稿共七十一页哦一、改进表达载体，提高表达水平和产量一、改进表达载体，提高表达水平和产量采用更强的启动子和增强子采用更强的启动子和增强子更好的利用扩增系统或寻找高表达位点更好的利用扩增系统或寻找高表达位点采用和改造更好的宿主细胞采用和改造更好的宿主细胞第六十四页，讲稿共七十一页哦二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本采用代谢工程改造工程细胞采用代谢工程改造工程细胞 代谢工程代谢工程，即采用基因工程的手段，使工程细胞增加或，即采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需要，减少某些代谢产物的产生和危害，以及控制养物质的需要，减少某些代谢产物的产生和危害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。改进培养工艺，降低生产成本改进培养工艺，降低生产成本 优化培养工艺优化培养工艺第六十五页，讲稿共七十一页哦三、抑制细胞凋亡，延长培养周期三、抑制细胞凋亡，延长培养周期细胞凋亡细胞凋亡：一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡：一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡防止细胞培养过程中细胞凋亡的三种措施：防止细胞培养过程中细胞凋亡的三种措施：通过培养基通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；用化学添加剂如用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程；抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程；采用抗细胞凋亡基因改采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞造工程细胞第六十六页，讲稿共七十一页哦四、采用糖基化工程，提高产品质量四、采用糖基化工程，提高产品质量蛋白质有两种糖基化方式：蛋白质有两种糖基化方式：N-糖基化和糖基化和O-糖基化。糖基化。O-糖糖链对蛋白质特性影响不大，链对蛋白质特性影响不大，N-糖链的不同对产品可产生糖链的不同对产品可产生较大的影响。较大的影响。糖基化工程：糖基化工程：用基因工程的手段，人为的改变肽链结构、用基因工程的手段，人为的改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的。正确糖基化的目的。第六十七页，讲稿共七十一页哦五、转基因动物的研究五、转基因动物的研究1982年年Palimiter等首次提出用转基因动物来生产药用蛋白。等首次提出用转基因动物来生产药用蛋白。现有现有1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶抗胰蛋白酶、抗凝血酶和蛋白和蛋白C等多种产品。等多种产品。优点：优点：质量高、成本低、产品质量基本上与天然的一样质量高、成本低、产品质量基本上与天然的一样第六十八页，讲稿共七十一页哦六、组织工程的研究六、组织工程的研究组组织织工工程程：通通过过对对细细胞胞的的大大量量培培养养，并并用用细细胞胞直直接接作作为为一一种种治治疗疗手手段段用用于于临临床床，或或用用培培养养的的细细胞胞进进一一步步加加工工构构成成一一种种组组织织，如如人人造造皮皮肤肤、人人造造肝肝脏脏、人人造造胰胰腺腺、人造血管和人造骨等，并用于临床治疗。人造血管和人造骨等，并用于临床治疗。第六十九页，讲稿共七十一页哦思思 考考 题题1.动物细胞的生理特点动物细胞的生理特点2.动物细胞大规模培养的方法动物细胞大规模培养的方法3.微载体需具备哪些条件？微载体需具备哪些条件？4.动物细胞培养的操作方式动物细胞培养的操作方式5.动物细胞生物反应器的类型动物细胞生物反应器的类型第七十页，讲稿共七十一页哦感谢大家观看9/27/2022第七十一页，讲稿共七十一页哦