学习情境有机酸柠檬酸.ppt

学习情境有机酸柠檬酸现在学习的是第1页，共107页柠檬酸柠檬酸n柠檬酸(Citricacid)分子式为C6H8O7。外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，具有令人愉快的强烈的酸味，相对密度为1.6550。n柠檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等有机溶剂。商品柠檬酸主要是无水柠檬酸和一水柠檬酸，前者在高于36.6的水溶液中结晶析出，后者在低于36.6水溶液中结晶析出。它天然存在于果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。n柠檬酸是生物体主要代谢产物之一。现在学习的是第2页，共107页n柠檬酸柠檬酸17841784年由年由ScheelsScheels氏发现氏发现n18931893年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸n18931893年德国微生物学家年德国微生物学家WehmerWehmer发现二种青霉菌可以生成柠檬酸发现二种青霉菌可以生成柠檬酸n19171917年年CurrieCurrie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸n19231923年年美美国国科科学学家家研研究究成成功功了了以以废废糖糖蜜蜜为为原原料料的的浅浅盘盘法法柠柠檬檬酸酸发发酵酵，并在比利时设厂生产。并在比利时设厂生产。n19381938年年PerquinPerquin和和19421942年年KarrowKarrow进行了柠檬酸的深层发酵研究进行了柠檬酸的深层发酵研究 n19511951年年美美国国MilesMiles公公司司首首先先以以淀淀粉粉质质为为原原料料，经经水水解解后后深深层层发发酵酵大大规规模模生产柠檬酸。生产柠檬酸。柠檬酸柠檬酸现在学习的是第3页，共107页柠檬酸柠檬酸n我国1953年刚开始也是采用浅盘法发酵生产柠檬酸，n1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，各地陆续办厂投产，至20世纪70年代中期，柠檬酸工业已初步形成了生产体系。现在学习的是第4页，共107页n我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也是处于世界领先水平，并远远领先于其他国家，其优势优势在于：n1.我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，当淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需要将淀粉水解成葡萄糖，简化了生产工艺，降低了生产成本。n2.尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有64小时，生产周期比国外要短。n3.柠檬酸的产酸速度大大地高于国外水平。平均产酸速率是国外的2倍。现在学习的是第5页，共107页n柠檬酸是目前世界上以生物化学方法生产，产量最大的有机酸。n我国是一个柠檬酸的生产大国，1995年的产量为16万吨，1999年底达到20万吨，其中80以上都出口国外，在国际市场上占有重要地位。现在学习的是第6页，共107页n2000年的产量达到36.9万吨，柠檬酸及柠檬酸盐出口量为25.8万吨，分别比1999年增长了36.4%和23.3%，为历史最高水平。n2001年世界柠檬酸消费量(不含中国)已经升至近200万吨，年递增率约5%，我国柠檬酸产量约为35万吨，柠檬酸及柠檬酸盐出口量为27.8万吨。n2002年我国柠檬酸产量突破了40万吨，达到了40.2万吨，而柠檬酸及柠檬酸盐出口基本与2001年持平，为28.3万吨。现在学习的是第7页，共107页柠檬酸的消费领域：n 饮料行业占4045n 食品添加剂等占1520n 洗涤剂占2030n 医药占5n 其它占10 2004年全球柠檬酸产量约120万吨，欧盟和美国为最大消费市场。现在学习的是第8页，共107页n 欧洲是柠檬酸的第二大生产地，产量约30万吨n 美国柠檬酸年产量约25万吨n 我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约50万吨 但在1970年时，我国的柠檬酸年产仅有130吨现在学习的是第9页，共107页我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望 n我国于五十年代初期开始柠檬酸浅盘发酵研究，n1968年轻工业部发酵研究所与黑龙江和平糖厂合作，首先完成了甜菜糖蜜浅盘表面发酵并投入工业化生产。n1965年，上海市工业微生物研究所筛选出N558菌种，并与天津工业微生物研究所，南通发酵厂等合作，使之用于工业化生产，并在全国推广，形成我国独特的薯干直接深层发酵法生产柠檬酸。现在学习的是第10页，共107页我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望 n从七十年代到九十年代，我国一直致力于柠檬酸生产菌种的改进，n1990年，上海市工业微生物研究所完成国家七五攻关项目筛选出860菌种，发酵产酸达20，n上海市工业微生物研究所开始以薯渣为主原料，以黑曲霉为菌种，固体发酵法生产柠檬酸钙的研究。并于1977年中试成功并投入生产，现在全国已有四十余个工厂，采用固体发酵法由薯渣生产柠檬酸及柠檬酸钙产品。现在学习的是第11页，共107页n我国以石油原料发酵柠檬酸开始于1970年，先后在天津、上海、沈阳等地进行研究，并一度投入小规模试验生产，是用正烷烃为原料，以解脂假丝酵母为菌种，发酵产酸达13以上，转化率140以上，但因柠檬酸只占总酸的50%（另一半为异柠檬酸）而且由于成本较高及石油原料紧缺和食用安全性等原因，未能坚持研究和生产。现在学习的是第12页，共107页n我国的发酵技木及生产水平，特别是菌种及发酵工艺均为世界领先水平。n薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直接深层发酵技术为我国所独有。n国外发酵罐容积通常在200m3,并较早实现自动控制；我国的最大柠檬酸发酵罐为150m3现在学习的是第13页，共107页一、柠檬酸在食品中的应用 1)饮料与冰淇淋n柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料n柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。现在学习的是第14页，共107页2)果酱与酿造酒n柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。n当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。现在学习的是第15页，共107页n3)腌制品 各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧化。n4)罐头食品 加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合金属离子的作用，保护其中的抗坏血酸，使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。现在学习的是第16页，共107页n5)豆制品及调味品 用含有柠檬酸的水浸渍大豆，可以脱腥并便于后续加工。柠檬酸可以用于大豆等豆类蛋白、葵花子蛋白的水解，生产出风味别致的调味品。它也可以用于成熟调味品（酱油等）的调味。n6)其它 柠檬酸在医药、化学等其它工业中也有一定的作用。柠檬酸铁胺可以用作补血剂；柠檬酸钠可用作输血剂；柠檬酸可制造食品包装用薄膜及无公害洗涤剂。现在学习的是第17页，共107页二、柠檬酸发酵微生物n1)黑曲霉（Aspergillusniger）的形态特征 目前生产上常用产酸能力强的黑曲霉作为生产菌。n在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。现在学习的是第18页，共107页二、柠檬酸发酵微生物n2)黑曲霉（Aspergillusniger）的生理特征n黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。n黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般为pH37；产酸最适pH为1.82.5。生长最适温度为3337，产酸最适温度在2837，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在麦芽汁4Be左右的培养基上。现在学习的是第19页，共107页二、柠檬酸发酵微生物n黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能利用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。现在学习的是第20页，共107页二、柠檬酸发酵微生物n黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。现在学习的是第21页，共107页三、柠檬酸发酵机理n关于柠檬酸发酵的机制有多种理论，目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。n糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸。现在学习的是第22页，共107页柠檬酸的溢出代谢柠檬酸的溢出代谢：多种微生物均能因受刺激而过量合成柠檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。引起溢出代谢的原因原因包括以下三个方面三个方面：现在学习的是第23页，共107页高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由3个因素构成。第一:是在有高浓度草酰乙酸（OAA）的情况下对 AcCoA 具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（CS）的存在；第二:是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在；现在学习的是第24页，共107页第三:是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。现在学习的是第25页，共107页较低的降解柠檬酸的能力。这能力由两个因素构成。第一是低水平的-酮戊二酸脱氢酶（KD）影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压；第二，在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和 异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、异柠檬酸和-酮戊二酸）更明显。现在学习的是第26页，共107页 在柠檬酸过量合成阶段，培养基的 pH 值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的 pH值。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。现在学习的是第27页，共107页黑黑曲曲霉霉中中柠柠檬檬酸酸的的代代谢谢溢溢出出GG-6-P(磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶)柠檬酸柠檬酸,NH4I+A1.6二磷酸果糖丙酮酸草酰乙酸草酰乙酸乙酰CoA柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸(丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶)(柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶)-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶现在学习的是第28页，共107页TCA循环在柠檬酸积累中的调节n1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；n2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱;n3)TCA循环的阻断或微弱(即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶活力降低)，导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。现在学习的是第29页，共107页回补途径回补途径TCA循环重要功能除产能外，为一些氨基酸和其循环重要功能除产能外，为一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中间产物；它化合物的合成提供了中间产物；生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循环就会中断；环就会中断；回补方式：回补方式：通过某些化合物的通过某些化合物的CO2固定作用，固定作用，一些转氨基酶所催化的反应也能合成一些转氨基酶所催化的反应也能合成草酰乙酸和草酰乙酸和-酮戊二酸，酮戊二酸，通过乙醛酸循环通过乙醛酸循环现在学习的是第30页，共107页通过某些化合物的通过某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循环的中间产固定作用使三羧酸循环的中间产物得到回补：物得到回补：丙酮酸羧化酶：丙酮酸羧化酶：CO2+丙酮酸丙酮酸+ATP+H2O Mg+草酰乙酸草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:CO2+PEP+H2O 草酰乙酸草酰乙酸+H3PO4苹果酸酶苹果酸酶:CO2+丙酮酸丙酮酸+NADPH+H+苹果酸苹果酸+NADP+为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，异养微生物异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。至少要具备上述几种酶之种的一个酶。CO2固定作用补充TCA环的中间产物现在学习的是第31页，共107页现在学习的是第32页，共107页转氨基作用转氨基作用n定义：定义：-氨基酸的氨基通过酶的催化,转移到-酮酸的酮基上,生成相应的氨基酸;原来的-氨基酸则转变成相应的-酮酸。R1CHNH2 +COOHR2 C=O COOHR1 C=O +COOHR2 CHNH2 COOH转氨酶转氨酶现在学习的是第33页，共107页转氨基作用几点说明：转氨基作用几点说明：（1）可逆反应，）可逆反应，（2）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（3）重要的转氨酶：）重要的转氨酶：丙氨酸转移酶（丙氨酸转移酶（ALT）/谷丙转氨酶（谷丙转氨酶（GPT）天冬氨酸转移酶（天冬氨酸转移酶（AST）/谷草转氨酶谷草转氨酶(GOT)ALT常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、AST用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）现在学习的是第34页，共107页 CH3 H-C-NH2 +COOH COOH （CH2）2 C=O COOH 丙氨酸丙氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸 谷氨酸谷氨酸ALT：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清谷丙转氨酶，急性肝炎时血清ALT 活性显著增高。活性显著增高。ALT CH3 C=O +COOH COOH （CH2）2 H-C-NH2 COOH现在学习的是第35页，共107页 COOH CH2 +H-C-NH2 COOH COOH （CH2）2 C=O COOHAST 天冬氨酸天冬氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸 谷氨酸谷氨酸AST：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高.COOH CH2 +C=O COOH COOH （CH2）2 H-C-NH2 COOH现在学习的是第36页，共107页乙醛酸循环乙醛酸循环草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸琥珀酸琥珀酸异柠檬酸异柠檬酸苹果酸苹果酸延胡索酸延胡索酸乙醛酸乙醛酸乙酰乙酰CoA乙酰乙酰CoA乙酸乙酸乙酸乙酸现在学习的是第37页，共107页乙醛酸循环乙醛酸循环能够利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶，它使乙酸转变为乙酰CoA；然后在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶的作用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环的主要反应乙醛酸循环的主要反应：异柠檬酸异柠檬酸 琥珀酸琥珀酸+乙醛酸乙醛酸 乙醛酸乙醛酸+乙酸乙酸 苹果酸苹果酸 琥珀酸琥珀酸+乙酸乙酸 异柠檬酸异柠檬酸 净反应：净反应：2乙酸乙酸 苹果酸苹果酸现在学习的是第38页，共107页柠檬酸发酵机理n柠檬酸的发酵机理可概括为：大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使通过糖酵解途径的代谢得到加强葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。现在学习的是第39页，共107页葡萄糖葡萄糖 丙丙酮酮酸酸+丙丙酮酮酸酸 乙乙酰辅酰辅酶酶A(CH3CO-CoA)CO2固定反固定反应应+草酰乙酸草酰乙酸顺乌头酸酶顺乌头酸酶柠檬酸柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸KGA（柠檬酸合成酶）（柠檬酸合成酶）柠檬酸发酵机理柠檬酸发酵机理n按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入并不能够积累柠檬酸，而是进入TCATCA循环，被循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶 的活性丧失的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。成其他物质。现在学习的是第40页，共107页柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制追求柠檬酸的高产率 n柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？现在学习的是第41页，共107页1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节n从葡萄糖柠檬酸的合成过程中，PFK 是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，n研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+浓度是如何升高的呢？在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是 还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。现在学习的是第42页，共107页1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节n 研究表明，柠檬酸产生菌黑曲霉如果生长在Mn+缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。现在学习的是第43页，共107页Mn+缺乏如何会使缺乏如何会使NH4+浓度升高呢浓度升高呢？n当培养基中Mn+缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高，微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：氨基酸氨基酸 合成合成 蛋白蛋白质质 分解分解 氨基酸氨基酸氨基化合成氨基酸氨基化合成氨基酸现在学习的是第44页，共107页2.顺乌头酸酶活性的控制n该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+的影响，控制培养基中的Fe2+的浓度，可以使该酶失活。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢反应器，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度有要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。现在学习的是第45页，共107页n顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养基上的低。添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以握高柠檬酸产率。现在学习的是第46页，共107页n那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题：，是不是就意味着可以将葡萄是不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢糖源源不断的转化成柠檬酸呢？n提问：根据微生物代谢调节的基本理论，还需要解决什么问题？现在学习的是第47页，共107页n菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？3.能荷能荷调节对柠檬酸发酵的影响现在学习的是第48页，共107页n如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。现在学习的是第49页，共107页n柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。n为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。现在学习的是第50页，共107页解偶联剂（解偶联剂（uncoupleruncoupler）?n使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对H H+的通透性，消除的通透性，消除H H+梯度，因而无梯度，因而无ATPATP生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白(uncoupling proteins(uncoupling proteins，UCPs)UCPs)，与维持体温有关。常用解偶联，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：剂主要有：n质子载体：质子载体：2 2，4-4-二硝基酚二硝基酚(DNP(DNP，图，图)，羰基，羰基-氰氰-对对-三氟甲氧基三氟甲氧基苯肼苯肼(FCCP)(FCCP)。n质子通道：增温素（质子通道：增温素（thermogeninthermogenin）。）。n其它离子载体：如缬氨霉素。其它离子载体：如缬氨霉素。n某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。温升高。现在学习的是第51页，共107页n实验证明，在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间（20分钟），则这一侧系呼吸链不可逆的失活不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。n标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统）。现在学习的是第52页，共107页n 理论可以指导实践，反过来，通过实践可以理论可以指导实践，反过来，通过实践可以推动理论研究，丰富理论研究成果。推动理论研究，丰富理论研究成果。科学研科学研究过程中的许多基本规律是相同的，今天，究过程中的许多基本规律是相同的，今天，我们在大学的学习，更多的是学习一种方法我们在大学的学习，更多的是学习一种方法或者说一种思维。通过这个例子，我们可以或者说一种思维。通过这个例子，我们可以学习到许多专业以外的知识学习到许多专业以外的知识首先为了首先为了解释一种客观想象，提出一种假设，然解释一种客观想象，提出一种假设，然后通过实验来证明这种假设后通过实验来证明这种假设现在学习的是第53页，共107页能量平衡EMP中底物水平磷酸化2ATPEMP途径2NADH丙酮酸氧化脱羧2NADH可以满足生产菌的维持能量消耗，不需要消耗C源经TCA来产能现在学习的是第54页，共107页CO2固定反应 n通过 CO2固定反应提供C4二羧酸 n（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2=草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶n（2）丙酮酸+CO2 =草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶n 以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。现在学习的是第55页，共107页柠檬酸发酵中，三个控制点柠檬酸发酵中，三个控制点 C6H12O6控制Mn+NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制（1）点：EMP畅通无阻控制溶氧，防止侧系呼吸链失活丙酮酸+丙酮酸（2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸乙酰辅酶A+C4二羧酸柠檬酸（3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+的浓度柠檬酸发酵中，三个控制点柠檬酸发酵中，三个控制点现在学习的是第56页，共107页第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）柠檬酸和ATP对该酶有抑制 生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量 Mn2+的影响：Mn2+缺乏菌体的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶的抑制现在学习的是第57页，共107页第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应第三个调节点：TCA环上调节柠檬酸合成酶：许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活TCA环阻断积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸现在学习的是第58页，共107页n为什么在A.nigar中异柠檬酸不会进一步分解及柠檬酸的积累机制？n黑曲霉乌头酸水合酶存在于线粒体中，它催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸=90：7：3的平衡关系；n黑曲霉对辅酶NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种依赖于辅酶NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与存在于线粒体的酶及TCA循环有关，它们受到生理浓度柠檬酸的抑制。现在学习的是第59页，共107页柠檬酸生物合成途径现在学习的是第60页，共107页柠檬酸的积累机制总结n1)由于Mn2缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；n2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。现在学习的是第61页，共107页柠檬酸的积累机制总结n3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸9037；n4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累；n5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累；n6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。现在学习的是第62页，共107页柠檬酸积累的理想条件：柠檬酸积累的理想条件：1 1、提高磷酸果糖激酶的活性、提高磷酸果糖激酶的活性2 2、提高丙酮酸羧化酶的活性、提高丙酮酸羧化酶的活性3 3、提高柠檬酸合成酶的活性、提高柠檬酸合成酶的活性4 4、抑制顺乌头酸酶的活性、抑制顺乌头酸酶的活性5 5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性6 6、抑制、抑制-酮戊二酸脱氢酶的活性酮戊二酸脱氢酶的活性7 7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性、抑制异柠檬酸裂解酶的活性现在学习的是第63页，共107页柠檬酸发酵需要下述柠檬酸发酵需要下述环境条件环境条件n(1)磷酸盐浓度低；n(2)氮源用NH4+盐；n(3)pH值低（3.0）；n(4)溶氧量高；n(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。现在学习的是第64页，共107页柠檬酸发酵的产率 n 1.无CO2固定反应的产率 192/(1801.5)=71.1%n 2.通过 CO2固定反应提供C4二羧酸（无碳原子损失）192/180=106.6%C6H12O6 C6H8O7 (C没有增加)可见，CO2固定反应与柠檬酸发酵的重要性 C6H8O7 H2O理论转化率：116.7%现在学习的是第65页，共107页柠檬酸发酵柠檬酸发酵一、一、菌种菌种：产生柠檬酸的菌种很多，以：产生柠檬酸的菌种很多，以霉菌霉菌为主，为主，又以又以黑曲霉黑曲霉产生柠檬酸的能力较强，并能利用多种产生柠檬酸的能力较强，并能利用多种碳源，故常是生产上使用的菌种。碳源，故常是生产上使用的菌种。二、发酵二、发酵机理机理：细胞内有三羧酸循环和乙醛酸循：细胞内有三羧酸循环和乙醛酸循环；柠檬酸合成酶活力较高，而乌头酸酶或异环；柠檬酸合成酶活力较高，而乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶可被某些因素，如金属离子的缺柠檬酸脱氢酶可被某些因素，如金属离子的缺乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。现在学习的是第66页，共107页柠檬酸发酵柠檬酸发酵三、三、工艺流程工艺流程：发酵液的发酵液的pHpH值值对柠檬酸生成影响很大；对柠檬酸生成影响很大；pH23pH23时，发酵产物主要是柠檬酸；时，发酵产物主要是柠檬酸；pHpH值中性或碱性时，值中性或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸；会产生较多草酸和葡萄糖酸；可往培养基中加入可往培养基中加入亚铁氰化钾亚铁氰化钾或采取或采取育种育种手手段段改造菌种改造菌种，使，使乌头酸酶乌头酸酶或或异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶缺失或缺失或尽量降低活性，以尽量降低活性，以阻碍阻碍TCATCA循环循环的正常进行，从而的正常进行，从而增加柠檬酸的积累。增加柠檬酸的积累。现在学习的是第67页，共107页四、柠檬酸发酵用原料n柠檬酸发酵的原料有三大类1.糖质原料(甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜)、2.淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、木薯等)3.正烷烃类原料。现在学习的是第68页，共107页营养物浓度对发酵的影响n对生成量和组成都有影响n黑曲霉柠檬酸发酵n蔗糖浓度15%18%，蔗糖同化率97%n蔗糖浓度20%，只同化92%n蔗糖浓度低于10%，产柠檬酸少，积累草酸n蔗糖浓度低于2.5%，不产柠檬酸现在学习的是第69页，共107页五、柠檬酸发酵工艺 1)试管斜面菌种培养n察氏琼脂培养基：NaNO33g，蔗糖20g，K2HPO41g，KCl0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，用水定溶至1000ml，pH自然。察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g，NaNO32g，MgSO4.7H2O0.5g，KH2PO41g，KCl0.5g，FeSO4.7H2O0.01g，溴甲分绿0.4g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH自然。现在学习的是第70页，共107页1)试管斜面菌种培养 蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g，NH4NO32g，KH2PO42g，MgSO4.7H2O0.25g，FeCl3.6H2O0.02g，MnSO4.4H2O0.02g，麦芽汁20ml，琼脂20g，用水定溶至1000ml。米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水，于55保温糖化34小时后煮沸，滤液用水调整浓度至10Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32培养45d。现在学习的是第71页，共107页2)种子扩大培养 二级扩大培养na培养基 有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成如下：麦芽汁7BX，氯化铵2%，尿素0.1%，现在学习的是第72页，共107页2)种子扩大培养 二级扩大培养nb培养 固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面至37下培养24h。确认无杂菌污染即可使用。液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌操作接种。培养温度32。液体表面需710d，琼脂固体培养需67d。现在学习的是第73页，共107页三级扩大培养n可采用麸曲固体培养、液体表面培养或琼脂固体培养。所用培养基如下：na麸曲培养基：新鲜小麦麸皮1kg，加水1.11.3L。液体培养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相同。nb琼脂固体培养基：与斜面培养基相同。现在学习的是第74页，共107页n现代工业化大生产主要采用深层通风发酵法。n日本约15的柠檬酸产品是利用固态发酵法生产的，n浅盘发酵法在前苏联、印度、捷克波兰、保加利亚、阿根廷等国家主要使用，n我国、美国及西欧共同体国家则主要采用液体深层发酵法进行生产 现在学习的是第75页，共107页3 3）发酵生产发酵生产 工艺流程工艺流程现在学习的是第76页，共107页n以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程：斜面菌种斜面菌种麸曲瓶麸曲瓶种子种子 薯干粉薯干粉调浆调浆灭菌灭菌(间歇或连续式间歇或连续式)冷却冷却发酵发酵发酵液发酵液提取提取成品成品 无菌空气无菌空气n薯渣为原料的固体发酵工艺流程薯渣为原料的固体发酵工艺流程：试管斜面试管斜面三角瓶菌种三角瓶菌种种曲种曲 薯渣薯渣粉碎粉碎蒸煮蒸煮摊凉接种摊凉接种装盘装盘发酵发酵出曲出曲提取提取成品成品 米糠米糠 3 3）发酵生产发酵生产 工艺流程工艺流程现在学习的是第77页，共107页 柠檬酸的深层液体发酵工艺薯干原料柠檬酸深层发酵工艺米曲汁斜面米曲汁斜面 茄子瓶茄子瓶种子罐菌丝培养（也可以孢子接种）种子罐菌丝培养（也可以孢子接种）发酵培养（发酵培养（3232，5 55.55.5天）天）成熟的发酵液成熟的发酵液（或（或10102020 麦芽汁麦芽汁 0.1%KH0.1%KH2 2POPO4 4）1616的薯干粉，的薯干粉，-淀粉酶液化淀粉酶液化现在学习的是第78页，共107页液体发酵 a 不置换法n培养液一次加入，发酵结束后弃去菌盖，发酵液用来提取柠檬酸。现在学习的是第79页，共107页n具体操作：接种后，培养温度维持在35，这是黑曲霉的适宜生长温度，需维持72h左右，以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通人约50的空气以维持35的培养温度，通风量为35m3/m2.h。接种后20h左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。n48h起由于菌体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽，进汽温度为40左右，风量为7m3/m2.h，进汽湿度为75%以上，以防培养液水分蒸发过快。现在学习的是第80页，共107页n接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高，耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热，最高时可达1000kJ/(m2.h)，此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在2628，以利柠檬酸的形成。n因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量至1518m3/m2.h，且降低进汽温度在25以下，湿度仍在75%以上。160h以后发酵结束。现在学习的是第81页，共107页b置换法n置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取柠檬酸。现在学习的是第82页，共107页n培养菌盖，一般使用5%的糖液，视糖蜜质量再补充少量NH4NO3、K2HPO4等盐类。接种孢子后，室温保持在3436，培养液品温为3234，使孢子发芽，正常情况下40h即可形成紧密有皱的菌盖。菌盖形成后，放掉培养基，更换发酵培养基(即第1次置换)，并将室温降至3032，待发酵48